КОМБИНИРОВАННЫЙ МЕТОД ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ПЦР ДЛЯ СКРИНИНГА ДИКОЙ СОИ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Научная статья

УДК 633.853.52:575:577.29

doi: 10.47737/2307-2873 2023 44 34

КОМБИНИРОВАННЫМ МЕТОД ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИИ ПЦР

ДЛЯ СКРИНИНГА ДИКОЙ СОИ

©2023. Бондаренко Ольга Николаевна1^, Лаврентьева Светлана Игоревна2

1,2Всероссийский научно-исследовательский институт сои, Благовещенск, Россия [email protected]

Аннотация. Изучение генетического разнообразия Glycine soja Sieb. & Zucc. проводили с использованием микросателлитных (SSR) маркеров, но метод требовал оптимизации определённых параметров ПЦР, один из которых - температура отжига праймера. Цель работы состояла в использовании комбинированного подхода в подборе оптимальных температур отжига SSR-праймеров с использованием современного in silico инструмента и традиционного экспериментального метода. Для 20 пар SSR-праймеров осуществили расчёт температур плавления (Tm) с помощью веб-версии программы OligoAnalyzer™ Tool. В опыте применяли ДНК сорта сои Лидия и формы дикой сои КТ-156. Был проведён предварительный анализ возможности образования у исследуемых пар праймеров шпилек, гомо- и гетеродимеров. Не выявили значимых вторичных структур только у 4 из 20 пар праймеров, фланкирующих локусы Satt470, Satt453, Satt005 и Satt571, остальные имели от 1 и более гомо- /гетеродимеров. Определения оптимальной температуры отжига (Та) проводили на готовой реакционной ПЦР смеси. Экспериментальным путём оптимизировали Та праймера, использовали градиентную настройку температурного режима амплификации. Для большинства праймеров при Та близкой к Tm отмечали побочные продукты амплификации. При выборе оптимальной Та каждого праймера руководствовались полученными экспериментальными данными. Восемь пар праймеров (по локусам Satt268, Satt565, Satt281, Satt517, Satt442, Satt431, Satt373, Satt590) показали себя наилучшим образом - оптимальная Ta была равна рассчитанной программой Tm. В итоге для 20 пар SSR-праймеров были определены оптимальные в данных условиях Ta. Полученные в исследовании результаты будут использованы для проведения молекулярно-генетического маркирования G. soja с помощью SSR-анализа. Выводы данного исследования подчёркивают важность экспериментальных методов в оптимизации условий ПЦР. Несмотря на широкое использование in silico инструментов в последнее время, они не могут полностью заменить экспериментальные подходы в оптимизации условий ПЦР для конкретных приложений.

Ключевые слова: Glycine soja, Glycine max, ПЦР, SSR-праймеры, температура отжига, амплификация ДНК, in silico анализ

Введение. Дикорастущие формы сои является важным этапом для улучшения диких

(Glycine soja Sieb. & Zucc.) являются важным форм и их адаптации к различным

источником генетических ресурсов для создания климатическим условиям, а также для развития

новых сортов и линий данной культуры, новых генетических ресурсов [4, 5]. устойчивых к различным стрессовым факторам SSR-анализ - это метод, который

[1, 2]. Одним из эффективных методов для используется для определения полиморфизма

изучения генетического разнообразия и микросателлитных локусов в геноме растений.

полиморфизма дикорастущих форм сои является Он является одним из наиболее достоверных и

анализ микросателлитных маркеров (Simple точных методов анализа молекулярной

Sequence Repeats, SSR-анализ). Изучение SSR- маркировки генома, который имеет множество

маркеров в геноме дикой сои позволяет получать применений в современной генетике [6, 7]. В

внутри- и межвидовую информацию о структуре частности, в исследованиях дикой сои SSR-

генов, определять генетическое разнообразие, анализ играет особенно важную роль [8-10].

изучать происхождение и историю популяций и Для его проведения подбирают праймеры -

т.д. [3]. Поэтому исследование SSR-маркеров короткие специфические последовательности

ДНК, повторяющие мотивы, которые фланкированы уникальными

последовательностями, обеспечивающими

опорную точку для амплификации через полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Пары праймеров разрабатывают на основе этих фланкирующих последовательностей, поскольку эти последовательности обычно с высокой степенью вероятности сохраняются [4]. Однако подбор праймеров для SSR-анализа дикой сои является сложной задачей, так как информация о генетическом уровне разнообразия, структуре популяции G. soja с использованием SSR-маркеров в литературе представлена в меньшей степени, и имеющиеся на сегодняшний день праймеры в большинстве своём адаптированы к геному Glycine max (L.) Merr. Кроме того, само проведение данного анализа связано с рядом особенностей, которые требуют определённых знаний и подходов, в частности, подбора праймеров и условий их отжига.

После того, как праймеры выбраны, необходимо провести их отжиг при определённых условиях, которые смогут значительно повысить специфичность ПЦР и уменьшить вероятность образования нежелательных продуктов амплификации. Один из основных параметров отжига - это температура. Точная температура отжига зависит от длины и состава праймеров, а также от особенностей ПЦР-системы. Оптимальная температура отжига (Та) может определяться градиентным термоциклером или путём последовательного изменения температуры в амплификаторе с фиксированными праймерами. Традиционно, анализ праймеров производится экспериментальными методами, но для этого требуется много времени, и поэтому использование in silico инструментов существенно упрощает данный процесс. Преимущество использования инструментов in silico для анализа праймеров состоит в их скорости и точности. Экспериментальный анализ требует применения методов, таких как электрофорез или спектрофотометрия, требующих большего количества времени и ресурсов, чем инструменты in silico. Кроме того, инструменты in silico могут предсказать оптимальные условия проведения ПЦР реакции и помочь избежать получения

нежелательных продуктов. Они могут позволить пользователям оптимизировать под свои условия ПЦР и повторно использовать праймеры, что сэкономит время и ресурсы.

Одним из инструментов для анализа праймеров является OligoAnalyzer™ Tool1. Этот инструмент используется для прогнозирования температуры плавления праймеров (Tm), анализа GC содержания и потенциальных гомодимеров или димеров. OligoAnalyzer™ Tool позволяет установить оптимальные условия для проведения ПЦР и получения желаемого продукта. Для проведения успешного эксперимента необходимо использовать праймеры, специфичные для искомой области ДНК, имеющие необходимую температуру плавления и длину, не образовывающие димеры или гомополимерные области. Предварительный анализ праймеров с помощью OligoAnalyzer™ Tool способствует упрощению этого процесса благодаря инструментам для анализа праймеров онлайн. Оптимизация условий ПЦР является критическим шагом для получения надёжных результатов. Цель исследования состояла в подборе оптимальных температур отжига SSR-праймеров с использованием современного инструмента in silico и традиционного экспериментального метода ПЦР для дальнейшего скрининга форм дикой сои.

Методика. Опыты проводили в 2023 г. на базе лаборатории биотехнологии ФГБНУ ФНЦ ВНИИ сои. Объектом исследования служили 20 пар SSR-праймеров, предложенных ранее коллективом авторов статьи2 в качестве предлагаемой маркерной системы для идентификации и паспортизации форм дикой сои (табл. 1) [11]. Для каждой из представленных пар праймеров была рассчитана температура отжига (веб-версия программы OligoAnalyzer™ Tool) и проведён предварительный анализ возможности образования праймерами шпилек, гомо- и гетеродимеров. Для каждой вторичной структуры было рассчитано значение стандартной энергии Гиббса (AG). В случае получения AG, равного -9 ккал/моль, или более отрицательного, предполагали, что данный олигонуклеотид может быть проблематичным для использования в ПЦР, при этом игнорировали структуры, AG образования которых больше -5 ккал/моль3.

1 https://eu.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer

2 https://rscf.ru/project/23-26-00076/

3 https://eu.idtdna.com/pages/support/faqs/how-do-i-

use-the-oligoanalyzer-tool-to-analyze-possible

hairpins-and-dimers-formed-by-my-oligo

Таблица 1

Характеристика используемых SSR-праймеров

Наименование локуса Последовательность фланкирующих праймеров (5'-3')4 Ожидаемый размер продукта ПЦР, п.н.

Satt236 f*; GCGTGCTTCAAACCAACAAACAACTTA; r**; CGGTTTGCAGTACGTACCTAAAATAGA; 227

Satt470 f; GACCATTATGCTTTTTCTCTTT; r; CTTTATCCTCCTCCATTAGTTCTA; 258

Satt453 f; GCGGAAAAAAAACAATAAACAACA; r; TAGTGGGGAAGGGAAGTTACC; 234

Satt556 f; GCGATAAAACCCGATAAATAA; r; GCGTTGTGCACCTTGTTTTCT; 163

Satt565 f; GCGCCCGGAACTTGTAATAACCTAAT; r; GCGCTCTCTTATGATGTTCATAATAA; 189

Satt281 f; AAGCTCCACATGCAGTTCAAAAC; r; TGCATGGCAC GAGAAAGAAGTA; 183

Satt005 f; TATCCTAGAGAAGAACTAAAAAA; r; GTCGATTAGGCTTGAAATA; 141

Satt002 f; TGTGGGTAAAATAGATAAAAAT; r; TCATTTTGAATCGTTGAA; 126

Satt268 f; TCAGGGGTGGACCTATATAAAATA; r; CAGTGGTGGCAGATGTAGAA; 235

Satt146 f; AAGGGATCCCTCAACTGACTG; r; GTGGTGGTGGTGAAAACTATTAGAA; 287

Satt517 f; CTTGTTGCCTTTAACACACTTCAT; r; TCAACTGAAAAAGGAAACTAGAATAATG; 264

Satt442 f; CCTGGACTTGTTTGCTCATCAA; r; GCGGTTCAAGGCTTCAAGTAGTCAC; 260

Satt571 f; GGGTAGGGGTGGAATATAAG; r; GCGGGATCCGCGGATGGTCAAAG; 156

Satt431 f; GCGTGGCACCCTTGATAAATAA; r; GC GCAC GAAAGTTTTTCTGTAAC A; 230

Satt588 f; GCTGCATATCCACTCTCATTGACT; r; GAGCCAAAACCAAAGTGAAGAAC; 168

Satt373 f; TCCGCGAGATAAATTCGTAAAAT; r; GGCCAGATACCCAAGTTGTACTTGT; 248

Satt022 f; GGGGGATCTGATTGTATTTTACCT; r; CGGGTTTCAAAAAACCATCCTTAC; 204

Satt173 f; TGCGCCATTTATTCTTCA; r; AAGCGAAATCACCTCCTCT; 198

Satt234 f; TGAGAGCAGGACATTTTT; r; TCTGC GAGTGTTTTCTG; 216

Satt590 f; GCGCGCATTTTTTAAGTTAATGTTCT; r; GCGCGAGTTAGCGAATTATTTGTC. 310

Примечание:* f - прямой праймер, ** r - обратный праймер.

При проведении ПЦР с исследуемыми праймерами в качестве стандартных образцов для анализа были использованы форма дикой сои КТ-156 и сорт сои Лидия (урожай 2022 г.), семена которых предоставлены лабораторией селекции и первичного семеноводства ФГБНУ ФНЦ ВНИИ сои. В экспериментальной части опыта семена сои первоначально проращивали согласно ГОСТ 12044-93 в рулонах фильтровальной бумаги в течение 7-и суток при температуре 25 °С. Проростки сои хранили при температуре -18 °С до проведения

4 https://soybase.org/resources/ssr.php

исследований. Выделение и очистка суммарной ДНК из 10 растений каждого вида была выполнена с использованием набора реагентов «ДНК-Экстран» для выделения геномной ДНК из растений (НПК «Синтол», Россия). Концентрацию двухцепочечной ДНК измеряли с помощью наноспектрофотометра «EzDrop 1000» (Blue-Ray, Тайвань). По результатам данного этапа, перед проведением амплификации, концентрацию образцов выделенной ДНК разбавляли до 100 нг/мкл. ПЦР осуществляли в финальном объёме

реакционной смеси 25 мкл: 12,5 мкл готовая реакционная смесь БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2*)(ООО «Биолабмикс», Россия), содержащая 100 мМ Трис-HCl, рН 8,5 (при 25°С); 100 мМ KCl, 0,4 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 4 мМ MgCh, 0,06 ед. акт./мкл Taq ДНК-полимеразы, 0,2 % Tween 20, стабилизаторы HS-Taq ДНК-полимеразы и красители; 10 нг образца выделенной ДНК; по 10 пМ прямого и обратного праймеров; 9,5 мкл стерильной воды. Амплификацию выделенных фрагментов ДНК сои проводили с помощью амплификатора CFX96 (Bio-Rad laboratories Inc., США) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 95 °С в течение 5 мин, затем 35 циклов при температурно-временном режиме:

денатурация - при 95 °С в течение 10 сек, отжиг праймера - при 45-61 °С (в зависимости от праймера) в течение 30 сек, элонгация - при 72 °С в течение 50 сек; финальная элонгация -при 72 °С в течение 12 мин. Продукты реакции были разделены методом электрофореза в 2 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в 0,5*ТВЕ с использованием камеры для горизонтального электрофореза SE-1 в течение 1,5-2 ч при силе тока 50 мА и напряжении 90 - 100 В. Визуализация осуществлена путём облучения геля ультрафиолетом с использованием гель-документирующей системы «GelDoc EZ» (BioRad laboratories Inc., США). Идентификацию аллелей микросателлитных локусов проводили с использованием программы Image Lab Version 6.0.1. Все экспериментальные опыты были проведены в трехкратной повторности.

Результаты. На первом этапе постановки опыта с использованием комбинированного подхода в оптимизации условий ПЦР с помощью инструментария OligoAnalyzer™ Tool произвели анализ температуры плавления праймеров. Важно помнить, что на Tm праймера значительно влияет концентрация ионов Mg2+, содержащихся в буфере для ПЦР, т.к. его положительный заряд экранирует

отрицательный заряд сахарофосфатного остова ДНК. Высокая концентрация магния может поднять Tm праймера в некоторых случаях на 10 градусов, при этом

увеличивается вероятность неспецифического связывания праймера с матрицей (misprimmg) и происходит образование побочных продуктов. Благодаря тому, что в веб-сервис, используемый в работе, встроен более совершенный способ предсказания температуры плавления, учитывающий термодинамические данные и вклад окружения для каждого азотистого основания в составе олигонуклеотида, был произведён наиболее точный расчёт Тщ. При этом учитывали состав реакционной смеси для проведения ПЦР, указанный в методической части. Отталкивались от параметров готовой реакционной смеси БиоМастер HS-Taq ПЦР-Со1ог (2*), которую в предыдущих работах коллектив авторов в рамках скрининга сортов культурной сои неоднократно использовал, в дополнительной коррекции состав смеси не нуждался [12]. Задача исследований в целом состояла исключительно в корректировке параметра температуры отжига праймеров. Проведённый анализ 20 пар праймеров показал возможность образования вторичных структур у некоторых из них (табл. 2).

Ни у одного из указанных олигонуклеотидов не выявлена способность к образованию шпилек при температурах, близких к Тщ праймера. В качестве примера приведена одна из возможных структур шпильки, которая могла бы образоваться при Тщ= 35,1 °С на последовательности прямого праймера, фланкирующего локус БаМ590, и создать вероятный альтернативный сайт посадки для полимеразы (рис. 1А). Из-за низких Тщ и высоких значений ДG игнорировали такие структуры. В результате анализа на возможность образования гомо- и гетеродимеров у 20 пар, только у 4-х из них, фланкирующих локусы БаП470, БаП453, Satt005 и Satt571, не выявили значимых вторичных структур. Для праймеров отметили наибольшее количество возможных гомодимеров - 4 ( из которых 3 имели ДG < -9 ккал/моль) и гетеродимеров - 5 ( из которых 2 имели ДG < -9 ккал/моль), последовательность которых фланкирует локус БаП590 (рис. 1 Б, В). Предположили возможность

затруднённого использования данной пары праймеров и некоторых других в дальнейшей работе (см. табл.2).

Таблица 2

Анализ исследуемых ББЯ-праймеров_

Наименование Наличие значимых вторичных структур (AG < -5 ккал/моль) Температура плавления праймеров (Тт), °С Оптимальная температура отжига (Та),

шпильки гомодимеры гетеродимеры °С

Satt236 0 0 3 59,7 60,2

Satt470 0 0 0 49,1 54,0

Satt453 0 0 0 52,9 54,2

Satt556 0 0 1 47,9 54,5

Satt565 0 2 1 59,1 59,1

Satt281 0 3 31* 55,8 55,8

Satt005 0 0 0 47,2 53,5

Satt002 0 0 3 45,9 49,4

Satt268 0 1 0 52,3 52,4

Satt146 0 11 0 53,6 55,2

Satt517 0 1 3 54,4 54,4

Satt442 0 0 2 54,2 54,2

Satt571 0 0 0 48,6 55,0

Satt431 0 0 2 54,4 54,4

Satt588 0 1 0 56,1 57,9

Satt373 0 31 0 52,7 52,4

Satt022 0 0 4 53,8 54,7

Satt173 0 0 2 46,8 55,5

Satt234 0 0 1 45,8 56,3

Satt590 0 43 52 56,8 56,9

Примечание: *количество значимых вторичных структур, ДG которых менее -9 ккал/моль

Второй этап оптимизации условий ПЦР заключался в использовании традиционного экспериментального метода. Была проведена оптимизация температуры отжига праймеров опытным путём. Для этого с каждой парой праймеров проводили ПЦР, где ДНК образцов сои амплифицировали согласно

установленному протоколу, изменяя Та в опыте с помощью градиентной установки температур амплификатора CFX96 с итоговым

увеличением на 3-7 °С от рассчитанной Тт. Выбор оптимального значения температуры отжига основывали на получении чётких, хорошо различимых амплифицированных фрагментов в характерном для каждого локуса диапазоне количества п.н. (рис. 2).

Delta G: -9.89 kcal/mol Base Pairs: 4

5 ' GCGCGCATTTTTTAAGTTAATGTTCT

3 ' CTGTTTATTAAGCGAT7GAGCGCG

Рис 1. Возможные вторичные структуры последовательности праймеров, фланкирую-щих локус

Satt590

Fig. 1. Possible secondary structures of the primer sequence flanking the Satt590 locus

1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Тм 47.6 49.* 51.6 53.5 5«.5 55.0 Tu 47.6 49.4 51 .6 53.5 54.5 55.0 Лидия KT1S6

Рис 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагментов ДНК сои по локус Satt556 Дорожки: 1, 8, 15 - маркер молекулярной массы 50bp DNA Ladder, 2-7 - сорт сои Лидия, 9-14 -форма дикой сои КТ-156, 16 - отрицательный контроль. Слева направо обозначены

температуры отжига праймеров Fig. 2. Electrophoregram of soybean DNA fragment amplification products at the Satt556 locus Tracks: 1, 8, 15 - molecular mass marker 50bp DNA Ladder, 2-7 - Lidia soybean variety, 9-14 - forms of wild soybean KT-156, 16 - negative control. From the left to the right primer

annealing temperatures are indicated

Температура отжига, представленной на рисунке пары праймеров, варьировала от 47,6 до 55,0 °С. Изменение Та на несколько градусов позволило минимизировать количество неспецифических фракций ДНК. В итоге для пары праймеров, фланкирующих локус Баи556, наиболее чёткие фрагменты были детектированы при Та = 54,5 °С. Аналогичным образом произвели анализ

оставшихся 19 пар праймеров, оптимальные температуры отжига которых представлены в таблице 2. Восемь пар праймеров (локусы $аП268, ЪаП565, ЪаП281, ЪаП517, БаП442, БаП431, БаП373, 8аМ590) показали себя наилучшим образом - оптимальная Ta была равна Тт, рассчитанные программой (рис. 3).

Тт 52,052,453,1 54,2 55,556,6 Лидия

Рис 3. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагментов ДНК сои по локус Satt373 Дорожки: 1,5,9,13,17 - маркер молекулярной массы 50bp DNA Ladder, 2-4,6-8 - сорт сои Лидия, 10-12,14-16 - форма дикой сои КТ-156, 18 - отрицательный контроль. Слева направо обозначены температуры отжига праймеров Fig. 3. Electrophoregram of soybean DNA fragment amplification products at the Satt373 locus Tracks: 1,5,9,13,17 - molecular mass marker 50bp DNA Ladder, 2-4,6-8 - Lidia soybean variety, 10-12,14-16 - forms of wild soybean KT-156, 18 - negative control. From the left to the right primer annealing temperatures are indicated.

Две пары праймеров, фланкирующих локусы ^аП173 и 8аП234, потребовали значительной проработки экспериментальным путём. Так, по локусу БаН234 в варианте Ta от 45,9 до 53,5 °С некоторые образцы не амплифицировались с матричной ДНК или образовывали чёткий неспецифический продукт реакции в диапазоне 700 п.н. Дополнительная оптимизация Ta в диапазоне от 53,0 до 57,5 °С также не дала чётких результатов, и только в варианте Ta от 55,0 до 56,5 °С удалось обнаружить фрагмент в характерной области п.н. по локусу и без побочных структур. Аналогичная работа потребовалась по локусу ^аП173, несмотря на отсутствие предсказанных по средствам расчёта О^оАпа^ег™ значимых вторичных структур. Также для некоторых других пар праймеров, предварительный анализ которых не показал возможности образования у них в процессе отжига шпилек, гомо- или гетеродимеров, экспериментальная Ta превосходила Тт на величину от 1,3 (БаН453) до 6,4 °С (8аП571), что на порядок выше

программных расчётов. Предположили, что в данных случаях на увеличение Та в большей степени повлияли неучтённые параметры, такие как температура денатурации и синтеза цепи, количество циклов, время линейного измерения, а также наличие возможных посторонних ингибиторов и фоновой ДНК. Параметры, влияющие на эффективность ПЦР, такие как концентрация ДНК полимеразы, dNTPs, МеСЬ, ДНК матрицы, праймеров, были постоянными и принимались как неизменяемые [13]. Несмотря на все преимущества инструментов in silico, они не могут полностью заменить

экспериментальные подходы в оптимизации условий ПЦР. Важно учитывать индивидуальные особенности скрининга, такие как вариабельность ДНК-образцов, уровень загрязнения микробиологическими примесями, длину ампликона и другие факторы, которые могут влиять на эффективность реакции. Поэтому

экспериментальные подходы могут включать изменение различных параметров реакции

ПЦР, таких как время и температура амплификационных циклов, концентрация праймеров и АМФ, добавление кофакторов и других веществ.

Выводы. Таким образом, в результате проведённых исследований при помощи комбинированного подхода в подборе оптимальных температур отжига SSR-праймеров с использованием современного инструмента in silico OligoAnalyzer™ и традиционного экспериментального метода, получили результаты, которые могут быть использованы при выборе температуры отжига для проанализированных 20 пар SSR-праймеров с целью проведения молекулярно-генетического маркирования G. soja с применением ПЦР. Наиболее оптимальный подход к подбору праймеров и условий их отжига - экспериментальный. Он даёт

возможность получить наиболее точные и надёжные результаты, возможность оценить влияние различных факторов на результаты 88Я-анализа. Выводы данного исследования подчёркивают важность экспериментальных методов в оптимизации условий ПЦР Несмотря на широкое использование в последнее время инструментов т ъШсо, они не могут полностью заменить

экспериментальные подходы в оптимизации условий ПЦР для конкретных приложений. Чтобы достичь максимального результата исследований, должны быть учтены все факторы, которые могут повлиять на эффективность реакции.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-26-00076, https://rscf.ru/project/23-26-00076/

Список источников

1. Zhuang Y., Li X., Hu J., Xu R., Zhang D. Expanding the gene pool for soybean improvement with its wild relatives // aBIOTECH. 2022. Vol.3, № 2. P.115-125. doi:10.1007/s42994-022-00072-7

2. Viana J.P.G, Fang Y., Avalos A., et al. Impact of multiple selective breeding programs on genetic diversity in soybean germplasm // Theor Appl Genet. 2022. Vol.135, №5. Р. 1591-1602. doi: 10.1007/s00122-022-04056-5.

3. Kamala, R., Bharathi, M., Bhargavi, B., et al. SSR markers-based genetic diversity analysis of wild soybean (Glycine soja) accessions for yield and yield related traits // Proc Natl Acad Sci, India, Sect B Biol Sci. 2018. № 89. P. 141-151.

4. Абугалиева С. И. Генетическое разнообразие сои (Glycine max(L.) Merrill) // Биотехнология. Теория и практика. 2013. № 4. С. 13-19.

5. Li Y.H., Li W., Zhang C., et al. Genetic diversity in domesticated soybean (Glycine max) and its wild progenitor (Glycine soja) for simple sequence repeat and single-nucleotide polymorphism loci // New Phytol. 2010. Vol.188, №1. P. 242253. doi: 10.1111/j.1469-8137.2010.03344.x.

6. Htwe N.M., Luo Z.Q., Jin L.G., et al. Functional marker development of miR1511-InDel and allelic diversity within the genus Glycine. BMC Genomics. 2015. No. 16(1). P.467. doi:10.1186/s12864-015-1665-3

7. Присяжнюк Л.М., Мельник С.И., Шишкова Ю.В., Сигалова И.А., Иваницкая А.П. Использование SSR-маркеров для дифференциации новых сортов сои (Glycine max (L. ) Merr. ) // Plant Varieties Studying and Protection. 2017. №3. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ispolzovanie-ssr-markerov-dlya-differentsiatsii-novyh-sortov-soi-glycine-max-l-merr (дата обращения: 13.07.2023).

8. Liu J., Chang Z., Zhang J., et al. Optimization of microsatellite marker polymorphism and reliability assessment for the novel Chinese soybean germplasm using rice SSRs // Molecular Breeding. 2015. №35 P. 106.

9. Nakano M., Fujita Y., Asano K., et al. Analysis of genetic diversity and population structure of wild soybean populations in Japan using microsatellite markers // Breed. Sci. 2014. №64. Р. 140-148.

10. Singh A., Jain A.K., Vikram P., et al. Suitability of microsatellite markers for DNA fingerprinting analysis of Indian soybean varieties // J. Appl. Genet. 2018. №59. Р. 233-242.

11. Cregan P.B., Jarvik T., Bush A.L., et al. An Integrated Genetic Linkage Map of the Soybean Genome // Crop Science. 1999. № 39. P. 1464-1490.

12. Бондаренко О. Н., Блинова А. А., Иваченко Л. Е., Лаврентьева С. И. Подбор микросателлитных локусов ДНК для создания молекулярно-генетических паспортов диких форм и сортов сои амурской селекции // Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2022. № 2(222). С. 37-48. DOI 10.37102/0869-7698_2022_222_02_3.

13. Полиданов М. А., Блохин И. С. Особенности выполнения диагностического ПЦР-анализа // Стратегия научно-технологического развития России: проблемы и перспективы реализации. Петрозаводск : Международный центр научного партнёрства «Новая Наука», 2020. С. 30-47.

COMBINED METHOD OF OPTIMIZATION OF PCR CONDITIONS FOR WILD SOYBEAN SCREENING

©2023. Bondarenko Olga Nikolaevna1^, Lavrent'yeva Svetlana Igorevna2

1,2All-Russian Scientific Research Institute of Soybean, Blagoveshchensk, Russia '[email protected]

Abstract. The study of the genetic diversity of Glycine soja Sieb. & Zucc. was carried out using microsatellite (SSR) markers, but the method required some optimization of certain PCR parameters, one of which is the annealing temperature of the primer. The aim of the work was to use a combined approach in the selection of optimal annealing temperatures of SSR-primers using a modern in silico tool and the traditional experimental method. For 20 pairs of SSR-primers, melting temperatures (Tm) were calculated using the web version of the OligoAnalyzer™ Tool. In the experiment, DNA of the Lydia soybean variety and forms of wild soybean KT-156 were used. A preliminary analysis of the possibility of the formation of hairpins, homo- and heterodimers in the studied primer pairs was conducted. No significant secondary structures were found in only 4 out of 20 pairs of primers flanking the loci Satt470, Satt453, Satt005 and Satt571, the rest had 1 or more homo-/heterodimers. The optimal annealing temperature (Ta) was determined on the finished reaction PCR mixture. Experimentally, the Ta of the primer was optimized, a gradient setting of the temperature mode of amplification was used. For most primers, at Ta close to Tm, amplification byproducts were noted. When choosing the optimal Ta of each primer, we were guided by the experimental data obtained. Eight pairs of primers (by loci Satt268, Satt565, Satt281, Satt517, Satt442, Satt431, Satt373, Satt590) showed themselves in the best way - the optimal Ta was equal to the Tm calculated by the program. As a result, optimal Ta were determined for 20 pairs of SSR-primers under these conditions. The results obtained in the study will be used for molecular genetic labeling of G. soja using SSR-analysis. The conclusions of this study emphasize the importance of experimental methods in optimizing PCR conditions. Despite the widespread use of in silico tools recently, they cannot completely replace experimental approaches in optimizing PCR conditions for specific applications.

Key words: Glycine soja, Glycine max, PCR, SSR-primers, annealing temperature, DNA amplification, in silico analysis.

Funding: The research was carried out at the expense of the grant of the Russian Science Foundation No. 23-26-00076, https://rscf.ru/project/23-26-00076/

References

1. Zhuang Y., Li X., Hu J., Xu R., Zhang D. Expanding the gene pool for soybean improvement with its wild relatives // aBIOTECH, 2022, Vol.3, No. 2, pp.115-125. doi:10.1007/s42994-022-00072-7

2. Viana J.P.G, Fang Y., Avalos A., et al. Impact of multiple selective breeding programs on genetic diversity in soybean germplasm // Theor Appl Genet, 2022, Vol.135, No.5, pp. 1591-1602. doi: 10.1007/s00122-022-04056-5.

3. Kamala, R., Bharathi, M., Bhargavi, B., et al. SSR markers-based genetic diversity analysis of wild soybean (Glycine soja) accessions for yield and yield related traits // Proc Natl Acad Sci, India, Sect B Biol Sci, 2018, No. 89, pp. 141-151.

4. Abugaliyeva S. I. Geneticheskoye raznoobraziye soi (Glycine max (L.) Merrill) (Genetic diversity of soybean (Glycine max (L.) Merrill))// Biotekhnologiya. Teoriya I praktika, 2013, No. 4, pp. 13-19.

5. Li Y.H., Li W., Zhang C., et al. Genetic diversity in domesticated soybean (Glycine max) and its wild progenitor (Glycine soja) for simple sequence repeat and single-nucleotide polymorphism loci // New Phytol, 2010, Vol.188, No.1, pp. 242-253. doi: 10.1111/j.1469-8137.2010.03344.x.

6. Htwe N.M., Luo Z.Q., Jin L.G., et al. Functional marker development of miR1511-InDel and allelic diversity within the genus Glycine. BMC Genomics, 2015, No. 16(1), pp.467. doi:10.1186/s12864-015-1665-3

7. Prisyazhnyuk L.M., Mel'nik S.I., Shitikova YU.V., Sigalova I.A., Ivanitskaya A.P. Ispol'zovaniye SSR-markerov dlya differentsiatsii novykh sortov soi (Glycine max (L. ) Merr. ) (The use of SSR-markers to differentiate new soybean varieties (Glycine max (L. ) Merr. )) // Plant Varieties Studying and Protection, 2017, No. 3. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ispolzovanie-ssr-markerov-dlya-differentsiatsii-novyh-sortov-soi-glycine-max-l-merr (date of access: 07/13/2023).

8. Liu J., Chang Z., Zhang J., et al. Optimization of microsatellite marker polymorphism and reliability assessment for the novel Chinese soybean germplasm using rice SSRs // Molecular Breeding, 2015, No.35, pp. 106

9. Nakano M., Fujita Y., Asano K., et al. Analysis of genetic diversity and population structure of wild soybean populations in Japan using microsatellite markers // Breed. Sci., 2014, No.64, pp. 140-148.

10. Singh A., Jain A.K., Vikram P., et al. Suitability of microsatellite markers for DNA fingerprinting analysis of Indian soybean varieties // J. Appl. Genet., 2018, No.59, pp. 233-242.

11. Cregan P.B., Jarvik T., Bush A.L., et al. An Integrated Genetic Linkage Map of the Soybean Genome // Crop Science, 1999, No. 39, pp. 1464-1490.

12. Bondarenko O. N., Blinova A. A., Ivachenko L. Ye., Lavrent'yeva S. I. Podbor mikrosatellitnykh lokusov DNK dlya sozdaniya molekulyarno-geneticheskikh pasportov dikikh form i sortov soi amurskoy selektsii (Selection of microsatellite DNA loci for the creation of molecular genetic passports of wild forms and varieties of Amur soybeans) // Vestnik Dal'nevostochnogo otdeleniya Rossiyskoy akademii nauk, 2022, No. 2(222), pp. 37-48. DOI 10.37102/08697698 2022 222 02 3.

13. Polidanov M. A., Blokhin I. S. Osobennosti vypolneniya diagnosticheskogo PTSR-analiza (Features of performing diagnostic PCR analysis) // Strategiya nauchno-tekhnologicheskogo razvitiy aRossii: problem i perspektivy realizatsii. Petrozavodsk : Mezhdunarodny tsentr nauchnogo partnjorstva «Novaya Nauka», 2020, pp. 30-47.

Сведения об авторах

O.H. Бопдарепк'о1 - научный сотрудник;

С.И. Лаврентьева2 - ведущий научный сотрудник.

1,2Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный научный центр «Всероссийский научно-исследовательский институт сои», 675027, Амурская область, г. Благовещенск, Игнатьевское шоссе 19 [email protected] 2lana.lavrenteva. [email protected]

Information about the authors

O.N. Bondarenko1D - Researcher;

S.I. Lavrent'yeva2 - Cand. Biol. Sci., Associate Professor, Leading Researcher.

^Federal State Budgetary Scientific Institution Federal Research Center «All-Russian Scientific Research Institute of

Soybean», 19, Ignatievskoe Shosse St., Blagoveshchensk, Amur region, 675027, Russia

[email protected]

2 [email protected]

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest: the authors declare that they have no conflicts of interest.

Статья поступила в редакцию 19.07.2023; одобрена после рецензирования 25.08.2023; принята к публикации 10.11.2012 The article was submitted 19.07.2023; approved after reviewing 25.08.2023; acceptedfor publication 10.11.2023