CC BY
28
I 1-2006
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
КОНЪЮГАЦИОННАЯ ПЕРЕДАЧА ПЛАЗМИД P1 ГРУППЫ НЕСОВМЕСТИМОСТИ В BURKHOLDERIA CEPACIA
М.В. Морозова, Л.К. Меринова, И.К. Сеимова, Д.В. Викторов
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Burkholderia cepacia - микроорганизм, широко распространенный во внешней среде и вызывающий различную патологию у высших растений [6, 7]. В последнее время этот бактериальный вид все чаще упоминается среди оппортунистических патогенов человека, вызывающих тяжелые инфекции у больных с различными иммунодефицитными состояниями [3, 4, 5, 7]. Способность этих высокорезистентных к антимикробным веществам бактерий размножаться в растворах антисептиков представляет серьезную опасность как фактор распространения внутрибольничных инфекций [7, 11, 14].
Являясь типовым видом нового рода Burkholderia [15], B. cepacia отличается существенной гетерогенностью изолятов, выделенных в различных экологических нишах [5, 14]. Ранее было продемонстрировано, что штаммы B. cepacia следует разделять как минимум на пять различных "геномных видов" или геномоваров, составляющих "комплекс B. cepacia" [7, 13]. Для микроорганизма характерна чрезвычайная пластичность адаптационных реакций, обусловленных специфической структурой генома - наличием нескольких хромосомных репли-конов, а также собственных плазмид и фагов [3, 4, 10, 14].
Необходимым элементом исследования B. cepacia является разработка систем генетического анализа. Конъюгация может служить эффективным методом изучения генома этого микроорганизма. К перспективным факторам конъюгационного переноса необходимо отнести, прежде всего, плазмиды Р1 группы несовместимости, на основе которых осуществляется конъюгация у многих видов бактерий. В группу R-плазмид этого типа, помимо общеизвестной RP4, входят родственные ей плазмиды RP1, R68, RK2, R18. Данные плазмиды детерминируют резистентность к карбенициллину, канамицину, тетрациклину [12]. Важно, что в составе плазмид Р1 группы нередко находятся мобильные генетические элементы - транспозоны и IS-последовательности, способные к перемещению в пределах отдельных реплико-нов или между различными репликонами. Использование Tn-элементов для инсерционного мутагенеза создает возможности для изучения различных участков генома B. cepacia, идентификации отдельных генов и установления их функции. Актуальным также является исследование особенностей наследования и экспрессии у B. cepacia детерминант резистентности внешних плазмидных репликонов и их роли в развитии лекарственной устойчивости микроорганизма.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Исследовать эффективность конъюгационной передачи B. cepacia R-плазмид P1 группы несовместимости, несущих Tn-элементы, и оценить возможность их использования для генетического анализа микроорганизма.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и питательные среды. В работе были использованы штаммы B. cepacia дикого типа 8235, 1934, 25416, 8236, 8237, 8238, 8240, 3181, 3189, Vang, а также штаммы E. coli KS17-1 (pSUP5011) и E. coli CH111 (RP1::Tn9 Rep ts). Для культивирования бактерий использовали L-агар и L-бульон ("Difco", США).
Определение МПК антибиотиков. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) хлорамфеникола (Cml, Cm), тетрациклина (Tet, Tc), канамицина (Kan, Km), стрептомицина (Str), гентамицина (Gen), ампициллина (Amp), карбенициллина (Crb, Cb), полимик-сина (Plm), пефлоксацина (Pfx) и цефтазидима (Caz) определяли методом разведений на плотных питательных средах.
Химический мутагенез. 24-часовую бульонную культуру B. cepacia 8235 подращивали в свежей среде в течение 4 ч и обрабатывали 0,1%-м нитрозогуаниди-ном (NG) в течение 60 мин. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин, суспендировали в фосфатном солевом буфере рН 7,2 и высевали на пластины L-агара Выросшие изолированные колонии переносили на L-агар с канамицином (80 мкг/мл).
Конъюгация. Скрещивания проводили на поверхности L-агара на мембранных фильтрах (диаметр пор 0,45 мкм) в соответствии с методом, разработанным для передачи R-плазмид Р1 группы несовместимости в B. pseudomallei и B. mallei [1]. Конъюгационные смеси инкубировали на фильтрах 18 ч при 32 °С, затем культуры суспендировали в 0,87%-м растворе NaCl и высевали на селективные среды. В случае передачи плазмиды RP1::Tn9 Rep ts в среду добавляли полимиксин (1000 мкг/мл) для подавления роста донора и хлорамфени-кол (100-200 мкг/мл) для отбора Cm трансконъгантов. При конъюгационной передаче плазмиды pSUP5011 в селективную среду добавляли канамицин (70 мкг/мл) и полимиксин (1000 мкг/мл). За частоту конъюгационного переноса принимали отношение числа трансконъюган-тов к количеству донорных клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Резистентность исходных штаммов B. сepacia. Показатели устойчивости десяти штаммов B. cepacia к антибиотикам различных классов приведены в табл. 1.
Таблица 1
Резистентность исходных штаммов B. cepacia к антибиотикам различных классов
ф| 38 |ф
Штамы B. cepacia МПК, мкг/мл
Kan Tet Cml Plm Amp Str Gen Caz Pfx
25416 100 50 25 10000 5000 2500 250 15 5
8235 250 50 25 10000 5000 1000 250 10 5
8236 >500 250 10 н н н н н н
8237 500 >250 10 н н н н н н
8238 >500 250 50 н н н н н н
8240 >500 250 10 н н н н н н
1934 100 250 50 н н н н н н
3181 50 50 25 н н н н н н
3189 250 25 5 н н н н н н
Vang >500 >250 50 н н н н н н
Примечание. н - не определено.
Из полученных данных видно, что МПК Kan, Tet и Chl варьируют в зависимости от штамма. При этом наибольшую чувствительность все испытанные культуры B. cepacia проявляли к Cml, который подавлял рост инокулята 5х108 м.к. в концентрации от 10 до 50 мкг/мл. Дополнительно для штаммов B. cepacia 8235 и 25416 были определены МПК некоторых антибиотиков аминогликозидного, Р-лактамного, цефа-лоспоринового и фторхинолонового рядов. Установлено, что наибольшей способностью к подавлению роста инокулята 5х 104 м.к. обладали цефтазидим и пеф-локсацин.
Экспрессия маркеров плазмиды RP1::Tn9 Rep ts в штаммах B. cepacia. Плазмида RP1::Tn9 Rep ts детерминирует устойчивость к Tc, Km, Cb и Cm (последний тип устойчивости опосредован находящимся в плазмидном репликоне транспозоном Tn9) и имеет температурочувствительный по репликации фенотип, позволяющий исключать ее из клеток при температуре 42 °С.
Результаты конъюгации показали, что три штамма B. cepacia (1932, 8235, 25416) воспринимают RP1::Tn9 Rep ts. При этом с наибольшей частотой n х 10-2 происходила передача плазмиды в штамм B. cepacia 8235.
Передача RP1::Tn9 Rep ts существенно повысила резистентность штаммов B. cepacia ко всем детерминируемым плазмидой препаратам, включая резистентность к хлорамфениколу, МПК которого для культур дикого типа не превышала 25 мкг/мл (табл. 2).
Для определения выражения плазмидного признака температурочувствительности TS в новом хозяине изолированные клоны трансконъюгантов штаммов 25416, 1934 и 8235 инкубировали на L-агаре с Cm (50 мкг/мл) при двух режимах температур (32 и 42 °С). В результате все исследованные транс-конъюгантные клоны штаммов B. cepacia 8235 и 25416 проявляли Т3-фенотип переданной плазмиды. Штамм 1934, напротив, наследовал признак темпе-ратурочувствительности в единичных случаях, однако TS варианты этого штамма с высокой частотой (n х 10-5) выщепляли температурорезистентные TR
клоны, что указывало на интеграцию репликона RP1 : :Tn9 Rep ts в хромосому B. cepacia.
Инсерции Tn9 в хромосому B. cepacia. Более 1500 CmR трансконъюгантных температурочувствитель-ных клона B. cepacia 1934 (RP1::Tn9 Rep ts) после цикла культивирования при 42 и 32 °С по Harayama [8] были протестированы на минимальной среде Gillardi для выявления ауксотрофов. В результате было обнаружено 9 клонов, не способных к росту на минимальной среде без специальных добавок (аминокислот или азотистых оснований). Определение их питательных потребностей по схеме Холлидея показало, что включение транспозона индуцировало аук-сотрофные мутации зависимости от метионина (Met), изолейцина-валина (Ile-Val) и гистидина (His). Часть клонов характеризовалась сложными питательными потребностями, которые не были определены.
Таблица 2
Устойчивость трансконъюгантов (RP1::Tn9Rep ts) и исходных штаммов B. cepacia к различным антибиотикам
Штаммы B. cepacia
МПК, мкг/мл
Cm Km Tc Cb
500 500 >500 >10 000
250 500 250 >10 000
500 500 >500 >10 000
Chl Kan Tet Crb
25 100 50 5000
25 100 50 5000
25 100 50 2500
cepacia pSUP5011. Плазмида
ф| 39 |ф
8235 (RP1::Tn9 Rep ts)
25416 (RP1::Tn9 Rep ts)
1934 (RP1::Tn9 Rep ts)
8235 25416 1934
Передача в B. pSUP5011 несет два селективных признака, из которых CmR является собственным маркером репликона, а KmR - маркером находящегося в ее составе транс-позона Tn5. Учитывая "суицидный" характер плазмиды, отбор трансконъюгантов pSUP5011, как правило, проводят по маркеру транспозона. Обнаруже-
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
I 1-2006
ние у Кша-клонов сопутствующей устойчивости к хлорамфениколу рассматривают как свидетельство временного присутствия плазмиды в клетках в состоянии интеграции с хромосомой.
Передачу плазмиды pSUP5011 осуществляли в Кап3-муташы B. cepacia 8235, индуцированные NG. В результате конъюгационных скрещиваний E. coli KS 17-1 (pSUP5011) с B. cepacia 8235 KmS удалось отобрать 10 клонов, устойчивых к канамицину. МПК препарата для данных клонов составляла 70 мкг/мл. Частота передачи плазмиды pSUP5011 в B. cepacia при этом не превышала 2х10-7. У всех Кша-клонов проверили наличие маркера плазмиды CmR. Оказалось, что резистентность к хлорамфениколу сохранили два клона, кроме того, был идентифицирован Сша-клон, резистентность которого к канамицину не отличалась от исходного штамма дикого типа.
Как отмечалось ранее, исходный высокий уровень устойчивости штаммов B. cepacia к антибиотикам различных классов является серьезной проблемой при разработке эффективных систем генетического анализа данного микроорганизма, основанных на технике транспозонного мутагенеза [2, 9]. Использование температурочувствительных векторов доставки Tn-элементов либо сконструированных реци-пиентных штаммов, чувствительных к тем или иным антимикробным соединениям, по нашему мнению, может быть альтернативой применения сложных производных транспозонов, несущих широкие наборы детерминант лекарственной резистентности.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в ходе выполнения данной работы осуществлена конъюгационная передача в B. cepacia плазмиды Р1 группы несовместимости RP1::Tn9 Rep ts и самоэлиминирующегося вектора pSUP5011, перспективных для проведения у этого микроорганизма транспозонного мутагенеза и получения генетически измененных штаммов с заданными свойствами. Детерминанты резистентности RP1::Tn9 Rep ts эффективно экспрессируются в новом хозяине, повышая устойчивость штаммов B. cepacia к хлорамфениколу, тетрациклину, карбени-
циллину в 5 и более раз. Температурочувствитель-ный фенотип плазмиды также стабильно проявляется в трансконъюгантах B. cepacia. Включение в хромосому B. cepacia транспозона Tn9 индуцирует образование ауксотрофных мутаций с частотой 8 х 10-3. Для конъюгативного переноса репликона pSUP5011, несущего mob ген плазмиды RP4 и последовательность Tn5, с помощью химического мутагенеза (обработка нитрозогуанидином) получены KmS реципи-ентные штаммы B. cepacia. Показано, что B. cepacia воспринимает в конъюгации "суицидный" репликон pSUP5011, наследуя с частотой nx10-6 маркер KmR транспозона Tn5.
ЛИТЕРАТУРА
1. Меринова Л. К., Тимофеева Е. В., Сеимова И. К // Мол. ген. микробиол. вирусол. - 1997. - № 1. - С. 14-17.
2. Abe M., Tsuda M, Kimoto M., et al. // Gene. - 1996. -Vol. 174. -P. 191-194.
3. Bevivino A., Dalmastri C., Tabacchioni S., et al. // J. Clin. Microbiol. -2002. - Vol. 40. - P. 846-851.
4. Brisse S., Cordevant C., Vandamme P., et al. // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42. - P. 4824-4827.
5. Coenye T., Vandamme P. // Environ. Microbiol. -2003. - Vol. 5. - P. 719-729.
6. Coenye T., Vandamme P., Govan J.R., et al. // J. Clin. Microbiol. -2001. - Vol. 39. - P. 3427-3436.
7. Govan J.R., Hughes J.E., Vandamme P. // J. Med. Microbiol. - 1996. - Vol. 45. - P. 395-407.
8. Harayama S., Tsuda M., Iino T. // Mol. Gen. Genet. -1981.-Vol. 184. - P. 52-55.
9. Kholti A., Plesa M., Cornelis P. // Res. Microbiol. -2003. - Vol. 154. - P. 451-455.
10. Langley R., Kenna D. T., Vandamme P., et al. // J. Med. Microbiol. - 2003. - Vol. 52. - P. 483-490.
11. Pitt T.L., Kaufmann M.E., Patel P.S., et al. // J. Med. Microbiol. - 1996. - Vol. 44. - P. 203-210.
12. Porter R.D. / Modern microbial genetics. Ed. Streips U. N., Yasbin R. E. - Wiley-Liss. Inc. - New York, 2002. - P. 463-507.
13. Vandamme P., Holmes B., Vancanneyt M, et al. // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1997. - Vol. 47. - P. 1188-1200.
14. Wigley P., Burton N.F. // J. Applied Microbiol. -1999. - Vol. 86. - P. 460-468.
15. Yabuuchi E., Kosako Y., Oyaizu H., et al. // Microbiol. Immunol. - 1992. - Vol. 36. - P. 1251-1275.
© Коллектив авторов, 2006
Щ 40 |ф
