CC BY
55
УДК 618.11-006.6-091.8
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА И МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ
ПРОГНОЗА РАКА ЯИЧНИКОВ
А.В. Шульга; C-А. Ляликов, к.м.н, доцент; В.А. Басинский, д.м.н, профессор УО «Гродненский государственный медицинский университет»
Проведено морфологическое исследование 69 овариальных карцином различного гистологического строения. Во всех случаях были определены экспрессия Е-кадхерина, /-катенина, циклинов B1 и D1, p53 и с-егЬВ-2 онкопротеинов, рецепторов к прогестерону и эстрогенам. С помощью методов математического моделирования изучена значимость комплекса клинико-морфологических и иммуногистохимических показателей для прогнозирования риска появления метастазов и общей выживаемости больных после операции.
Ключевые слова: рак яичников, иммуногистохимия, Е-кадхерин, /-катенин, циклин B1, циклин D1, p53 и с-erbB-2 онкопротеины, рецепторы к прогестерону и эстрогенам, прогноз.
Morphological investigation of 69 cases ofovarian carcinoma of various histological types was carried out. Expression of E-cadherin, /-catenin, cyclin B1 and D1, p53, с-erbB-2 oncoproteins, estrogen and progesterone receptors was investigated in all cases. Mathematical models for prognosis ofthe general survival period after operation and occurrence of metastases were constructed taking into account clinico-morphological parameters and level of markers expression.
Key words: ovarian cancer, immunohistochemistry, E-cadherin, /-catenin, p53, с-erbB-2 oncoproteins, cyclin B1, cyclin D1, estrogen and progesterone receptors, prognosis.
Введение
Рак яичников (РЯ) занимает шестое место по частоте среди злокачественных новообразований у женщин и составляет 4-6% от их общего объема. Ежегодно в мире регистрируется более 200 тыс. новых случаев овариальных карцином, при этом 5-летняя выживаемость у таких больных даже при высоком уровне медицинской помощи составляет около 40% [8]. Согласно эпидемиологическим исследованиям, в настоящее время отмечается отчетливая тенденция к росту заболеваемости женщин злокачественными опухолями яичников [1], так в Республике Беларусь за последние 35 лет она увеличилась практически в 2 раза [5]. Таким образом, углубление знаний о патогенезе РЯ является актуальной задачей, поскольку будет способствовать совершенствованию методов диагностики и лечения.
Стандартным способом исследования роли клеточных поломок в прогрессии опухоли является оценка их связи с метастатическим потенциалом новообразования и продолжительностью жизни больного. К настоящему времени накоплено большое количество данных о морфологических и иммуногистохимических (ИГХ) особенностях РЯ, однако в большинстве работ, посвященных этой теме, отсутствует комплексный подход, необходимый для оценки биологической агрессивности опухоли [6]. Как правило, исследуется патогенетическая значимость только отдельных факторов без учета характера их взаимосвязи. Вероятно, поэтому такие характеристики, как клиническая стадия, размер остаточной опухоли после ци-торедуктивной операции, степень злокачественности, гистологический тип овариальной карциномы имеют прогностическое значение [11], но используемые по отдельности, не позволяют с достаточной точностью оценить риск метастазирования и возможную продолжительность безрецидивного течения болезни у больных [10]. По данным литературы, для определения клинического прогноза могут быть полезны показатели, выявляемые ИГХ методами [2], среди них такие, как адгезивные молекулы, онкопротеины р53 и с-егЬВ-2, рецепторы прогестерона (РП) и эстрогенов (РЭ), а также регуляторы клеточного цикла, в частности, циклины В1 и D1. Вместе с тем, литературные данные об их патогенетической роли и направленности связи с клиническими характеристиками весьма противоречивы [3, 9].
Комплексная оценка значимости отдельных факторов для прогноза течения РЯ с использованием методов многофакторного анализа может в значительной степени объективизировать представления об их патогенетической роли [4].
Цель исследования: провести комплексный анализ значимости клинико-морфологических и ИГХ характеристик РЯ в оценке прогноза новообразования с помощью методов математического моделирования.
Материал и методы
Исследование выполнено на архивном гистологическом материале 69 больных, оперированных по поводу РЯ в период с 1999 по 2002 гг. Критерием отбора послужили максимально приближенные стандартные схемы оперативного и адьювантного лечения. Наиболее частым гистологическим типом РЯ был серозный (49), в 8 наблюдениях выявлена эндометриоидная аденокарцинома, в 7 случаях - светлоклеточный рак, а в 5 - муциноз-ный вариант новообразования. При этом в 14 наблюдениях степень дифференцировки рака была отнесена к G1, в 35 - к G2, а в 20 - к G3. Первая стадия, согласно классификации FIGO, была установлена у 15 женщин, вторая -у 12, а генерализация процесса наблюдалась в 42 случаях (третья стадия - 37, четвертая - 5). Анализ гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по ван Гизону проводился согласно классификации ВОЗ.
ИГХ исследование проводили на серийных парафиновых срезах с использованием антител (Ат) фирмы DakoCytomation. Оценка экспрессии молекул клеточной адгезии (Е-кадхерина, р-катенина) проводилась по методике, предложенной С. Gamallo с соавторами [7]. Заключение о наличии ядерной и (или) цитоплазматической гиперэкспрессии циклинов В1, D1 и мутантного типа р53 (mt р53) делалось в случае окрашивания более чем 10% опухолевых клеток. Подсчет мембранной экспрессии с-егЬВ-2 проводили согласно балльной системе Herceptest™. Анализ экспрессии РП и РЭ проводился с помощью метода, предложенного Ж Remelle с соавторами [12].
Статистическая обработка проводилась с использованием стандартного пакета прикладных программ Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение
В ходе исследования выявлена значительная морфологическая гетерогенность РЯ, касающаяся гистологических вариантов, степени дифференцировки, стромаль-но-паренхиматозных взаимоотношений, выраженности некрозов, кровоизлияний, лимфоплазмоцитарной инфильтрации, морфометрических параметров ядер. Оценка прогностического значения морфологических параметров показала, что практическое их применение ограничено определенным гистологическим вариантом, клинической стадией и другими признаками овариальных карцином. В частности, при 1-11 клинических стадиях наибольший процент больных, проживших более 5-ти лет, был в группе с эндометриоидным и муцинозным вариантами РЯ, а наименьший - при светлоклеточном гистологическом строении новообразований (%2=11,8, р=0,008). При 1-11 клинических стадиях серозного РЯ низкая степень дифференцировки, меньшая площадь стромы в первичной опухоли сопровождались снижением 5-летней выживаемости больных (%2=7,1, р=0,029, Z=-2,0, р=0,045, соответственно). В эндометриоидных опухолях большая площадь некрозов была ассоциирована с ростом их метастатического потенциала (Н=3,9, р=0,049).
Данные ИГХ исследования показали, что в опухолевых клетках серозного гистологического варианта низкой степени дифференцировки распространенность и интенсивность экспрессии Е-кадхерина статистически значимо ниже, чем в высокодифференцированных опухолях (Н=10,3, р=0,006; Н=6,3, р=0,04з, соответственно). У пациентов с серозным РЯ при наличии регионарных и отдаленных метастазов определялась более низкая экспрессия Е-кадхерина и р-катенина (и=2,0, р=0,0004; и =44,0, р=0,029, соответственно), чем при их отсутствии. Общая и безрецидивная выживаемость была достоверно связана с суммарной экспрессией Е-кадхерина в первичной серозной опухоли ^=-3,4, р=0,0006; Z=-3,5, р=0,0005, соответственно): низкой выживаемости сопутствовало угнетение экспрессии. Наличие р-катенина в ядрах клеток опухолей эндометриоидного гистологического строения свидетельствует об относительно благоприятном прогнозе заболевания.
При Ш-ГУ клинических стадиях серозного РЯ выявлены более высокие значения экспрессии циклина D1, чем при Г-ГГ (и=113,5, р=0,012). Наличие ядерной гиперэкспрессии циклина D1 в клетках сопряжено с низкой общей выживаемостью ^=2,3, р=0,023). Уровень экспрессии циклина В1 в высокодифференцированных серозных опухолях ГГГ-ГУ клинических стадий был достоверно выше, чем в низкодифференцированных (Н=5,8, р=0,049).
Повышение уровня экспрессии mt р53 существенно чаще обнаруживалось при наличии метастазов карциномы (и=49,5, р=0,046) и сочеталось со снижением общей выживаемости у больных серозным РЯ ^=2,2, р=0,027).
Гиперэкспрессия сегЬВ-2 при серозном варианте РЯ сопровождалась снижением как общей, так и безреци-дивной выживаемости ^=2,2, р=0,026; Z=2,2, р=0,029, соответственно). При эндометриоидном и светлоклеточном гистологических типах новообразования данный маркер не имел прогностической ценности.
Отсутствие или низкий уровень экспрессии РП в опухоли при серозном РЯ были характерны для больных с низкой общей и безрецидивной выживаемостью ^=-2,49, р=0,013; Z=-2,66, р=0,008, соответственно).
Комплексная оценка значимости влияния клиникоморфологических и ИГХ факторов на показатели выжи-
ваемости и метастатический потенциал проводилась с помощью регрессионного и дискриминантного анализов. Исходно, в качестве независимых переменных были использованы 17 факторов: степень дифференцировки рака (G), клиническая стадия (использовалась только для расчета ожидаемой продолжительности жизни), процент положительно окрашенных клеток и интенсивность реакции с Ат к РП, РЭ, Е-кадхерину, р-катенину, интенсивность экспрессии циклинов В1 и D1 в ядре и цитоплазме, процент положительно окрашенных клеток и интенсивность реакции с Ат к mt р53, и интенсивность экспрессии с-егЬВ-2.
Исследование связи между ожидаемой продолжительностью жизни больных РЯ и независимыми переменными производилось с помощью множественного регрессионного анализа (метод Backward stepwise). В результате было установлено, что 6 факторов, приведенных в таблице 1, описывают 61% дисперсии зависимой переменной (ожидаемой продолжительности жизни). Полученная регрессионная модель характеризуется следующими показателями: множественный коэффициент корреляции равен 0,78 (R2=0,61), F=15,91, p=6*10-11, стандартная ошибка оценки равна 19,73.
Таблица 1 - Статистическая характеристика независимых переменных, включенных в регрессионную модель
Независимые переменные В Std.Err. t Р
Константа 77,47 11,09 6,98 2* 10"9
Клиническая стадия (FIGO) -19,55 2,93 -6,67 8* 10"9
Интенсивность экспрессии циклина В1 в цитоплазме 2,85 2,02 1,41 0,16
Интенсивность экспрессии циклина D1 в ядре -9,68 3,13 -3,09 0,003
Процент клеток, экспрессирующих ?-катенин 2,92 2,43 1,2 0,23
Процент клеток, экспрессирующих РП 4,72 2,32 2,03 0,04
Интенсивность экспрессии с-erbB-2 -6,01 2,73 -2,19 0,03
Чтобы рассчитать ожидаемую продолжительность жизни больных РЯ, необходимо подставить в приведенную ниже формулу вместо переменных mp m2, ... m6 их значения для анализируемого случая:
Y = 77,47 - 19,55 m+2,85 m2 - 9,68 m+2,92 m4+4,72 m5
- 6,01 m,
7 6
где: Y - ожидаемая продолжительность жизни в месяцах; mt - клиническая стадия; m2 - интенсивность экспрессии циклина В1 в цитоплазме; m3 - интенсивность экспрессии циклина D1 в ядре; m4 -процент клеток, экспрессирующих р-катенин; m5 - процент клеток, экспрессирующих РП; m6 - интенсивность экспрессии с-егЬВ-2 в клеточных мембранах.
Приведенная модель наглядно демонстрирует, какие факторы наиболее тесно связаны с продолжительностью жизни больных РЯ. Величина коэффициента говорит о том, на сколько месяцев изменится продолжительность жизни при изменении фактора на 1 единицу, знак перед коэффициентом показывает, в каком направлении произойдет изменение (минус - уменьшение, плюс - увеличение).
Оценка метастатического потенциала производилась с помощью дискриминантного анализа. Метод Backward stepwise позволил выделить из 17 исходных факторов 11 наиболее значимых. Для расчета риска возникновения
метастазов необходимо подставить в приведенные ниже формулы вместо переменных т1, т2, ... т11 их значения для анализируемого случая:
у1 = -1,48 т1 + 1,94 т2 + 1,36 т3+0,28 т4+4,37 т5 + 0,19 т6+0,70 т7 - 1,02 ш8+0,;22 т9+1,28 т10+0,55 т11 - 13,35
у2 = - 0,89 т1+2,31 т2 - 0,53 т3 + 0,95 т4 + 0,98 т, + 0,92 т6 - 0,62 т7 - 1,52 т8 - 1,32 т9 + 2,04 т10 + 1,55 т11- 8,82
где: т1 - экспрессия циклина В1 в ядре; т2 - экспрессия циклина В1 в цитоплазме; т3 - экспрессия циклина D1 в ядре; т4 - экспрессия циклина D1 в цитоплазме; т5 - процент клеток, экспрессирующих Е-кадхерин; т6 - интенсивность реакции с Ат к РП; т7 - процент клеток, экспрессирующих РП; т8 - интенсивность реакции с Ат к РЭ; т9 - процент клеток, экспрессирующих РЭ; т10 - интенсивность реакции с Ат к mt р53; т11 - величина экспрессии с-егЬВ-2 в клеточных мембранах.
Окончательное заключение дается на основании сравнения вычисленных показателей у1 и у2: если у1 > у то риск возникновения метастазов минимальный, а если у1 < у2 - риск возникновения метастазов высокий. Чем больше различие у1 и у2 тем выше достоверность прогноза.
Результаты использования этой модели для прогнозирования риска возникновения метастазов у больных РЯ представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Результат испытания разработанной модели
Данные катамнеза Положительный прогноз Отрицательный прогноз Bсего
Метастазы образовались 55 1 5б
Метастазы отсутствовали 1 12 13
Всего 5б 13 б9
При оценке качества модели методами доказательной медицины было установлено, что ее чувствительность составляет 98,21%, специфичность - 92,31%, прогностическая ценность положительного результата -98,21%, прогностическая ценность отрицательного результата - 92,31%, отношение правдоподобия - 12,77.
Данная модель хорошо визуализирует вклад каждого из отобранной совокупности значимых факторов в метастатический потенциал опухоли: если коэффициент, стоящий перед переменной во 2-м уравнении больше, чем коэффициент этой же переменной в 1-м уравнении, значит, этот фактор способствует метастазированию; чем больше различие, тем сильнее связь.
Таким образом, математические модели, построенные для прогнозирования развития метастазов и общей выживаемости больных РЯ на основании клинико-морфологических параметров и уровня экспрессии изучен-
ных ИГХ маркеров, характеризуются достаточной надежностью, позволяют с высокой точностью предсказать ожидаемую продолжительность жизни больных после оперативного лечения и метастатический потенциал опухоли, а также дают возможность оценить роль отдельных факторов, совместно принимающих участие в патогенезе опухолевого роста.
Добавление в обязательную ИГХ панель, определяемую в операционном материале больных РЯ, факторов, характеризующих адгезивные свойства опухолевых клеток, белков, принимающих участие в клеточном цикле, гормональных рецепторов позволяет объективизировать оценку биологического потенциала злокачественного новообразования.
Литература
1. Антонеева, И.И. Анализ срока жизни больных раком яичников в Ульяновской области, 1999-2005 гг. / И.И. Антонеева // Вопросы онкологии - 2007. - Т. 53, № 4. - С. 393-395.
2. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза: учеб. пособие / А.А. Новик [и др.] ; под ред. Ю.Л. Шевченко. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 224 с.
3. Новичков, Е.В. Зависимость прогноза рака яичников от экспрессии рецепторов к половым гормонам и пролиферативной активности опухолевых клеток / Е.В. Новичков, А.А. Вотинцев // Архив патологии. - 2006. - №. 2. - С. 10-13.
4. Новичков, Е.В. Способ прогнозирования продолжительности жизни больных серозной карциномой яичника в климактерическом периоде и постменопаузе / Е. В. Новичков // Вятский мед. вестник - 2005. - № 3-4. - С. 52-56.
5. Поляков, С.М. Злокачественные новообразования в Беларуси 1997-2006гг. / СМ. Поляков, Л.Ф. Левин, Н.Г. Шебеко; под ред. А.А. Граковича [и др.]. - Минск : БелЦМТИУЭ, 2007. - 198 с.
6. Bast, R.J. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation / R.J. Bast, B. Hennessy, G. Mills // Nat. Rev. Cancer.
- 2009. - Vol. 9, № 6. - P. 415-426.
7. Beta-catenin expression pattern in stage I and II ovarian
carcinomas: relationship with beta-catenin gene mutations,
clinicopathological features, and clinical outcome. / C. Gamallo [et al.] // Am. J. Pathol. - 1999. - Vol. 155, № 5. - P.527-536.
8. Cancer Statistics, 2008 / A. Jemal [et al.] // CA Cancer J. Clin.
- 2008. - Vol. 58. - P. 71-96.
9. C-erbB-2, p53, and nm23 proteins as prognostic factors in patients with epithelial ovarian carcinoma / S. Tomic [et al.] // Croat. Med. J. - 2003. - Vol. 44 - P. 429-434.
1 0 . Histological grading in a large series of advanced stage ovarian carcinomas by three widely used grading systems: consistent lack of prognostic significance / S. Kommoss [et al.] // Virchows Arch. -2009. - Vol. 454, № 3. - P. 249-256.
11. Ochiai, K. Prognostic factors of ovarian cancer / K. Ochiai / / Gan To Kagaku Ryoho. - 2006 - Vol. 33. - P. 2014-2019.
12. Remmele, W. Recommendation for uniform definition of an immunoreactive score (IRS) for immunohistochemical estrogen receptor detection (ER-ICA) in breast cancer tissue / W. Remmele, H.E. Stegner // Pathologe. - 1987. - Vol. 8, № 3. - P. 138-140.
Поступила 27.01.10
