CC BY
38
Оригинальные исследования
Контролируемая иммунокоррекция больного и последующая активирование мононуклеарных клеток костного мозга, улучшают функцию миокарда при хронической ишемической сердечной недостаточности
А.А. Темное, С.В. Гуреев, Н.А. Онищенко, В.И. Шумаков
Лаборатория биотехнологии стволовых клеток ФГУ НИИ трансплантологии
и искусственных органов Росздрава, Москва
Controlled immunocorrection and subsequent activation of bone marrow mononuclear cells improve myocardial function in chronic ischemic cardiac failure
AA.Temnov, S.V. Gureev, N.A. Onishchenko, VI Shumakov
Laboratory of stem cells biotechnology State Scientific Research Institute of Transplantology and Artificial Organs, Russian Ministry of Public Health, Moscow
Хроническая сердечная недостаточность [XCH] сопровождается иммунной дизрегуляцией, степени тяжесть которой предопределяет отсутствие клинического эффекта от применения аутологичных стволовых клеток костного мозга [ККМ]. В работе изучено влияние двухэтапной активации ККМ [сначала In vivo, а затем ex vivo) на улучшение функции левого желудочка [ЛЖ] больных ХСН. В работе исследовали две группы больных с ХСН. В I группе [контроль, п=50) пациентам выполнялась операция аорто-коронарного шунтирования [АКШ]. Вторая группа включала больных [п=57}, которым во время АКШ интрамиокардиально вводили 200 млн. аутологичных мононуклеарных ККМ. У больных 2-й группы исходно оценивали тяжесть иммунной дизрегуляции, определяя значения индекса стимуляции лейкоцитов крови [ИС} при проведении хемилюминесцентного теста. У 1ß больных с ИС>1 и умеренными изменениями иммунограммы прогнозировали благоприятный эффект применения ККМ. У 41 больного с ИС <1 и глубокими изменениями иммунограммы прогнозировали неблагоприятный клинический эффект от введения ККМ. 22 больным с ИС<1 предварительно проведен курс иммунокор-регирующей терапии [активация ККМ In vivo). Мононуклеарные ККМ больных [п=38 с ИС>1 и п=19 с ИС <1} культивировали в течение 5-7 суток [активация ККМ ex vivo). Было показано, что при культивировании у пациентов с благоприятным прогнозом наблюдается изменение фенотипического состава культивируемого костного мозга: увеличение CD3, CD4, CD8, CD 25 и др. Контрольное обследование пациентов через 6 мес. после введения аутологичных клеток костного мозга выявило, что достоверная позитивная динамика функции ЛЖ [ОКДО, DKCO, йФИ) и индекса физической активности [DASIJ наступала у больных с ИС> 1. Контролируемая иммунокоррекция, проводимая до забора ККМ, в сочетании с последующей активацией ККМ ex vivo способствовала достоверному улучшению объемных характеристик ЛЖ через 6 мес. после AKÚJ по сравнению с контролем. Таким образом, для эффективного применения аутологичных ККМ у больных ХСН следует осуществлять двухэтапную активацию ККМ: сначала In vivo с помощью иммунокорректоров, а затем ex vivo в процессе культивирования.
Ключевые слова: клетки костного мозга, сердечная недоста точность, стресс, иммунокоррекция.
Chronic cardiac failure is accompanied with Immune dvsreaulatlon which severity predetermines the absence of clinic efficiency of autologous bone marrow stem cells [BMSCs}. The effect of two-staged activation of bone marrow stem cells [at first, in vivo, then ex vivo) on left ventricle function promotion in patients with chronic cardiac failure has been studied. Two groups of patients with chronic cardiac failure took part in the Investigation. The 7st group patients [control, n=50) underwent cardiopulmonary bypass. To the patients of the 2nd group [n=57} 200 mln autologous mononuclear marrow stem cells were introduced Intramyocardially during the cardiopulmonary bypass. In the 2nd group patients the original Immune dysregulation severity was assessed by assaying the index of white blood cells stimulation [SI] with a chemolumlnescent test. In 16 patients with Sl>1 and a moderate alteration of Immunoassayjavorable effect of BMSCs was predicted; bone marrow stem cells were predicted to produce unfavorable clinic effect in 41 patients with SI <1 and profound alterations of immunoassay. 22 patients with SI <1 had undergone Immunocorrecting therapy [stem cells In vivo activation). Mononuclear stem cells of patients [n=38 with Sl>1 and n=19 with Sl<1) were cultured for 5-7 days [stem cells ex vivo activation). The research demostrated that BMSCs culturing In patients with favorable prognosis led to the changes of Immunophenotype of bone marrow such as CD3, CD4, CDS, CD 25 increase. The control examination of the patients 6 months after autologous bone marrow cells introduction revealed that positive dynamics of the left ventricle function and the physical activity index [DASI) occurred In patients with Sl>1. Controlled Immunocorrection performed before derivation of BMSCs, In combination with their subsequent ex vivo activation promoted reliable improvement of functional characteristics of the left ventricle 6 months after cardiopulmonary bypass in comparison with the controls. For autologous bone marrow stem cells to be effective in patients with chronic cardiac failure two-staged activation of BMSCs should be performed: at first. In vivo with immunocorrectors, then ex vivo while culturing.
Key words: bone marrow cells, cardiac failure, stress, immunocorrection.
Возможности восстановительной регенерации миокарда с помощью аутологичных клеток костного мозга (ККМ) про должают оставаться предметом пристального изучения. В последнее время интересы исследователей сместились в область применения этих клеток у больных ишемической хро нической сердечной недостаточностью (ХСН), т.к. именно у этой группы больных наиболее выражена потребность в вое становлении сократительной функции миокарда. При этом, одни исследователи (1 4] сообщают о позитивных резуль татах применения аутологичных мононуклеарных ККМ (умень шении объемов ЛЖ, повышении ФИ ЛЖ и регрессии клиники
ХСН), тогда как другие не выявили статистически значимого улучшения показателей функции ЛЖ у этих больных (5, 6].
Позитивный эффект терапии аутологичными мононукле арными ККМ авторы связывают преимущественно с их ин дуктивными и информационными свойствами: с продукцией проангиогенных и антиапоптических цитокинов [7 10], с ре гуляцией воспаления и иммунной модуляции в организме [11, 12], с улучшением регенерации кардиомиоцитов и повыше нием их устойчивости к апоптозу [13 15], с пластичностью стволовых ККМ и их влиянием на пролиферацию «cardiac stem cells» [16].
А
Оригинальные исследования
Отрицательный (и/или недостаточно значимый) результат трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН, возможно, обусловлен изменением состава и нарушением функции ство ловых и прогениторных ККМ, возникающих при ХСН и со путствующих ей заболеваниях, таких, как сахарный диабет, гипертоническая болезнь, почечная недостаточность и др. [17,18]; артериальная гипертензия, атеросклероз, гиперли пидемия [19 23]. Показано, что применение различного типа ККМ от «больных» и/или старых доноров не только не приносит ожидаемого положительного эффекта, но может вызвать ухудшение функции органа мишени: наступает тор можение васкуляризации и заживления кожных ран [24]; прогрессирование атеросклероза и нарушение стабильно сти атеросклеротической бляшки; ингибирование ангиогене за [25]; изменение спектра секреции цитокинов с противоспа лительных на провоспалительные [26], которое в ряде случаев может индуцировать развитие острой сердечной недостаточ ности [27]. Создается впечатление, что в клинической практике исследователи применяют ККМ с разными (и даже с противоположными свойствами). Именно этот факт зас тавляет искать пути оптимизации клеточной терапии в кар диологии и повышения ее безопасности [28].
В исследовании результатов трансплантации ККМ, про веденном в нашей клинике у 30% больных ишемической ХСН мы не отметили статистически значимого позитивного эф фекта после интракоронарного и/или интрамиокардиального введения аутологичных ККМ [29,30]. Пытаясь выяснить, при чины отсутствия у ряда больных позитивного эффекта от вве дения мононуклеарных ККМ, мы предположили, что у боль ных ХСН на фоне системного воспаления и хронической гипоксии, очевидно, формируется функциональная недоста точность гемопоэтических иммунорегуляторных клеток КМ. Основанием для такого предположения послужили работы G. Seíye об инволюции органов иммунной системы в условиях хронического стресса, которая сопровождается снижением функциональной активности фагоцитирующих клеток крови [31, 32] и снижением морфогенетической активности лим фоидных клеток, являющихся «переносчиками регенераци онной информации» в организме [33]. Выраженность инво люционного процесса в костном мозге как центральном органе иммуногенеза при хроническом стрессе определяет ся суммарной биологической дозой стресс повреждающего фактора [тяжесть и длительность заболевания), а также ге нетическими (врожденными) и фенотипическими (приобре тенными) резервами устойчивости клеток КМ (возраст, фи зические тренировки и др.).
По данным нашей клиники, до 70% больных ХСН имеют признаки вторичного иммунодефицита различной степени выраженности, что указывает на предсуществующее нару шение пролиферативной, миграционной и информационной активности как гемопоэтических ККМ, так и клеток крови.
По мере развития ХСН дизрегуляция иммунной системы прогрессирует особенно среди тех ее звеньев, которые от ветственны за регенерацию поврежденных органов. В ре зультате этого лечение хронических процессов становится неразрешимой задачей, т.к. сам организм, создавая иммун ный дисбаланс, стремится ослабить проводимую активаци онную терапию, чтобы затормозить процесс износа и гибе ли гиперфункционирующих структур жизненно важных поврежденных органов.
Для восстановления иммунного статуса больных ХСН и морфогенетической активности иммуноцитов (лимфоцитов и макрофагов) крови и ККМ мы считали целесообразным до проведения клеточной терапии осуществить предвари тельную активацию аутологичных ККМ больных в 2 этапа: сначала ¡n vivo с помощью иммунокорригирующих препара тов, а затем ex vivo, проводя культивирование выделенных ККМ в питательной среде в течение 5 суток.
Ниже мы представляем результаты предлагаемого нами подхода для повышения эффективности трансплантации ауго логичных ККМ у той категории кардиологических больных, у которых исходно снижен активационный (адаптационный и/ или регуляционный) потенциал иммуноцитов мононукле арных клеток крови и КМ.
Материал и методы
Характеристика больных
Трансплантация ККМ больным ХСН проводится в клинике Института с 2003 года (более 200 трансплантаций). В насто ящее исследование включено 107 больных ишемической ХСН, которые поступили в клинику для плановой операции АКШ. Возраст больных колебался от 45 до 62 лет. У 55 обследо ванных больных установлен III функциональный класс сердеч ной недостаточности по классификации ЫУНА. Больные были разделены на 2 группы. В 1 ю группу (контрольную) включено 50 больных, которым выполнялась АКШ по стандартному пла ну. Во 2 ю группу (группа клеточной терапии) было включено 57 больных, которым во время операции АКШ интрамиокар диально вводили 200 млн аутологичных, предварительно куль тивированных мононуклеарных клеток КМ. Общая характери стика обеих групп больных представлена в табл. 1.
Таблица 1. Общая характеристика исходного состояния больных ХСН контрольной и клеточных групп
Параметр АКШ+ СК КМ Контроль. группа Р
Возраст S0 ± 7,4 47±8 0,752714
Мужской пол 100% 100% 1,0
Количество ИМ 1,3±0,57 1,2±0,6 0,683521
ФКХСН по ЫУНА 2±0,6 2±0,7 0,372030
ФК стенокардии 3±0,8 2,5±0,8 0,462250
ББИ (безболевая ишемия) 14% 19% -
Длительность ИБС, мес. 24±14 18±12 0,074204
Длительность ХСН, мес. 15±7 12±6,5 0,075231
Индекс ОАЭ!, баллы 36,7±5,8 38,6±6,3 0,22650
Артериальная гипертония, % 60 71 -
Курение сигарет, % 85 76 -
Сахарный диабет, % 39 15 -
Синусовый ритм, % 100 100 1,0
Наджелудочковые экстрасистолы, % 24 29 -
Желудочковые экстрасистолы, % 15 19 -
р-блокаторы, % 100 95 -
Кордарон, % 0 3 -
Диуретики, % 32 38 -
Коронарная ангиопластика в анамнезе, % 8 5 -
Кол-во шунтированных артерий на I пациента 2,6 ±0,8 2,8±0,5 0,068
Время пережатия аорты, мин 59±15 69±16 0,07
Время ИК, мин 98±30 110±28 0,06
Операционная летальность, % 0 0 1,0
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 1, 2007
Оригинальные исследования
Во второй группе больных в предоперационном периоде определяли исходный уровень регуляторных резервов иммун ной системы. Для этого исследовали активационные резервы мононуклеарных клеток крови этих больных и рассчитывали индекс их стимуляции (ИС). По исходным значениям индек са стимуляции (ИС) все больные группы клеточной терапии были разделены на 2 подгруппы: с исходным ИС>1 (хоро ший прогноз клеточной терапии; п=16), и с ИС<1 (плохой прогноз; п=41 ). Некоторым больным (п=22) с низким (ИС<1 ), был проведен курс иммуномодулирующей терапии (актива ция ¡n vivo мононуклеарных клеток) одним из иммунокорриги рующих индивидуально подобранных препаратов: полиокси доний, имунофан синтетический гепатопептид, циклоферон индуктор интерферона, реаферон в терапевтических до зах. Иммунокоррекция оценивалась позитивно, если через 7 14 суток лечения ИС мононуклеарных клеток крови стано вился >1. В итоге перед забором ККМ в предоперационном периоде среди больных группы клеточной терапии у 38 боль ных ИС был больше 1, а у 19 меньше 1.
Определение активационных (адаптационных]
резервов мононуклеарных клеток
крови больных
Метод основан на использовании известной зависимо сти функциональных резервов иммуноцитов от уровня внут риклеточных метаболических процессов, среди которых ключевую роль играет образование ими активных форм кис лорода (АФК). Способность мононуклеарных клеток отвечать на воздействие стрессора (интерферон, циклоферон и др.) дополнительным образованием АФК была использована нами для оценки функциональных (регуляторных) резервов мононуклеарных клеток (МНК) и пригодности их для прове дения клеточной терапии. Оценка функциональной активно сти МНК КМ включает в себя следующие этапы.
а). Получение и подготовка лейкоцитарной суспензии.
Для получения суспензии МНК 2 мл гепаринизирован
ной крови смешивали с 1 мл подогретого до 37°С 3% ра створа желатина и инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отбирали в пластиковые про бирки и отмывали 10 кратным объемом фосфатно соле вого буфера (рН=7,4). Затем лейкоциты центрифугировали в течение 10 мин. при 1000 об/мин, ресуспендировали в растворе Хенкса без Са2^ и Мд2^. После подсчета числа лейкоцитов концентрацию клеток доводили до 106 кл/мл, и вносили в две кюветы по 40x103 клеток. В опытную кювету объемом 200 мкл дополнительно вносили препарат циклофе рон (12,5% раствор) 1,5 мкл. В контрольную кювету вносили 1,5 мкл раствора Хенкса. Контрольную и опытную кюветы с клетками инкубировали в термостате в течение 60 мин при 37°С.
б). Хемилюминесцентный анализ динамики накопления активных форм кислорода (АФК) при воздействии стрессора.
После инкубации лейкоцитарной взвеси проводили за пись кривых хемолюминесцентной реакции (ХЛР) в течение 15 мин. с использованием хемилюминометра «Хелюм 200101/01 » (Россия) в комплексе с компьютером IBM PC при температуре счетной камеры 37°С. В качестве усилите ля свечения использовали люминол (5 амино 2,Здигидро 1,4фталазиндион, «Sigma», США) в конечной концентрации 103 М, а в качестве активатора образования АФК РМА (форбол 12миристат 13 ацетат, «Sigma») в концентрации 10 6М. Суммарную продукцию АФК вычисляли как площадь под кривой ХЛР (рис.1). Рассчитывался индекс стимуляции (ИС) МНК используемым препаратом отношение площади под кривой ХЛР с циклофероном (S циклоферон) к площади кривой ХЛР клеток без добавления циклоферона (S контроль).
Индекс стимуляции >1 свидетельствует о способности МНК больного к накоплению АФК и прогнозирует благоприятный результат введения собственных ККМ данному больному (рис. 2). Индекс стимуляции <1 свидетельствует о неспособ ности МНК больного отвечать на воздействие стрессора и прогнозирует неблагоприятный результат введения соб ственных клеток КМ больному (рис. 3).
Рис.1. Расчет индекса стимуляции:
А - Б препарат - интенсивность ХЛР мононуклеарных клеток в пробе с циклофероном;
В - Б контроль - интенсивность ХЛР в контрольной пробе. ИС=Б препарат/Э контроль
Рис. 2. Пример записи кривых ХЛР мононуклеарных клеток Б циклоферон и Б контроль, которые прогнозируют позитивный эффект применения собственных ККМ
Оригинальные исследования
Рис. 3. Пример записи кривых ХЛР мононукпеарных клеток Б цикпоферон/Э контроль, которые прогнозируют неблагоприятный эффект применения собственных ККМ
Аналогичный метод с исследованием ХЛР собственных МНК был использован при индивидуальном подборе пре паратов для иммунокоррекции больного перед забором ККМ. Препаратом, пригодным для иммунокоррекции счи тали тот, индекс стимуляции клеток которым был больше 1,1.
Выделение аутологичных мононукпеарных клеток из КМ больных.
Аспират костномозговой взвеси в количестве 150±25 мл получали путем нескольких пункций обоих крыльев П0ДВЗД0Ш ных костей. Полученный аспират центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин при температуре 18 22°С. В про бирку забирали плазму и интерфазное кольцо. Осуществляли повторное центрифугирование при 1500 об/мин в течение
5 минут при 22°С. К полученному осадку добавляли лизирую щий раствор в соотношении 1:10. Лизис эритроцитов прово дили в течение 5 мин, затем проводили центрифугирование при 1500 об/мин в течение 5 мин при 22°С.
Полученный осадок клеток ресуспендировали в росто вой среде DMEM, содержащей эмбриональную сыворотку, инсулин, гентамицин. Клетки высевали на чашки Петри и культивировали при 37°С в атмосфере с 5% С02 и при 95% влажности в течение 5 7 суток. Общее количество клеток, используемых для лечения одного пациента, составило 200 млн в 5 мл физиологического раствора.
В табл. 2 представлена фенотипическая характеристика свежевыделенной фракции мононуклеарных ККМ больных группы клеточной терапии в сравнении со здоровыми до норами (контроль).
Фенотипическая характеристика гемопоэтической фракции стволовых и прогениторных костного мозга Отдельные популяции гемопоэтических стволовых и про гениторных клеток костного мозга выявляли на проточном цитофлуориметре FAScan фирмы Becton Dickinson (USA) с использованием комбинации моноклональных антител (МАТ), изготовленных НПЦ «МедБиоСпектр» и «Сорбент» (Россия), меченных FITC и фикоэритрином (РЕ). Исследовали
популяции лимфоцитов: CD3, CD4, и CD8; рассчитывали ин деке CD4/CD8, содержание CD16, CD34+CD45+ и Влим фоцитов CD19 до и после культивирования.
Экспрессию адгезивных молекул определяли с помощью МАТ к CD54 и CD 11b, количество апоптотических клеток с помощью МАТ к CD95 (FAS/AP0 1 антиген). Функциональ ную активность клеточного звена иммунитета оценивали по количеству клеток, экспрессирующих на поверхности рецеп тор к IL 2 (ILR) CD3, CD25 и HLA DR антигену, а также по числу активированных клеток (CD71^,CD38^) и активирован ных NK (CD8^, CD 161
Методы оценки клинического состояния
больных и функции сердца
Оценку клинического состояния пациентов до операции АКШ и через 1 и 6 мес. после нее осуществляли с помощью 6 минутного теста и по субъективной методике, основанной на учете мнения пациента определение индекса активности (The Duke Activity Status Index индекс DASI); качество жизни па циентов определяли с помощью Миннесотского опросника качества жизни больных ХСН (Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire MLHFQ). Информационными показателями для оценки изменения функции сердца после клеточной терапии были выбраны КДО ЛЖ, КСО ЛЖ и ФИ ЛЖ, которые оценива лись с помощью эхокардиограммы, выполняемой в «М» и двух мерном режимах, одним и тем же специалистом до операции AKLLI и через 1 и 6 мес. после нее. У части больных (п=25) с целью контроля данных ЭХОКГ выполняли ЯМР томографии миокарда и/или радиоизотопную вентрикулографию.
AKLLI выполнялось в условиях искусственного кровооб ращения на остановленном сердце по обычной методике. Взвесь клеток вводили в миокард до снятия зажима с аорты 1015 инъекциями по 0,3 0,5 мл каждая.
Статистическая обработка материала проводилась с по мощью программы обработки данных «Статистка 6.0» (StatSoft, США, 2003 г.), средствами которой выполнялось также графическое представление данных. Соответствие ана лизируемых параметров закону нормального распределения оценивали по методу Колмогорова Смирнова, Лиллиефорса и Шапиро Уилка. Динамика изменения исследуемых пара метров связанных групп, по сравнению с исходными, оцени валась по формуле: А = (АО А1 )/А0х100%, где АО исходное значение параметра, А1 последующее его значение [34]. Статистическая значимость различий рассчитывалась по методу Wilcoxon и/или Mann Whitney.
Результаты
Проведенный нами ранее [29, 30] анализ результатов клеточной терапии аутологичными ККМ у больных ХСН ишемического генеза позволили выделить две группы больных, различающихся по характеру восстановления функции сердца: группу больных с отчетливым клиничес ким и функциональным эффектом, и группу больных со ела бо выраженным эффектом.
Таблица 2. Фенотипическая характеристика фракции свежевыделенных мононуклеарных ККМ больных клеточной группы в сравнении со здоровыми донороми КМ в %
Группы больных CD34+CD45+, % CD16+, cells/мкл CD19+, cells/мкл CD4+, cells/мкл CD8+, cells/мкл CD4/CD8 Лимфоциты, cells/мкл
2-я группа (больные ХСН) 2,2 ± 0,S 120±30 110±68 680±3S 1140±S0 0,6±0,2 1S60±S60
Здоровые доноры (контроль5) 2,6 ± 0,3 3S0±S6 1S7±S0 1110±40 S00±26 2,2±0,9 2200±420
Примечание: # группу здоровых доноров составили профессиональные спортсмены, п=20.
Оригинальные исследования
Полагая, что причиной выявленных различий в реакции больных на клеточную терапию может быть предсуществую щая дизрегуляция иммунной системы, мы провели исследо вание иммунного статуса больных ИБС, поступивших в клини ку для АКШ. Оказалось (рис. 4), что практически у всех больных ишемической ХСН в предоперационном периоде имеют место различные по направлению и выраженности от клонения в показателях клеточного (рис. 4А), гуморального и фагоцитарного (рис. 4В) звеньев иммунитета, при этом тяжесть нарушения коррелировала со степенью выраженности ХСН.
Эти данные указывали на тот факт, что поступающие на лечение больные ИБС имеют сформировавшуюся в процессе заболевания дисфункцию иммунной системы как по лимфоцитарному (Т и В лимфоциты), так и по мо ноцитарно макрофагальному звеньям, обеспечивающим, как известно, адекватную регуляцию клеточных взаимо действий в иммунном ответе и в индукции процессов вое становительной регенерации поврежденной ткани [33].
Различные варианты отклонения отдельных показателей иммунного статуса и их сочетание требовало для оценки ре гуляторных возможностей клеток иммунной системы исполь зовать обобщенный показатель ИС, суммарно оценивающий резервы функциональной активности всей популяции лейко цитов крови (метод описан в разделе «материал и методы»). Разделив всех больных 2 й группы (клеточной терапии) на подгруппы в зависимости от значения ИС (ИС<1 и ИС>1), мы выявили скрытые ранее различия в усредненной карте им мунной системы этих больных (табл. 3).
В
Рис. 4, Распределение больных [%) с ишемической ХСН [п=97] по отклонениям показателей клеточного [А], гуморального и фагоцитарного [В] звеньев иммунитета в предоперационном периоде. Обозначение: желтая часть столбика - меньше /V; серая часть столбика - /V; красная часть столбика - больше N
Таблица 3. Исходные показатели иммунограммы кардиохирургических больных 2-й группы в зависимости от индекса стимуляции их мононуклеарных клеток
Здоровые доноры Кардиохирургические больные
Показатель крови5(п=20) ИС 2,0-2^ Общая группа Группа с ИС>1,0 Группа с ИС <1,0
(n=S7) (п=16) (п=41)
Лимфоциты, % 32,5±4,8 28,1±3,0 34,0±3,6 16,4±4,7 !*+
Т-лимфоциты, % в мкл 67,5±4,6 52,4±13,4 70,5±6,6 37,5±11,0 !*+
(С03+; 1550±240 1410±190 1860±110 460±110
Т-хелперы, % в мкл 43,9±3,7 30,2±3,3 48,4±5,4 Т 22,4±7,5 !*+
(С04+) 670±6S 548±49 940±120 340±70
Т-цитотоксические,% в мкл 28,1 ±3,6 23,0±2,4 5 СО ® ± ±7 О 54 25 22,0±4,9 1
(С08+) 330±SS 290±45 155±30,5
В-лимфоциты, % в мкл 10,1±1,5 10,4±1,5 12,1 ±1,1 320±84 8,9±1,0
(С020+) 150±43 130±50 75±15
ЫК-клетки (С016+), % 13,9±1,6 12,2±1,4 15,9±3,2 10,0±1,4 !*+
Н1_А^ 11,5±3,5 14,2±3,4 20,1 ±2,7 Т*+ 13,1 ±2,2
11_2-К+-кл. (СD25+) 3,2±1,6 4,1 ±1,1 6,7±1,3 Т*+ 3,8±2,0
С071 + 3,0±0,5 3,1±0,2 4,5±0,5 Т*+ 2,5±0,1
1дС, г/л 13,0±0,9 17,1 ±1,3* 16,5±1,1 Т* 18,3±2,0 Т *+
1дА, г/л 2,5±0,4 2,1±0,2 2,4±0,1 2,0±0,2
1дМ, г/л 1,5±0,2 2,2±0,2 2,4±0,3 Т*+ 2,1 ±0,3 Т*
ЦИК, у.е. 153,0±40,1 490,0±20,2* 370,0±42,2 Т*+ 599,4±60,7 Т*+
Фагоцитарный индекс, % 75,5±3,5 51,7±2,9* 52,3±2,8* 50,9±3,0*
Фагоцитарное число, у.е. 5,5±1,7 3,5±0,3* 3,8±0,2* 3,1±0,2*
Примечание: * достоверное различие по сравнению с показателями здоровых доноров крови [р<0,05];
+ достоверное различие по сравнению с показателями больных с нормальной продукцией АФК [р<0,05]; Т, I повышение/снижение показателя по сравнению с группой здоровых доноров крови:
# группу здоровых доноров составили профессиональные спортсмены, п=20.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
Оригинальные исследования
В усредненной иммунограмме по всей 2 й группе больных (п=57) выявлялись достоверные различия с группой здоровых доноров только по функциональным показателям фагоцити рующих клеток и В лимфоцитов (уровень 1д и ЦИК). Разделив этих же больных в подгруппы с ИС>1 и ИС<1, мы смогли ус тановить не только качественные, но и количественные раз личия в иммунограммах этих больных (см. табл. 3). Различия состояли в том, что хотя у больных с ИС>1, и выявлялись раз личия в функциональной активности клеток, но уже можно было отметить повышение количества активированных кле ток (Н1.А ОИ, И2Р, С071*), что указывало на сохраняющи еся потенциальные резервы иммунной системы и возможность ее иммунокомпетентных клеток участвовать в адаптивных ре акциях. В группе больных с ИС<1 удается выявить достовер ное снижение общего числа лимфоцитов, Т лимфоцитов и их популяций (Т хелперы, Т цитотоксические); отмечается тен денция к снижению количества В лимфоцитов, 1\1К клеток, а
также функциональной активности В лимфоцитов и фагоци тов периферической крови. Достоверно более низкие значе ния показателей иммунограммы у больных с ИС<1 свидетель ствуют о состоянии исходного стрессорного повреждения иммунной системы и костного мозга, снизившего продукцию иммунокомпетентных клеток в периферическую кровь. О сни жении функциональной активности мононуклеарных ККМ у больных с ИС<1 свидетельствуют результаты изучения фено типического состава ядерной фракции ККМ до и после их куль тивирования (рис. 5). Из рис. 5 видно, что процедура культиви рования (ел vivo активирования) ККМ в питательной среде с добавлением субстратов и ростовых факторов у больных с ИС<1 приводила не к повышению, а к снижению количества клеток, несущих маркеры важнейших иммунокомпетентных клеток. В то же время культивирование ядерной фракции ККМ больных с 1/101 приводило к увеличению количества клеток различного фенотипа.
ИС<1
Ж
Ш.Е
л ш
г*Цг
tan // i а а //
f
в
ИС>1
г
г
[.in о..о,L
* * &///jf///////
Рис. 5. Изменение фенотипического состава ядерной фракции клеток костного мозга после ex vivo активирования [культивирования} у больных с разным исходным значением индекса стимуляции [ИС} мононуклеарных клеток крови. Синие столбики - до культивирования; красные столбики - после культивирования
Установленные факты показывают, что при культивиро вании мононуклеарной фракции клеток от больных с ИС>1 действительно достигается эффект ex vivo активации и при использовании таких клеток у больных ХСН можно рассчи тывать на позитивный клинический результат. Тогда как у больных с ИС<1 рассчитывать на благоприятный клиничес кий результат нельзя. Именно эти больные, по нашему мне нию, нуждаются в предварительной реадаптации, которая в условиях сформировавшегося иммунодефицита может быть достигнута с помощью курса индивидуально подобранной иммунокорригирующей терапии.
Наши исследования показали (табл. 4), что после курса терапии одним из подобранных иммунокорректоров уже на 10 14 е сутки происходит достоверно благоприятное из менение большинства изученных нами показателей; часть показателей достигала значений, присущих значениям здоровых доноров. О возникающей реадаптации мононук леарных ККМ у больных с ИС<1, подвергшихся иммуномо дуляции (/л vivo активация клеток иммунной системы), сви детельствует восстановление продукции цитокинов этими клетками в процессе их культивирования (ел vivo активация мононуклеарных клеток).
Об определяющей роли исходного функционального со стояния клеток иммунной системы, используемых для кле точной терапии, свидетельствуют результаты исследова ния объемных характеристик и функции сердца у больных
ИБО через 6 мес. после трансплантации аутологичных мо нонуклеарных ККМ (табл. 5).
Корреляционный анализ влияния на эффективность клеточной терапии ИБО следующих факторов: функцио нальной активности аутологичных ККМ (ИС), возраста больного, длительности ХСН, количества введенных кле ток (с одной стороны) и дельтой изменения КДО, КСО ЛЖ и ФИ ЛЖ у анализируемых больных через 6 мес. после one рации (с другой)позволил выявить существование сильной корреляции только в следующих парах: ИС/ДКДО ЛЖ Spearman R=0,78, р=0,000545; ИС/ДКСО ЛЖ R=0,57, р=0,00074; ИС/А индекс DASI, Spearman R=0,45, р=0,0445; ИС/АФИ ЛЖ Spearman R=0,45, р=0,007; дли
А
р=0,043. Корреляционная связь отсутствовала между дельтой изменения исследуемых нами информационных показателей и возрастом пациента, количеством вводимых ККМ, количеством перенесенных инфарктов миокарда, а также интраоперационными данными (время искусствен ного кровообращения, время пережатия аорты, показате лями интраоперационного мониторинга внутрисердечной гемодинамики).
Разделив больных на две группы в зависимости от значе ния ИС, мы подтвердили наши предположения о том, что именно от исходного функционального состояния ККМ зависит эф фект их клинический применения (табл. 5).
А
Оригинальные исследования
Таблица 4. Изменение иммунологических показателей у больных 2-й группы после курса иммунокорригирующей терапии (п=22)
Иммунологические показатели, % Контроль5 (здоровые доноры) (п=20) Больные до иммунокоррекции и после нее (п=22)
до коррекции через 14 дней
Лимфоциты 32,S±4,8 24,2±2,2 30,0±2,0 t*
Т-лимфоциты (CD3+) 67,S±4,6 S8,4±3,4X 69,8±2,S t*
Т-хелперы (CD4+) 43,9±3,7 32,0±3,1х 4S,S±2,4 t*
Т-цитотоксические CD8+) 28,1±3,6 16,7±2,2Х 2S,7±2,0 t*
В-лимфоциты (CD20+) 10,1±1,S 6,3±1,1 8,6±0,9 t*
NK-клетки (CD16+) 13,9±1,6 19,S±2,9X 16,S±2,0 1
HLA-DR 11,S±3,S 17,6±2,1х 1S,7±1,7 1
IL2-R+-kn. (CD2S+) 3,2±1,6 S,6±0,9 3,3±0,1 1*
CD71 + 3,0±0,S 8,7±2,0х 11,0±2,8 tX
IgG, г"п 13,0±0,9 1S,S±0,9 16,0±1,8
IgA, г"п 2,S±0,4 2,S±1,1 3,6±0,3 t*
IgM, г"п 1,S±0,2 2,7±0,4х 1,6±0,4 1*
ЦИК, у.е. 1S3,0±40,1 S88,0±1SS,3X 3S0,S±SS,3 1*
Фагоцитарный индекс, % 7S,S±3,S S2,7±2,8X 6S,6±4,22t*
Фагоцитарное число, у. е. S,S±1,7 3,1±0,2X S,0±0,8 t*+
Примечание: х достоверное различие по сравнению с группой здоровых доноров [р<0,05];
* достоверное различие с исходным уровнем [до иммунокоррекции] [р<0,05]; Т, I повышение/снижение показателя по сравнению с исходным уровнем;
# группу здоровых доноров составили профессиональные спортсмены, п=20.
Таблица 5, Значения параметров ремоделирования и функции сердца у больных ишемической ХСН через В мес. после операции АКШ с интрамиокардиальным введением культивированных клеток костного мозга
Параметры Больные ИБС
Исходный ИС<1 (п=11) Исходный ИС>1 (п=17) р Манна-Уитни
КДО ЛЖ, мл 169,3±21,7 179,1±26.8 0,06
А КДО ЛЖ, %, 6 мес. —1,9±4,1 —9,21±4,6 0,0006
А ФИ ЛЖ, %, 6 мес. 9,1±2,9 21,2±10,7 0,7
КСО ЛЖ, мл 8S,7±24,2 97,03±11,6 0,19
А КСО ЛЖ,%, 6 мес. —9,2±18,08 —24,6±21,26 0,049
АУО ЛЖ, мл, 6 мес. —S,0S±6,9 —18,7±14,2 0,01
А Индекс DASI 6,3±1,9 9,S±3,1 0,04
Обозначение: р коэффициент достоверности различий между несвязанными группами, по критерию Манна Уитни; КДО ЛЖ конечно диастолический объем; ФИ ЛЖ фракция изгнания левого желудочка; КСО конечно систолический объем; УО ударный объем; ОАЭ! индекс физической активности; А дельта изменений, рассчитывалась по О.Ю. Ребровой [2002].
Там, где исходно 1/101,0, через 6 мес. происходит дос товерно выраженное благоприятное уменьшение КСО ЛЖ и увеличение ФИ ЛЖ по сравнению с группой реципиентов, у которых ИС<1,0. Полученные нами данные свидетельство вали о позитивном изменении функции сердца в группе с ИС>1,0 и об отсутствии достаточного позитивного клини ческого эффекта при использовании клеток у больных с ИС<1,0. Именно за счет существования больных ХСН с ИС<1 в целом по группе клеточной терапии в сравнении с конт рольной группой не всегда обнаруживались статистически значимые различия (рис. 6 , табл. 6).
Исходя из того, что исходное состояние иммунной систе мы является определяющим фактором эффективности при менения аутологичных ККМ, наша работа по стабильному
улучшению результатов клеточной терапии стала включать несколько этапов: предварительную оценку исходного со стояния иммунной системы по значениям ИС; активацию мононуклеарных клеток крови и ККМ /л vivo индивидуаль но подобранными иммунокорректорами, если значения ИС<1 для достижения значения ИС>1; активация ex vivo вы деленных ККМ в процессе 4 5 дневного культивирования. Результаты трансплантации ККМ предварительно активи рованных /л vivo и ex vivo, представлены в табл. 6.
Проведение активации мононуклеарных ККМ последова тельно /л vivo и ex vivo позволило нам повысить эффективность трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН, что при вело к более значимым положительным изменениям КСО, КДО и ФИ ЛЖ в сравнении с контрольной группой (рис. 6).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
Оригинальные исследования
Рис. 6. Абсолютные изменения [уменьшение) КСО ЛЖ через Б мес. после трансплантации аутологичных ККМ при применении различного типа ККМ:
Группа 1 - АКШ; группа 2 - АКШ +ККМ с ИС<1; группа 3 - АКШ + ККМ с ИС<1, активированные ex vivo; группа 4 - АКШ + ККМ активированные in vivo и ex vivo; группа 5 - АКШ + ККМ с ИС>1, активированные in vivo и ex vivo
Из рис. 6 видно, что ДКСО Л Ж у больных с ИС<1, ста тистически значимо не отличается от контрольной группы больных, перенесших АКШ, тогда как изменения КСО ЛЖ у больных, которым АКШ дополнялось введением ККМ с ИС>1 и активированными последовательно in vivo и ex vivo, различия становились достоверно более выраженными.
Обсуждение
ХСН как биологическая категория представляет собой хронический стресс, который развивается в результате уменьшения массы функционирующих структур миокарда, возрастания объема сократительной функции (т.е. энерго затрат) на единицу структуры органа и развития компенса торной гипертрофии сохранившихся структурных элементов. Для пролонгирования стадии компенсаторной гипертрофии, торможения дистрофии и гибели оставшихся в органе со кратительных структур из за дефицита энергии, необходи мой для пластических и регуляторных процессов, организм переходит на новый, менее интенсивный уровень жизнеде ятельности. На этой стадии развивается иммунная дизре гуляция снижается индукционная и информационная ак тивность лимфоцитов и других мононуклеарных клеток,
нарушается продукция ими цитокинов и регуляторных пепти дов, резко ослабляется или прекращается миграция гемопоэ тических клеток из костного мозга в кровоток нарушается по пуляционный состав клеток периферической крови, а также снижается реактивность клеток (снижение пролифератив ного ответа на митогены) (21, 22].
Подтверждением развития иммунной дизрегуляции служат наши данные о более низкой реактивности мононуклеарных клеток ККМ в условиях культивирования (изменения фено типического состава клеток, продукция цитокинов TGF ß, G CSF и IL 10 на фоне развития тяжелой иммунной недо статочности (ИС<1) у больных ХСН. Изъятие и введение ККМ в зоны повреждения миокарда позволяет компенсировать де фицит миграционной активности ККМ, но эта процедура не повышает их функциональную активность, связанную с мета болизмом, продукцией тканевых медиаторов и регуляторных пептидов. Очевидно, такая ситуация характеризуется отсут ствием выраженного клинического эффекта от применения ККМ. Использование аллогенных ККМ от здоровых доноров или клеток пуповинной крови может оказаться целесообраз ным, однако трансплантация аллогенного биологического материала имеет свои недостатки.
В соответствии с изложенной нами концепцией, наибо лее действенным способом повышения регенераторной ак тивности иммунной системы может стать предложенный нами метод двухэтапной активации ККМ: сначала in vivo с помощью иммунокорректоров, а затем ex vivo на этапе куль тивирования клеток. Обнадеживающим в этой методике яв ляется тот факт, что двухэтапная активация ККМ способству ет более значимому уменьшению полости ЛЖ у больных ишемической ХСН в группе клеточной терапии в сравнении с контрольной группой, так как не только (или не столько) жизнеспособность миокарда определяет отдаленные ре зультаты хирургического лечения ишемической ХСН, но и степень дилатации ЛЖ. Аналогичные результаты получены также при лечении острого инфаркта миокарда (35).
Так как исходная степень дилатации Л Ж в наибольшей степени влияет на отдаленную выживаемость больных ише мической ХСН, перенесших АКШ, то можно предположить, что применение ККМ у больных ишемической ХСН будет способствовать повышению отдаленной выживаемости больных ишемической ХСН.
Мы полагаем также, что предложенный метод двухэ тапной активации ККМ может быть полезен при лечении любого хронического заболевания, например,сахарном ди абете 2 го типа, т.к. патогенез дисфункции ККМ имеет схожие черты при любой хронической патологии.
Таблица 6. Объемные показатели ЛЖ через Є мес. после АКШ у больных без (контрольная группа) и с применением клеточной терапии (основная группа).
Для клеточной терапии использовали клетки после их in vivo и ex vivo активации
Параметр До лечения Через 6 мес., h изменений, %
АКШ+ККМ п=38 Ме АКШ п=40 Ме Р * АКШ+ККМ n=S0 Me, р1 АКШ n=S0 Me, p1 Р * АКШ+ККМ Ме АКШ Ме Р *
КСО ЛЖ, мл 80 76 0,36 650,03 700,046 0,09 -21,3 -7 0,01
ФИ ЛЖ, % 49,5 51,5 0,33 560,017 550,021 0,3 27,9 9,2 0,02
Индекс DASI 36,7 39,1 0,29 490,006 460,005 0,12 38 18 0,04
КДО ЛЖ, мл 165 162 0,18 1420,120 1520,056 0,06 -16 -4 0,01
Обозначения: АКШ аортокоронарное шунтирование: ККМ клетки костного мозга; Ме медиана; Р* коэффициент достоверности различий между несвязанными группами [контрольная группа и группа клеточной терапии], по критерию Манна Уитни; р 1 коэффициент достоверности различий между связанными группами, по критерию Вилкоксона; КСО конечно систолический объем; ФИ ЛЖ фракция изгнания левого желудочка; ОАЭ! индекс физической активности; КДО ЛЖ конечно диастолический объем.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
Оригинальные исследования
ЛИТЕРАТУРА:
1. Patel A.N., Geffner L., Vina R.F. et al. Syrgical treatment for congestive heart failure using autologius adult stem cell transplantation. Heart and lung trans. 2004; 23(N°2s): 61.
2. Perin E.C., Geng Y. J., Willerson J.T. Adult stem cell in perspective. Circ. 2003; 107: 935 8.
3. Perin E.C.; Dohmann Hans F.R., Borojevic R. et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circ. 2003; 107: 2294 302.
4. Gao L.R., Wang Z.G., Zhu Z. M. et al. Effect of Intracoronary Transplantation of Autologous Bone Marrow Derived Mononuclear Cells on Outcomes of Patients With Refractory Chronic Heart Failure Secondary to Ischemic Cardiomyopathy. Am J. Cardiol. 2006; 98(5): 597 602.
5. Kuethe F., Richartz B., Kasper Ch. et al. Autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in chronic ischemic cardiomyopathy in humans. Int. J. Cardiology 2005; 100(3): 485 91.
6. Rosenzweig A. Cardiac cell therapy mixed results from mixed cells. N. Engl. J. Med. 2006; 355: 1274 7.
7. Kinnaird Т., Stabile E., Burnett M.S. et al. Marrow derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytikines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis thro ugh paracrine mechanisms. Circ. Res. 2004; 94: 687 2.
8. Stefanie D., Spyridopoulos I., Haendeler J. et al. Statins Enhance Migratory Capacity by Upregulation of the Telomere Repeat Binding Factor TRF2 in Endothelial Progenitor Cells. Circ. 2004; 110: 3136 42.
9. Dimmeler S., Zeiher A.M. Wanted! The best cell for cardiac regeneration. J. Am. Coll. Cardiol. 2004; 44(2): 464 6.
10. Kocher A.A., Schuster M.D., Szabolcs M.J. et al. Neovascularisation of ishemic myocardium by human bone marrow derivated angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat. Med. 2001; 7: 430 6.
11. Dewald 0., Zymek P., Winkelmann K. et al. CCL2/Monocyte Chemoattractant Protein 1 regulates inflammatory responses critical to healing myocardial infarcts. Circ Res. 2005; 96: 881 9.
12. Thum Т., Bauersachs J., Poole Wilson P.A. et al. The dying stem cell hypothesis: immune modulation as a novel mechanism for progenitor cell therapy in cardiac muscle. J. Am. Coll. Cardiol. 2005; 46: 1799 802.
13. Minatoguchi S., Takemura G., Chen X.H. et al. Acceleration of the healing process and myocardial regeneration may be important as a mechanism of improvement of cardiac function and remodeling by postinfarction granulocyte colonystimulating factor treatment. Circul. 2004; 109: 2572 80.
14. Trial J., Rossen R.D., Rubio J., Knowlton A.A. Inflammation and Ischemia: Macrophages Activated by Fibronectin Fragments Enhance the Survival of Injured Cardiac Myocytes. Exp. Biol. Med. 2004; 229(6): 538 45.
15. Chazaud B., Sonnet C., Lafuste P. et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. J. Cell. Biol. 2003; 163: 1133 43.
16. Anversa P., Susman M. Molecular Genetic Advances in Cardiovascular Medicine. Circ. 2004; 109: 2832 8.
17. Awad 0., Dedkov E.l, Chunhua J. et al. Differential Healing Activities of CD34~ and CD14~ Endothelial Cell Progenitors. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006; 26: 758 64.
18. Rota М., LeCapitaine N., Hosoda T. Diabetes Promotes Cardiac Stem Cell Aging and Heart Failure, Which Are Prevented by Deletion of the p66shc Gene. Circ. Res. 2006; 99: 42 52
19. Rauscher F.M., Goldschmidt Clermont P.J., Davis B.H. et al. Aging, progenitor cell exhaustion, and atherosclerosis. Circul. 2003; 108: 457 63.
20. Messina E., Giacomello A. Diabetic Cardiomyopathy A "Cardiac Stem Cell Disease" Involving p66Shc, an Attractive Novel Molecular Target for Heart Failure Therapy. Circ. Res. 2006; 99: 1 2.
21. Karra R.S., Vemullapalli C., Dong E.E. et al. Stem Cells of Aging Donors Insufficient Capacity to Repair Causes Progression of Atherosclerosis in the Recipient: Molecular Evidence for Arterial Repair in Atherosclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; 102: 16789 94.
22. Karra R., Vemullapalli S., Dong C, Herderick EE, Song X, Slosek K, Nevins JR, West M, Goldschmidt Clermont PJ, Seo D. Molecular evidence for arterial repair in atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102:16789
16794
23. Lehrke S., Mazhari R., Durand D.J. et al. Aging Impairs the Beneficial Effect of Granulocyte Colony Stimulating Factor and Stem Cell Factor on Post Myocardial Infarction Remodeling. Circ. Res. 2006; 99(5): 553 60.
24. Schatteman G.C., Ma N. Old Bone Marrow Cells Inhibit Skin Wound Vascularization. Stem Cells 2006; 24(3): 717 21.
25. Sata M. Role of Circulating Vascular Progenitors in Angiogenesis, Vascular Healing, and Pulmonary Hypertension. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006; 26: 1008 14.
26. Epstein S.E., Stabile E., Kinnaird T. et al. Janus Phenomenon The Interrelated Tradeoffs Inherent in Therapies Designed to Enhance Collateral Formation and Those Designed to Inhibit Atherogenesis. Circul. 2004; 109: 2826 31.
27. Nagashima H., Kawashira Hirata N., Imamura K. et al. Congestive heart failure after peripheral blood stem cells transplantation, role of cytokines. Jpn. Circ. J. 2000; 64: 382 4.
28. Boyle A.J., Schulman S.P., Hare J., Oettgen P. Cardiac Stem Cell Therapy: Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circul. 2006; 114: 339 52.
29. Шумаков В.И., Казаков E.H., Онищенко H.A., Гуреев С.В. Первый клинический опыт использования стволовых клеток костного мозга для восстановления насосной функции сердца. Росс, кардиологический журнал 2003; 5: 42 6.
30. Гуреев С.В., Казаков Е.Н., Онищенко Н.А. Трансплантация клеток костного мозга для лечения сердечной недостаточности. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2004; 4: 27 34.
31. Hasper D., Hummel М., Kleber F.X. Systemic inflammation in patients with heart failure. European Heart J. 1998; 19: 761 5.
32. Levine T.B., Levine A.B., Bolenbaugh J., Green P.R. Reversal of heart failure remodeling with age. Am. J. Geriatr. Cardiol. 2002; 11 (5): 299 304.
33. Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза. М.: Медицина 1985: 256.
34. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера 2003:
35. Uemura R., Xu М., Ahmad N., Ashraf M. Bone marrow stem cells prevent left ventricular remodeling of ischemic heart through paracrine signaling. Circ. Res. 2006; 98: 141421.
А
