CC BY
13БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 616-053.32-097:577.213.32]-07
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА TREC/KREC У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ С ИНФЕКЦИОННОЙ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ
ПАТОЛОГИЕЙ
К.б.н. ПОЛЯКОВА Е.А. 1, БЕРЕСТЕНЬ С.А.2, МЕЗЯН С.М.2, к.б.н., доцент БЕЛЕВЦЕВ М.В.1
1 Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр детской
онкологии, гематологии и иммунологии», д. Боровляны, Республика Беларусь
2 Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр «Мать и
дитя», г. Минск, Республика Беларусь
Резюме. Инфекционная патология может являться признаком врожденных дефектов иммунной системы - первичного иммунодефицита. У многих пациентов диагноз первичного иммунодефицита подозревается и ставится только после того, как у пациента были рецидивирующие инфекции или инфекции, которые являются необычными или необычно тяжелыми. Целью данной работы явилось исследование показателей TREC/KREC, которые определяли посредством полимеразной цепной реакции в «реальном времени» из ДНК «сухой капли» крови у 39 у недоношенных новорожденных с инфекционной перинатальной патологией. По результатам проведенных исследований показатели TRECрегистрировались в диапазоне от 3 715,00 до 35 047,50 копий х 106лейкоцитов; KREC - от 2 620,00 до 33 130,00 копий х 106 лейкоцитов.
Ключевые слова: недоношенные новорожденные, TREC, KREC, инфекционная патология, ПЦР в «реальном времени»
QUANTITATIVE ASSESSMENT OF TREC/KREC IN PREMATURE INFANTS WITH
INFECTIOUS PERINATAL PATHOLOGY
POLYAKOVA E.A. 1, BERESTEN S.A.2, MEZYAN S.M.2, BELEVTSEV M.V.1
1Belarussian research center for pediatric oncology, hematology and immunology, Minsk,
Republic of Belarus
2State Institution "Republican Scientific and Practical Center "Mother and Child", Minsk,
Republic of Belarus
Summary. Infectious pathology may be a sign of congenital defects of the immune system -primary immunodeficiency. In many patients, the diagnosis ofprimary immunodeficiency is suspected and made only after the patient has had recurrent infections or infections that are unusual or unusually severeThe aim of this work was to study the TREC/KREC indicators, which were determined by real-time polymerase chain reaction from the DNA of a "dry blood spot" in 39 preterm infants with infectious perinatal pathology. According to the results of the studies, TREC indicators were recorded in the range from 3,715.00 to 35,047.50 copies х 106 leukocytes; KREC - from 2620.00 to 33130.00 copies х 106 leukocytes.
Key words: premature newborns, TREC, KREC, infectious pathology, real-time PCR.
Введение. Инфекционно-воспалительная патология относится к одной из ведущих причин заболеваемости, инвалидизации и смертности новорожденных и, также может являться признаком врожденных дефектов иммунной системы - первичного
ОФ "Международный научно-исследовательский центр "Endless Light in Science"
иммунодефицита. У многих пациентов диагноз первичного иммунодефицита подозревается и ставится только после того, как у пациента были рецидивирующие инфекции или инфекции, которые являются необычными или необычно тяжелыми. Иммунная система недоношенных новорожденных находится в состоянии физиологической депрессии. Биологический смысл супрессорной направленности иммунных реакций в периоде новорожденности состоит в предупреждении риска тяжелой иммунокомплексной патологии и других иммунопатологических реакций, неизбежных при контакте родившегося ребенка с огромным числом антигенов. Имеются сведения о том, что только после рождения впервые активно и широко включаются механизмы иммунного реагирования Т- и В-клеточного звена иммунитета. Большинство исследователей объясняют несостоятельность первичного иммунного ответа у новорожденного незрелостью его иммунной системы на момент родов, ее функциональной неполноценностью по аналогии с общей незрелостью организма [1, 2].
Незрелость иммунной системы - фактор, имеющий временный эффект, обусловленный гестационным возрастом, трудноотделим от специфических факторов, связанных с состоянием здоровья недоношенных детей: врожденных аномалий, инфекционных, эндокринных осложнений и нарушений обмена веществ. У недоношенных детей часто наблюдаются нетипичные симптомы инфекции, такие как затруднение кормления, периодическое дыхание или апноэ Поскольку состояние иммунной системы у недоношенных новорожденных не подвергалось всесторонней оценке до начала проведения скрининга данной патологии, в настоящее время такие дети рассматриваются как имеющие повышенный риск развития инфекций и требуют соответствующих условий выхаживания [3, 4].
Первичные иммунодефицитные состояния могут быть обнаружены с помощью определения кольцевых структур ДНК T- и В-клеточного рецептора (TREC и KREC), образующихся при реаранжировке Т- и В-клеточного рецепторов лимфоцитов и содержащих определенные константные последовательности нуклеотидов, в сухом пятне крови на карте Гатри методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.
Т-рецепторные эксцизионные кольца (T-cell receptor excision circle, TREC) - структуры, формирующиеся во время созревания Т-лимфоцитов на этапе перестройки генов Т-клеточного рецептора (T-cell receptor, TCR). В периферическом отделе иммунной системы TREC присутствуют главным образом в Т-клетках, недавно эмигрировавших из тимуса, которые не успели поделиться после выхода из вилочковой железы. Содержание TREC в периферических Т-лимфоцитах отражает интенсивность двух процессов - эмиграции Т-клеток из тимуса и уровня пролиферативных процессов на периферии. Поскольку в отсутствие интенсивной антигенной стимуляции уровень пролиферации Т-клеток на периферии варьирует слабо, содержание TREC можно рассматривать преимущественно как показатель Т-лимфопоэтической функции тимуса. Любой генетический дефект, который нарушает развитие Т-клеток, индуцирует их апоптоз или блокирует их дифференцировку в тимусе, приводит к Т-клеточной лимфопении и низкому уровню TREC. Количественная оценка уровня TREC позволяет выявить детей с типичной ТКИН, а также с другими заболеваниями, затрагивающими численность и функционирование Т-клеточного звена иммунной системы (например, синдром Ди Джорджи или синдром CHARGE) [2].
KREC (kappa-deleting recombination exercise circle) - аналог кольцевой молекулы TREC, образующийся в процессе созревания В-клеток в костном мозге. Как и в случае TREC, KREC не может реплицироваться в клетке, является стабильной структурой и встречается более чем в 50 % В-лимфоцитов. Определение KREC у новорожденных необходимо для выявления больных с дефектами раннего созревания В-клеток в костном мозге, приводящими к развитию тяжелых и угрожающих жизни состояний (агаммаглобулинемия Брутона, гипериммуноглобулинемия М, тяжелая комбинированная иммунная недостаточность с отсутствием В-клеток) [5].
Цель исследования: оценить показатели TREC/KREC у недоношенных новорожденных с инфекционной перинатальной патологией.
ОФ "Международный научно-исследовательский центр "Endless Light in Science"
Материал и методы. Забор крови на определение TREC/KREC проводился у 39 недоношенных новорожденных с перинатальной патологией инфекционной этиологии, родившихся в РНПЦ «Мать и дитя, Республика Беларусь. Забор крови для количественного определения молекул TREC/KREC осуществлялся путём взятия капли капиллярной крови, которая распределялась на несколько отсеков фильтровальной бумаги методом «сухой капли», с последующим выделением ДНК методом лизиса с дальнейшей фенол-хлороформной экстракцией. Определение количества копий TREC и KREC проводилось методом ПЦР «в режиме реального времени» на базе амплификатора Bio-Rad CFX 96 (BioRad, USA) при поддержке программного обеспечения Realtime RCR Data Analysis (Bio-Rad, США) с использованием набора праймеров и зондов, а также плазмидных стандартов (калибраторов), разработанных в государственном учреждении «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии», Республика Беларусь. [6]. Определение гематологических показателей периферической крови с подсчетом лейкоцитарной формулы проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Pentra 60 (Horiba АЬХ, Франция).
Результаты обследования внесены в созданную компьютерную базу данных и обработаны при помощи программного обеспечения Windows, Excel, «STATISTICA 8». Выявление корреляционной взаимосвязи осуществлялось методом рангового корреляционного анализа по Спирмену. Нормальность распределения выборки проверялась при помощи критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk'sW-test) с использованием критерия Колмогорова. При распределении, отличающемся от нормального, данные представляли в виде Me (25 и 75 перцентиль), что характеризует среднее развитие признака в группе.
Результаты исследования. Недоношенные новорожденные с различной перинатальной патологией инфекционной, которая характеризовалась наличием признаков воспалительного процесса на момент определения TREC/KREC родились в сроке гестации Ме=32,5 (28,033,7) недель с массой тела 1580,0 (992,5-2075,0).
От первой беременности родилось 10/25,6 % младенцев, от второй -13/33,3 %, от третьей и более - 16/41,1 % младенцев. От первых родов родилось 18/46,2 % младенцев, от вторых -каждый третий (12/30,8 %), от третьих и более - по 9/23,0 % новорожденных. При абдоминальном родоразрешении родилось большинство (32/82,0 %) младенцев. Состояние большинства (36/92,3 %) обследованных детей при рождении оценивалось как тяжелое, средней тяжести - у 3/7,7 % детей. Выписаны домой 36/92,3 % младенцев с массой тела 2475,0 (2321,2-2613,7) г в удовлетворительном состоянии на 35,5 (23,5-60,7) сутки жизни.
Клинический диагноз внутриутробная инфекция без дополнительного уточнения регистрировался у 30,8 % детей; врожденная пневмония - у 33,3 %; инфекция, специфичная для перинатального периода - у 17,9 %; врожденный сепсис - у 12,8 % младенцев. На искусственном вскармливании находился 21/53,8 % младенец, на смешанном - 8/20,5 % детей, на грудном - 6/15,4 % новорожденных, на парентеральном вскармливании - 4/10,3 % детей.
Определение TREC/KREC проводилось на Ме=11,0 (9,0-14,0) сутки жизни, масса тела на момент определения TREC/KREC составила Ме=1775,0 (1393,0-2080,0) г. В гематологических показателях периферической крови значение лейкоцитов было Ме=18,66 (13,97-24,53) х109/л, палочкоядерных нейтрофилов Ме=6,0 (3,0-8,0) % или Ме=0,99 (0,50-1,82) х109/л; сегментоядерных нейтрофилов Ме=37,0 (27,0-42,0) % или Ме=5,34 (3,67-9,73) х109/л, моноцитов Ме=11,0 (8,0-14,0) % или Ме=1,85 (1,24-2,82) х109/л, нейтрофильный индекс Ме=0,13 (0,09-0,18), индекс сдвига лейкоцитов Ме=0,84 (0,60-1,31), количество нейтрофилов Ме=42,0 (32,7-50,0) %.
Количество копий TREC в пределах Р10-Р90 перцентили отмечалось у 85 % недоношенных новорожденных, ниже Р10 - у 5 % и выше Р90 - у 10 %. Количество копий KREC в пределах Р10-Р90 перцентили отмечалось у 82 % недоношенных новорожденных, ниже Р10 - у 5 % и выше Р90 - у 13 %
Процентильные значения количественных показателей TREC/KREC (количество копий х 106 лейкоцитов) у недоношенных детей с признаками воспалительного процесса представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Диапазон процентильных значений количественных показателей TREC/KREC (количество копий х 106 лейкоцитов) у недоношенных детей с признаками воспалительного процесса_
Показатели Недоношенные новорожденные n=39
Перцентили, % 3 10 25 50 75 90 97
Количество копий TREC 1 511,00 3 715,00 7 426,00 11 355,00 26 101,50 35 047,50 44 582,50
Количество копий KREC 1 526,50 2 620,00 3 535,00 12 251,00 24 173,00 33 130,00 73 231,00
ВЫВОДЫ. У недоношенных новорожденных с различной перинатальной патологией инфекционной, которая характеризовалась наличием признаков воспалительного процесса на момент определения TREC/KREC показатели TREC регистрировались в диапазоне Р10-Р90 перцентили от 3 715,00 до 35 047,50 копий х 106 лейкоцитов; KREC - от 2 620,00 до 33 130,00 копий х 106 лейкоцитов.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Holt P.G., Jones C.A. The development of the immune system during pregnancy and early life /Allergy. 2000. № 8. P. 688-697.
2. Percentiles of Lymphocyte Subsets in Preterm Infants According to Gestational Age Compared to Children and Adolescents / S. Huenecke, E. Fryns, B. Wittekindt, [et al.] // Human Immunology. 2016. № 5. P. 291-298.
3. Клинические рекомендации по оказанию помощи детям, родившимся в сроках 22-27 недель (проект) / Д.О. Иванов [и др.]. 2016. С. 99.
4. Recurrent postnatal infections are associated with progressive white matter injury in premature infants / H.C. Glass, S.L. Bonifacio, V. Chau, [et al.] // Pediatrics. 2008. № 2. P. 299-305.
5. Неонатальный скрининг на тяжелую комбинированную иммунную недостаточность в России: прекрасное далеко или завтрашняя реальность? / С.С. Дерябина, И.А. Тузанкина, Е.В.Власова, М.А. Болков, В.Н. Шершнёв // Вопросы современной педиатрии. 2017. №16 (1). С. 59-66.
6. Диагностическая значимость определения продуктов реаранжировок Т- и В-клеточных рецепторов TREC и KREC у пациентов с врожденными ошибками иммунитета. / Полякова Е.А., Стёганцева М.В., Гурьянова И.Е., Луцкович Д.В., Скоповец Е.Я., Любушкин А.В., Володащик Т.П., Казак В.И., Скибо Ю.В., Белевцев М.В. // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. 2023. №3. С. 226-235. https://doi .org/10.29235/1814-6023-2023-20-3-226-235
УДК 595.7; 591.8
