CC BY
103
УДК: 612.411/.014.2:57.085:550.38
А.Ю Воронин, В.Ю. Куликов
КОЛОНИЕОБРАЗОВАНИЕ В СЕЛЕЗЕНКАХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ГЕОМАГНИТНОГО ПОЛЯ ОЧЕНЬ НИЗКОЙ НАПРЯЖЕННОСТИ
ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, Новосибирск
Исследовали влияние геомагнитных полей очень низкой напряженности (ферромагнитный экран с остаточной намагниченностью 5x10-10 Тл) на колониеобразование в селезенках (КОЕс) сублетально облученных мышей. Установлено, что от времени воздействия геомагнитного поля очень низкой напряженности зависит количество эндогенных колоний в селезенке мышей. Экспозиция мышей в ферромагнитном экране в течение 1,5 и 6 часов приводит к снижению КОЕс. При помещении животных на 3 часа до сублетального облучения в гипогеомагнитные условия наблюдается значительное, в два и более раза (р<0,001), повышение образования КОЭЕс опытных животных. Воздействие гипо-геомагнитных условий в течение 3 часов после сублетального облучения (5 Гр) оказывает стимулирующее действие на процесс колониеобразования. Процесс колониеобразования в селезенке под воздействием ферромагнитного экрана не связан с изменением миграционной активности клеток костного мозга.
Ключевые слова: гипогеомагнитные поля, эндогенное колониеобразование, стволовая клетка
Изучая процессы регенерации кроветворной ткани в пострадиационный период, американские ученые А.Н. Страуд и А.М. Брюс в 1955 г. обратили внимание на макроскопические узелки, которые появлялись на поверхности селезенки через 12-15 сут и исчезали на 17-е сут после общего облучения животных рентгеновскими лучами в нелетальной дозе (4-5 Гр)
[11]. Это были первые наблюдения явления эндогенного колониеобразования. Природу макроскопических узелков на селезенке облученных мышей раскрыли канадские ученые Дж. Тилл и Е. МакКуллох
[12]. В последующем было показано, что каждая колония происходит от одной родоначальной клетки [8, 9], колониеобразующая единица в селезенке (КОЕс) стала синонимом стволовой кроветворной клетки (СКК).
Ранее нами установлено, что геомагнитные поля очень низкой напряженности (гипогеомагнитного поля) ингибируют пролиферативную активность стволовых клеток костного мозга [3]. С учетом этого в специальных сериях экспериментов нами были проведены исследования по влиянию гипогеомагнитного поля на колониеобразующую способность стволовых кроветворных клеток костного мозга в селезенке.
Методика. В опытах использовали мышей линии СВА и (СВАхC57Bl/6)F1 1,5-2,5 месяцев, полученных из питомника лабораторных животных “Столбовая” РАМН.
Для исследования характера влияния гипогеомаг-нитных условий на эндогенное колониеобразование в селезенке использовали ферромагнитный экран и контрольную камеру, где величина напряженности геомагнитного поля равнялась 5х 10-10 Тл и 5х 10-5 Тл соответственно [2]. Температура, влажность воздуха,
содержание кислорода (проводилась принудительная вентиляция), световой режим и другие гигиенические условия были одинаковыми в обеих камерах.
Определение эндогенного колониеобразования проводили через 9-10 сут после облучения. Животных забивали путем цервикальной дислокации. Извлеченные селезенки фиксировали в жидкости Теллес-ницкого (5 мл формалина + 5 мл ледяной уксусной кислоты + 90 мл 70° этилового спирта) и подсчитывали число эндогенных колоний (КОЕс).
Общее облучение, применяемое в методах исследования эндогенного и экзогенного колониеобразования в селезенке мышей-реципиентов кроветворных клеток костного мозга, проводили на аппарате РУМ 25 при мощности дозы 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВт, силе тока 10 мА, фильтре А1-3. Во всех исследованиях мыши получали летальную дозу 8,5-9 Гр или сублетальную - 5,5-6,0 Гр.
Полученные данные обработаны статистически с использованием 1-критерия Стьюдента на ЭВМ типа 1ВМ с использованием пакета статистического анализа медико-биологических данных “1ш81а1”.
Результаты. В исследованиях мышей-самцов линии (СВАхС57В1/6)Б1 помещали на 1,5, 2, 3, 4 и 6 часов в ферромагнитный экран при степени экранирования от геомагнитного поля 105 раз. Контрольных животных помещали в контрольную камеру. Через 15-20 мин после извлечения животных из камер их сублетально облучали на рентгенаппарате.
Результаты исследований показали (рис.), что после 1,5-часового гипогеомагнитного воздействия у сублетально облученых мышей линии (СВАхС57В1/6)Р1; КОЕс в контроле превышает КОЕс опытных животных на 20,5±5,73%. Следовательно,
**
*
г-
1,5 2 3 4 6
Время нахождения животных в геомагнитном поле очень низкой напряженности
Рис. Влияние гипогеомагнитного поля (5х 10-10 Тл) на число эндогенных селезеночных колоний КОЕс-9 у мышей, предварительно до облучения находившихся в ферромагнитном экране.
*-Ро-к<0,05;**-ро_к<0,001
имеется тенденция к снижению КОЕс опытных животных, но уже через два часа после нахождения животных в ферромагнитном экране количество КОЕс в опыте возрастает в 1,7 раза по сравнению с полуторачасовой экспозицией животных в гипогеомагнит-ных условиях и превышает контрольный уровень на 36±7,08%.
Особый интерес представляют, на наш взгляд, данные, полученные после 3-часового нахождения животных в ферромагнитном экране. Было установлено, что трехчасовое воздействие гипогеомагнитного поля приводит к достоверному (р<0,001) увеличению эндогенных колоний в селезенке на 137±3,32%.
Аналогичные результаты были получены на мышах линии СВА. Так, КОЭс у СВ-самцов после 3-часовой экспозиции в гипомагнитных условиях превышает КОЕс контрольных на 142±2,42%, а у СВА-са-мок - на 125±6,3%.
Дальнейшее увеличение срока пребывания мышей линии (СВАхС57Б1/6)Б1 в гипогеомагнитных условиях до 4 часов приводит к снижению КОЕс до 18±4,06% над контрольным уровнем, а 6-часовая экспозиция мышей в опытной камере уменьшает число образовавшихся эндогенных колоний в селезенке до 84±5,13% и статистически не отличается от контрольного уровня.
В другой серии экспериментов мышей линии СВА или (СБЛхС57Б1/6)Б1 облучали в сублетальной дозе и затем помещали на 3 или 6 часов в экспериментальные камеры. Контрольные животные подвергались всем воздействиям так же, как и опытные, кроме ферромагнитного экранирования. Через 9 сут после облучения у животных выделяли селезенку и подсчитывали число эндогенных колоний.
Оказалось, что при воздействии геомагнитными полями очень низкой напряженности в течение 3 часов после сублетального облучения (табл.) число эндогенных колоний в опытной группе у мышей СВА достоверно больше в 1,5 раза (р<0,01). Еще более существенное повышение КОЕс (в 1,7 раза по сравнению с контролем) было обнаружено у опытных мы-
шей линии (СБЛхС57Б1/6)Б1 после трехчасового гипогеомагнитного воздействия.
Увеличение времени нахождения мышей в ферромагнитном экране до 6 часов после сублетального облучения, как видно из табл., приводит к некоторому (статистически недостоверному) уменьшению числа эндогенных колоний в селезенке опытных животных: в 1,3 раза-у (СБЛхС57Б1/6)Б1 ив 1,4раза-у СВА.
Таким образом, 3-часовая экспозиция мышей в ферромагнитном экране оказывает стимулирующее действие на процессы колониеобразования у сублетально облученных животных, то есть повышает эффективность процессов репарации СКК [1].
При изучении влияния стресс-факторов на КОЕс мышей подвергали различным воздействиям: 3-часовой иммобилизации на спине, гипокинезии, вводили им бактериальные препараты, производили кровопускание из орбитального синуса, вызывали кожную воспалительную реакцию с помощью физических и химических флогогенных факторов, наносили тяжелую механическую травму в области бедра, выдерживали животных в разных температурных режимах. Во всех перечисленных случаях отмечалось увеличение выхода селезеночных колоний, которое рассматривалось как следствие стимуляции пролиферативной активности КОЕс [6].
Есть подтверждения, что это связано с повышением миграции клеток из костного мозга в кровь и отсюда в селезенку [10]. У мышей после удаления надпочечников резко снижается концентрация КОЕс в костном мозге и возрастает в периферической крови и селезенке.
Учитывая, что количество инъецированных клеток летально облученным мышам коррелирует с числом узелков, наблюдаемых на селезенке [6], а также полученные нами данные об эндогенных колониях, мы предположили, что в гипогеомагнитных условиях изменяется миграционная активность клеток костного мозга. Для проверки этого мышей линии СВА (самцы, 2,5 месяца) помещали в ферромагнитный экран при индукции магнитной напряженности 5х 10-10 Тл. Контрольные животные помещались в контроль-
Таблица
Число эндогенных селезеночных колоний у мышей СВА и (СВАхС57В1/6) облученных 5,5 Гр после
нахождения в гипогеомагнитных условиях (5х10-10 Тл) в течение 3 ч или 6 ч (М±т)
Экспериментальные группы Число КОЕс-9 на селезенку Достоверность (о-к)
контроль опыт
3 часа СВА (50) (СВАхС57Б1/6)Р 1 (40) 3,7±0,32 3,4±0,90 50 -н -н 54 р<0,01 р<0,05
6 часов СВА (20) (СВАхС57Б1/6)Р 1 (20) 4,7±0,30 5,0±0,31 3,30±0,6 3,80±0,31 р<0,05 р<0,05
Примечание. В скобках - количество животных в эксперименте.
ную камеру. После трехчасовой экспозиции в экспериментальных камерах животных извлекали и фиксировали на специальных столиках, позволяющих экранировать с помощью свинцовых пластин хвосты животных. Все животные - контрольные и опытные -летально облучались. По истечении 9 сут после облучения в селезенках опытных и контрольных мышей определяли число эндогенных колоний.
Результаты исследований показали, что число эндогенных колоний в селезенке (КОЕс-9) опытных (7,1±1,1; n=16) и контрольных (6,4±2,3; n=19) животных достоверно не отличалось.
Известно, что отдельные элементы костного мозга находятся в кровеносном русле, поэтому в специальной серии экспериментов вместо клеток костного мозга у животных линии СВА через 3 часа после нахождения в экспериментальных камерах забирали кровь и по 0,3 мл вводили животным-реципиентам (СВА-самцы), предварительно летально облученным, затем на 9-е сут определяли число КОЕс-9.
Установлено, что число экзогенных колоний в селезенках опытных (6,9±2,3; n=20) и контрольных (6,6±1,8; n=20) животных было одинаковым.
Таким образом, на основании этих данных можно сделать вывод, что ферромагнитный экран не влияет на миграционную активность клеток костного мозга и наблюдаемые нами эффекты гипогеомагнитного воздействия не связаны с изменением миграционной потенции клеток костного мозга.
Известно, что поражающее действие ионизирующего излучения в сублетальных дозах обусловливает гибель клеток, находящихся в репродуктивной стадии (пролиферации), и в меньшей степени поражает клетки в интерфазной стадии [4, 5, 7]. То есть, чем больше клеток находятся перед облучением в неактивном (ингибированном) состоянии, тем значительней будет выживаемость общего пула, что, естественно, отразится на количестве эндогенных колоний в селезенке.
Геомагнитное поле очень низкой напряженности ингибирует пролиферацию, вероятней всего, за счет снижения концентрации ионов кальция в крови [2]. Так, было установлено, что при нахождении животных в ферромагнитном экране при 5х 10-10 Тл в течение 1,5, 2, 3, 4 и 6 часов наблюдается следующая динамика: тенденция к повышению Са2+ в плазме крови через 1,5 ч нахождения животных в гипогеомагнитных условиях сменяется снижением концентрации ионов кальция до конт- рольных значений к 2 ч и достоверным снижением (р<0,02) к 3-му часу экспозиции животных в гипогеомагнитных условиях; в этом случае концентрация Са2+ составляет 84% от контроля, в дальнейшем к 4 и 6 ч на фоне гипогеомагнитного поля происходит постепенное повышение Са2+, статистически недостоверное от контрольных значений. При этом пролиферативная активность костного мозга в исследованиях in vivo и in vitro достоверно снижалась на 3-ьи сут нахождения животных в ферромагнитном экране в 1,6—1,7 раз и 1,8—2,1 раза соответственно [4].
Сопоставление результатов по содержанию Са2+ в крови с данными по КОЕс показало, что через 1,5 ч нахождения животных в гипогеомагнитных условиях на фоне тенденции повышения концентрации ионов кальция в крови наблюдается статистически недостоверное понижение КОЕс. Дальнейшее пребывание животных приводит к незначительному повышению КОЕс, что сопровождается снижением концентрации Са2+ в крови.
Через 3 часа нахождения животных в ферромагнитном экране на фоне достоверного снижения концентрации ионов кальция в крови и, как следствие, ингибиции пролиферативной активности наблюдается значительное повышение образования КОЕ в селезенке опытных животных. Причем эти результаты однозначно повторились на животных линии СВА (самцы и самки) и (СВАхС57В1/6)Б1 (самцы).
Эти данные говорят о том, что гипогеомагнитное поле (5х 10"10Тл), воздействуя на организм животного в течение 3 часов до сублетального облучения, повышает число эндогенных селезеночных колоний более чем в 2 раза, обусловленное снижением ионов кальция в крови, что может рассматриваться как косвенное доказательство радиопротекторного эффекта гипогеомагнитных условий на СКК, так как число эндогенных колоний пропорционально количеству “выживших” после облучения СКК [6].
Таким образом, гипогеомагнитное поле оказывает стимулирующее действие на процессы колониеобра-зования у сублетально облученных животных при 3-часовой экспозиции мышей в ферромагнитном экране при напряженности геомагнитного поля 5х 10-10 Тл, то есть повышает эффективность процессов репарации СКК после облучения ионизирующей радиации.
В то же время 3-часовая экспозиция мышей в ферромагнитном экране после сублетального облучения оказывает стимулирующее действие на процессы ко-лониеобразования, то есть повышает эффективность процессов репарации СКК [1].
THE FORMED COLONIES IN SPLEENS OF EXPERIMENTAL ANIMALS UNDER INFLUENCE OF A GEOMAGNETIC FIELD OF VERY LOW INTENSITY
A.Yu. Voronin, V.Yu. Kulikov
Investigated influence of geomagnetic fields of very low intensity (ferromagnetic screen with residual magnetic 5Ч10-10 Tl) on endogenously formed colonies in spleen (CFU-C) at sub-lethally irradiated mice. Is established, that the number of endogenously formed colonies in spleens of mice has depends on time of influence of a geomagnetic field of very low intensity. The exposition ofmice in ferromagnetic screen during 1,5 and6 hours has results in decrease CFU-C. At a premise animal at 3 hours up to sublethally irradiated mice in hypogeomagnetic condition is observed significant in two and more times (р<0,001) increase of formation CFU-C from experimental animals. The influence hypogeomagnetic conditions within 3 hours after an irradiation (5 Gy ) have renders stimulating action on process of formed colonies. The process formed colonies in spleen under influence of geomagnetic screen is not connected to change of migration activity of a marrow cells.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воронин А.Ю., Куликов В.Ю., Гайдуль К.В.// Бюллетень СО РАМН. 2001. № 3. С. 93 - 97.
2. А. с. № 1695543 Способ стимуляции кроветвотворения в пострадиационный период / Воронин А.Ю., Гайдуль К.В., 1989.
3. Жербин Е.А.,Чухловин А.В. / Радиационная гематология. М.: Медицина, 1989. С. 174.
4. А. с. № 991517 Ферромагнитный экран / Зайцев Ю.А., Калинин Н.М. , 1981 .
5. Коломийцева И.К. / Радиационная биохимия мембранных липидов. М.: Наука, 1989. 181 с.
6. Переверзев А.Е. / Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс-факторы. Л.: Наука, 1986. 172 с.
7. Хансон К.П., Комар В.Е. Молекулярные механизмы радиационной гибели клеток. М.: Энергоатомиздат, 1985. 150 с.
8. Barendsen G.W.// Ann. N.Y. Acad. Sci. 1964. Vol. 114. P. 96—114.
9. Becker A.J., McCulloch E.A., Till J.E. // Nature. 1963. Vol. 197. P. 452—454.
10. KhaitovR.M., PetrovR.V., MorozB.B. etal. //Blood. 1975. Vol. 46. P. 73—78.
11. Stroud A.N., Brues A.M. // Fed. Proc. 1955. Vol. 14. P. 148.
12. Till J.E., McCulloch E.A. //Radiat. Res. 1961. Vol. 14. P. 213—222.
