Комплексная оценка иммунного гомеостаза периферической крови и слизистой оболочки толстой кишки в норме Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

2. Епифанова О.И., Терских В.В., Захаров А.В. Радиоавтография. М.: Высшая школа, 1977. 246 с.

3. Завалиягана Л.Э., Литвинова Л.В. // Архив пат. 1997. №4. С. 63-65.

4. Нестерчук С.Л., Сулейманова Н.С., Ткаченко

Э.Р. и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1994. №1. С. 68-71.

5. Останин А.А., Макагон А.В., Леплина О.Ю. и др. // Медицинская иммунология. 2001. Т. 3. №4. С. 515-524.

6. Рук-во по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С.В. Петрова и Н.Т. Райхлина. Казань, 2000. 288 с.

7. Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты / Под ред. В. А. Козлова, С.В. Сенникова. Новосибирск: Наука, 2004. С. 255-269.

8. Стандартизация методов иммунофенотипиро-вания клеток крови и костного мозга человека: Метод. рек. // Мед. иммунология. 1999. Т.1. №5. С. 21-43.

9. Система цитокинов и болезни органов дыхания / Под ред. Б.И. Гельцера, Е.В. Просековой. Владивосток: Дальнаука, 2005. 255 с.

10. Тимошин С.С., Панькова Т.Д., Титов М.И. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1987. Т.104. №8. С. 229-230.

11. Фрейдлин И.С., Кузнецова С.А. // Медицинская иммунология. 1999. Т.1. №1-2. С.27-36.

12. Bona С., Bonilla F. Textbook of immunology. Amsterdam, 1996. 406 p.

13. KipsJ., Toumoy K.G., Pauwels R.A. // Eur.Respir. J. 2001. Vol. 17, P. 499-506.

□ □□

УДК 612.017.2 :612.11:612.36

Т.Ф. Боровская, Е.В. Пичуева, Е.А. Левкова, Е.В. Мокрецова

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОЛСТОЙ КИШКИ В НОРМЕ

Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; Дальневосточный государственный медицинский университет, г. Хабаровск

Иммунная система представляет собой сложнейший механизм взаимодействия органов, тканей и отдельных иммунокомпетентных и дополнительных клеток, обеспечивающих устойчивый гомеостаз организма в различных условиях окружающей среды. Лимфоидные клетки интенсивно рециркулируют между лимфоидными органами и нелимфоидными тканями через лимфатические сосуды и кровь [10], осуществляя иммунный контроль в организме.

Лимфоидная ткань включена в структуру собственной пластинки слизистых оболочек, в том числе желудочно-кишечного тракта. Кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань содержит не менее чем 50-60% всех лимфоцитов тела человека [2] и представлена диффузно распределенными в эпителии лимфоцитами, плазматическими клетками, фагоцитами, а также одиночными лимфоидными фолликулами, расположенными под эпителием в слизистой оболочке

и в подслизистой основе на всем протяжении пищеварительного тракта [7].

Под действием специфических (тканевых, бактериальных, вирусных и др.) и неспецифических мито-генов (в том числе растительных лектинов - конкана-валина А (КонА) и фитогемагглютинина (ФЕ А) бластогенеза возможна трансформация лимфоцитов в малодифференцированные клетки — пролимфоциты, лимфобласты. С помощью метода авторадиографии установлено, что большие и средние лимфоциты в метаболическом отношении активнее малых лимфоцитов [3]. Процесс активаций лимфоцитов в присутствии митогенов расценивается как важный показатель функционального состояния Т- и В-клеточного звеньев иммунитета. Определенное соотношение количественного состава иммунокомпетентных клеток с их функциональной способностью позволяет сохранять тканевой гомеостаз того или иного органа и организма в целом.

Материалы и методы

С целью выявления количественного состава и функционального состояния лимфоцитов периферической крови (ПК) и слизистой оболочки толстой кишки (СОТК) у здоровых лиц эндоскопическим методом было обследовано 17 чел. добровольцев в возрасте 18-20 лет, у которых в анамнезе отсутствовало указание на наличие острых и хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта. Морфологическое состояние СОТК соответствовало описанию нормы, а бактериологические исследования кала были отрицательными.

Мононуклеары ПК выделяли методом градиентного центрифугирования. Выделение лимфоцитов СОТК проводили по методу C.JI. Нестерчука с соавт. [5]. Мембранные маркеры различных клонов имму-нокомпетентных клеток идентифицировали иммуно-флюоресцентным методом с помощью моноклональных антител отечественного производства серии ИКО (ВОНЦ РАМН) [1, 4]. Популяционный и субпопу-ляционный анализ лимфоцитов осуществляли на проточном цитометре FACScan (“Becton Dickinson”).

Функциональное состояние лимфоцитов ПК и СОТК определяли в реакции бласттрансформации. После выделения лимфоцитов на градиенте плотности их 3-кратно центрифугировали в среде 199 при 200 g по 5 мин, после чего клетки концентрировались до 1x106 на 1 мл в культуральной среде 199, содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, Hepes (5 мМ), глутамин (20 мМ), мо-номицин (100 ЕД/мл). Лимфоциты культивировали в плоскодонных 96-луночных платах (Falkon 3040 “Flow Labs”) по 2х105 клеток в 200 мкл среды на лун-

Таблица 1

Сравнительная характеристика иммунологических показателей ПК и СОТК в норме

Показатели ПК, п=10 СОТК, п-10 Р

Лимфоциты 1,22+1,22 2,16+0,88 >0,05

CD3+ (Т-кл.) 84,50±3,83 34,33+6,33 <0,001

CD4+ (Т-хелперы) 50,22±3,74 27,81+7,33 <0,05

CD5+ (Т-,В- кл.) 55,83±4,41 35,41+5,76 <0,05

CD7+ (Т-, NK- кл.) 62,21+7,53 31,63+6,34 <0,01

CD8+ (Т-супрессоры) 39,94±5,70 19,88±2,67 <0,0!

CD16±(NK- кл.) 17,61±6,77 15,59+3,62 >0,05

CD22+ (В-кл.) 30,63±3,75 24,41+4,52 >0,05

CD25+ (акт.Т, В) 36,33+5,05 23,02±4,19 <0,05

HLA-DR (акт. Т-, все В-кл.) 30,52±2,49 20,71+4,87 >0,05

CD38+ (акт.Т-, В-кл.) 35,80+5,31 26,1+4,88 >0,05

CD71 + (пролифер. кл.) 37,52+4,31 24,14±4,81 <0,05

Thy-1 ( ранние тимоциты) 36,80+4,14 31,78±4,28 >0,05

HLA-1 (Т-лимфоциты) 60,62*6,70 46,48+6,25 <0,001

CD95+ (кл., оносред. апоптоз) 39,42±7,63 18,28+2,34 <0,05

IgG (тяжелые у- цепи) 38,19+4,14 30,12+5,33 >0,05

IgM ( тяжелые р.- цепи) 38,88±5,62 25,13±5,98 >0,05

Резюме

Целью настоящей работы явилось исследование количественного состава и функционального состояния лимфоцитов периферической крови и слизистой оболочки толстой кишки у здоровых лиц. Выявлено, что количественный состав клеток лимфоидного ряда в периферической крови здоровых лиц по всем показателям выше, чем в слизистой оболочке. Имеются функциональные особенности активности клеток на различных стадиях их дифференцировки, что указывает на очень высокие резервные возможности как периферического, так и тканевого иммунитета у здоровых лиц.

T.F. Borovskaya, E.V. Pichueva, Е.А. Levkova,

E.V. Mokretsova

COMPLEX ESTIMATION OF PERIPHERAL BLOOD AND LARGE BOWEL MUCOUS IMMUNE HOMEOSTASIS UNDER NORMAL CONDITIONS

Khabarovsk subsidiary of state organization Far-eastem research center of respiratory pathology and physiology Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences -Mother and child care institute, Khabarovsk

Summary

The aim of this investigation was to examine quantitative content and functional state in peripheral blood lymphocytes and large bowel mucous lymphocytes in healthy persons. It was revealed, that quantitative content of peripheral blood lymphocytes is higher by all indexes in comparison with mucous.

There are some functional peculiarities of cell activity in separate stages of their differentiation. This fact reflects powerful reserve abilities both in peripheral and tissue immunity in healthy persons.

ку при 37°C в атмосфере 5% C02 в течение 72 ч. В качестве митогенов использовали ФГА-Р ("Difco") и КонА (“Sigma”) в конечных концентрациях 50 и 20 мкг/мл соответственно. Митогены вносили в лунки в объеме 20 мкл на лунку [8]. После инкубации за 20 мин до конца культивирования добавляли по 20 мкл 3% глутаровый альдегид. Осадок тщательно перемешивали и делали мазки. Мазки фиксировали в метаноле, окрашивали по Романовскому-Гимза. Подсчет клеток производили равномерно через всю площадь мазка [6].

Результаты и обсуждение

Проведенные нами исследования показали, что число клеток лимфоидного ряда в ПК здоровых лиц по всем показателям выше, чем в СОТК (табл. 1).

Популяция клеток лимфоидного ряда разнородна и состоит из множества групп, подгрупп и клонов клеток с различными функциональными свойствами, специфичностью рецепторов, распознающих антигены. Как показано в табл. 1, содержание Т-лимфоци-тов в периферической крови в 2,5 раза выше, чем в СОТК, а В-лимфоцитов в 1,25 раза. Индекс соотношения Тл/Вл в ПК равнялся 2,76, а в СОТК — 1,41. При этом уровни В-лимфоцитов и клеток, несущих на мембране рецепторы к молекулам IgG (тяжелые у

цепи) и (тяжелые ц-цепи), в ПК и СОТК не имели достоверных отличий. На мембранах Т-лимфоцитов содержатся также рецепторы ^М, реже ^А,

^Е. При этом их плотность не превышает 100-300 плотности иммуноглобулиновой рецепции В-лимфо-цитов (50 000-100 000). Зрелые В-лимфоциты несут на своей поверхности встроенные в плазматическую мембрану иммуноглобулиновые рецепторы классов М, О, А, Е, Б, к компонентам комплемента — СЗ, С4, С5, С1д, митогенам и др. Лимфоциты интенсивно циркулируют в организме. Постоянный обмен между клетками различных лимфоидных органов обеспечивает функционирование лимфоидной ткани как единого целого, обусловливает генерализацию иммунных реакций организма. Феномен рециркуляции лимфоцитов имеет большое значение в процессах резорбции антигенов в кишечнике и обеспечении локальных факторов защиты.

Одной из основной функций иммунной системы является распознавание, нейтрализация и своевременное выведение из организма генетически чужеродных субстанций. Распознавание антигенов осуществляется рецепторами поверхностных мембран клеток. Презентированный антиген воспринимается как чужеродный прежде всего Т-клетками индукторно-хел-перного ряда, которые стимулируют цитотоксические Т-, а также В-лимфоциты. По-видимому, достоверно высокий уровень Т-лимфоцитов (СОЗ+), Т- и В-лим-фоцитов (С05+), Т-хелперов (СБ4+) и Т-цитоток-сических клеток (СС8+) свидетельствует о более высокой антигенной нагрузке на лимфоциты в ПК по сравнению с показателями СОТК (табл. 1). Иммунный ответ на антиген, опосредуемый Т-лимфоцита-ми, является каскадным процессом, протекающим с участием большого количества регулирующих агентов [11]. В результате действия различных медиаторов происходит активация различных клонов лимфоцитов, их дифференцировка и пролиферация. Имеющий место в ПК высокий уровень активированных лимфоцитов, секретирующих интерлейкин-2 (СВ25+), пролиферирующих лимфоцитов, несущих на мембране рецепторы к трансферину (СГ)71+), сопровождается увеличением уровня клеток, опосредующих апоптоз (СБЭ5+) (табл. 1), что, возможно, свидетельствует о компенсаторно-приспособительной реакции, посредством которой создается невосприимчивость к эндо- и экзогенным веществам, агентам инфекционной и неинфекционной природы. Кроме того, нами в ПК выявлен достоверно высокий, по сравнению с аналогичными показателями в СОТК, уровень Т-эффекторов, натуральных киллеров (СБ7+) и клеток главного комплекса гистосовместимости первого класса (НЬА-1), что указывает на активацию цитотоксической функции лимфоцитов. В результате воздействия антигена запускается процесс лимфонеогенеза, пролиферации и дифференцировки клеток и в пре-, интра-, и посттимических стадиях лимфоциты приобретают распознающие структуры — рецепторы для антигенов, фенотипическую диффе-ренцировку различных популяций [11], в том числе цитотоксического ряда. То есть клеточной рецепции принадлежит важная роль в течении различных патологических процессов, в том числе воспалительных.

Таблица 2

Сравнительная характеристика функционального состояния лимфоцитов ПК и СОТК в норме

Показатели ГІК, п-1 СОТК, п=7 Р

Лимфоциты (х109/л) 2,68+0,11 0,95+0,04 <0,001

РБТЛ - спонтанная 54,00+3,87 20,4+4,35 <0,001

РБТЛ - ст. ФГА (малые - 6-8 мк) 15,71+3,35 6,85+2,00 <0,05

РБТЛ - ст. ФГА (средние - 8-12 мк) 7,29±2,12 8±2,12 >0,05

РБ'ГЛ - ст. ФГА (большие - 12 мк и более) 10,29±1,14 33,7+10,27 <0,05

РБТЛ - ст. ФГА (бластные формы) 66,71+5,29 37,14+8,67 <0,05

РБТЛ - ст. КонА (малые - 6-8 мк) 2,86±1,94 4+1,27 >0,05

РБТЛ - ст. КонА (средние - 8-12 мк) 2,43+1,54 8,42+1,49 <0,05

РБТЛ - ст. КонА (большие - 12 мк и более) 5,00±2,16 26,42±6,05 <0,01

РБТЛ - ст. КонА (бластные формы) 75,43± 13,55 61,14±6,30 .. ... >0,05

Примечание, р — достоверность различий в сопоставляемых группах.

Помимо функции распознавания антигена клеточные иммунные реакции включают активацию и трансформацию Т-лимфоцитов, усиление их функциональной активности, в том числе цитокинпродуцирующей, цитотоксической и многих других, что подтверждается результатами исследования клеток лимфоидного ряда в реакции бласттрансформации.

Известно, что интенсивное деление лимфоцитов с последующей их дифференцировкой приводит к накоплению эффекторных клеток, а характер и степень выраженности реакции бласттрансформации зависит от состояния макроорганизма, природы и концентрации антигена (митогена), источника лимфоцитов — периферическая кровь, ткань лимфоидных и нелимфоидных органов.

В табл. 2 представлены сравнительные результаты исследования степени бласттрансформации лимфоцитов ПК и СОТК и особенности влияния различных митогенов (КонА и ФГА) на процесс бласттрансформации клеток. Как показано в таблице, число лимфоцитов, выделенных из ПК, с высокой степенью достоверности превышает число лимфоцитов, выделенных из СОТК (р<0,001). В ПК спонтанная бласт-трансформация лимфоцитов в 2,6 раза выше по сравнению с реакцией лимфоцитов СОТК (р<0,001). В присутствии неспецифического митогена фитогемаг-глютинина (ФГА) число малых лимфоцитов, не подвергшихся бласттрансформации, в ПК больше, чем в СОТК (р<0,05), а число средних и больших (р<0,05) лимфоцитов преобладает в СОТК. Способность отвечать трансформацией в активные лимфоциты в присутствии ФГА у лимфоцитов ПК выражена почти в 2 раза больше, чем у лимфоцитов СОТК (р<0,05). В присутствии другого неспецифического митогена — КонА — абсолютное значение малых, средних (р<0,05) и больших (р<0,001) лимфоцитов, не подвергшихся бластной трансформации, больше в

СОТК, чем в ПК, с различной степенью достоверности. Число бластных форм, образовавшихся в ответ на действие КонА в ПК, в 1,2 раза выше, чем в СОТК.

Кроме того, проводя сравнительный анализ клеточной трансформации в присутствии различных мито-генов (ФГА и КонА), выявили, что готовность отвечать трансформацией в бластные формы в присутствии как ФГА, так и КонА у лимфоцитов ПК выражена больше, чем у лимфоцитов СОТК. Согласно результатам исследования, число клеток, ответивших трансформацией в активные лимфоциты под действием обоих неспецифических митогенов, в ПК в 1,2-1,8 раза (р<0,001) превышает число неактивированных лимфоцитов в сравнении с показателями в СОТК.

Наряду с этим отмечается значительное превышение числа бластных форм, образовавшихся в присутствии КонА по сравнению с ФГА как в ПК, так и в СОТК, причем в СОТК это различие более выражено.

Таким образом, резервные возможности иммунных клеток, ПК и СОТК у здоровых лиц очень высокие, причем лимфоциты Г1К более активно подвергается как спонтанной, так и стимулированной бласттрансформации. Согласно данным литературы, лимфоциты ПК при культивировании их in vitro обнаруживают специфические маркеры в ответ на стимуляцию. Например, если предварительно сенсибилизированные лимфоциты культивируются в течение 5-6 дн., то часть из них подвергается трансформации, превращаясь в молодые бластные клетки. Феномен активного бластообразования может наблюдаться только в том случае, если лимфоциты были предварительно сенсибилизированы соответствующим антигеном [9]. По мнению авторов, такой контакт может иметь место в токе крови, так как лимфоциты, рециркулируя в организме, подвергаются постоянной стимуляции и соответ-■ ственно готовы к спонтанной трансформации. Их сенсибилизация может быть обусловлена различными антигенами, межклеточными медиаторами, в том числе цитокинами.

Выводы

1. Популяционный и субпопуляционный уровень клеток лимфоидного ряда в ПК здоровых лиц выше, чем в СОТК, независимо от функциональных особенностей того или иного клона клеток.

2. Спонтанная и стимулированная митогенами функциональная активность лимфоцитов ПК выше, чем клеток лимфоидного ряда СОТК.

3. Активность лимфоцитов ПК и СОТК выше при действии КонА, чем ФГА.

Работа выполнена при поддержке Регионального общественного фонда содействия отечественной медицине.

Литература

1. Барышников А.Ю. // Гематол. и трансфузиол. 1990. №8. С. 4-7.

2. Бурмистрова АЛ. Иммунный гомеостаз и мик-росимбиоценоз. Метаморфозы и пути развития воспалительных заболеваний кишечника. Челябинск: Дом печати, 1997. 216 с.

3. Донцов В.И. Иммунобиология постнатального развития. М.: Наука, 1990. 152 с.

4. Королева А.М., Барышников А.Ю., Виха Г.В. и др. // Биотехнология. 1993. №11. С. 61-63.

5. Нестерчук Л.С. Сулейманова Н.С., Ткаченко

Э.Р. и др. // Бюл. экспер. биол. 1994. №1. С. 68-71.

6. Самойлина НЛ. // Лаб. дело. 1970. №8. С. 455-463.

7. Сапин М.Р., Этингер Л.Е. Иммунная система человека. М.: Медицина, 1996. 304 с.

8. Серов А.А., Филатов А.В., ГЦербухин В.В. и др. // Иммунология. 1984. №6. С. 86-89.

9. Снежневский А.В., Вартанян М.Е. 1970. http: //www.psychiatry.ru /library/ lib/article. php4?Booknumber =26&article_id=20.

10. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. // Иммунология. М.: Медицина, 2000. 430 с.

11. Nossal G.J. // Amer. J. Anat. 1984. Vol.170, № 3. P. 253-259.

□ □□