CC BY
56
УДК 612.82, 57.086.2
Когнитивная индексация нейронов: Сге-управляемое генетическое маркирование и изучение клеток, участвующих в обучении и памяти
О. И. Ивашкина1,2, Н. С. Воробьева1, А. М. Груздева1, М. А. Рощина3, К. А. Торопова12, К. В. Анохин124*
Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», отдел нейронаук, 123182, Россия, Москва, пл. Академика Курчатова, 1
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Центр нейронаук и когнитивных наук, 119991, Россия, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 27 3Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, 117485, Россия, Москва, ул. Бутлерова, 5А
Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина, лаборатория
нейробиологии памяти, 125315, Россия, Москва, ул. Моховая, 11, стр. 4
*E-mail: k.anokhin@gmail.com
Поступила в редакцию 27.11.2017
Принята к печати 26.03.2018
РЕФЕРАТ Описан и апробирован метод Сге-опосредуемого перманентного генетического маркирования нейронных сетей головного мозга, активных в ходе приобретения животным нового опыта. Метод основан на использовании двойных трансгенных мышей Fos-Cre-eGFP, у которых в результате управляемой тамок-сифеном Сге-рекомбинации зеленый флуоресцентный белок экспрессируется только в тех клетках, в которых в результате получения животным нового опыта происходила экспрессия непосредственного раннего гена c-fos. Визуализация белка eGFP на срезах мозга мышей Fos-Cre-eGFP позволила выявить нейроны, подвергнувшиеся Сге-рекомбинации в момент обучения животных условному рефлексу замирания. С помощью двойного иммуногистохимического окрашивания охарактеризованы типы нейронов неокортекса и гиппокампа, в которых в ходе обследования животными новой обстановки происходила индуцированная опытом Сге-рекомбинация. При этом генетически маркированные нейроны относились к типу пирамидных возбуждающих нейронов, но не к различным типам тормозных нейронов. Показано, что сочетание генетического Cre-eGFP-маркирования с иммуногистохимическим мечением эндогенного белка c-Fos дает возможность выявлять и сравнивать две популяции нейронов мозга, активных во время двух различных эпизодов получения животным нового опыта. Описанный подход может найти широкое применение в визуализации и сравнительном анализе различных когнитивных клеточных сетей головного мозга. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА генетическое маркирование нейронов, мозг, нейронные сети, обучение, непосредственно ранние гены, Сге-рекомбинация.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ eGFP - усиленный зеленый флуоресцентный белок; GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок; №uN - нейрон-специфический ядерный белок; СаМКП - кальций-кальмодулин-зави-симая протеинкиназа типа 2; SOM - соматостатин; NPY - нейропептид Y; PV - парвальбумин; НРГ - непосредственно ранние гены; ПЦР - полимеразная цепная реакция; УРЗ - условно-рефлекторное замирание; ЭКР - электрокожное раздражение.
ВВЕДЕНИЕ
Исследование механизмов формирования и работы нейронных сетей, обеспечивающих когнитивные функции головного мозга, является одним из главных направлений современной нейронауки. Решение этих задач требует создания новых экспериментальных
методов, позволяющих визуализировать нейронные субстраты когнитивных процессов в масштабе целого мозга с клеточным разрешением. Принципиальной при этом является необходимость сравнения клеточных популяций, отвечающих за различные когнитивные функции.
Классическим методом выявления нейронных популяций, вовлекаемых в различные типы когнитивной активности животных, служит детекция экспрессии непосредственно ранних генов (НРГ, immediately early) [1—3]. НРГ - семейство генов, быстро активирующихся в клетке через внутриклеточные сигнальные каскады в ответ на те или иные внешние воздействия. К этому семейству относятся гены, которые кодируют транскрипционные факторы, структурные синаптические белки, цитоплазма-тические ферменты и др. [4]. Экспрессия некоторых НРГ, например с-fos, zif268 и arc, индуцируется новым для животного опытом и критически необходима для пластических перестроек и формирования долговременной памяти, хранящей следы индивидуального опыта [1, 3, 5, 6]. На этих свойствах НРГ основаны методы иммуногистохимического и in situ гибридизационного картирования мозга, позволяющие выявлять когнитивные нейронные сети, активные во время обучения [2, 7-9].
Однако выявление продуктов НРГ с помощью иммуногистохимии или in situ гибридизации трудоемко и ограничено узким временным окном после когнитивного воздействия. Перспективным способом решения части этих проблем является визуализация популяций когнитивно активных нейронов с помощью экспрессии генов флуоресцентных белков под контролем промоторов НРГ. Использование управляемых трансгенных систем дает возможность получать мышей, у которых флуоресцентный белок синтезируется только в тех нейронах, в которых в определенный момент времени происходила экспрессия НРГ, например, c-fos [10]. Такие технологии получают в последние годы все большее распространение. Однако они имеют существенное ограничение: мечение популяции когнитивно активных нервных клеток ограничено сроком жизни флуоресцентного белка.
Способом решения этой проблемы может стать перманентное генетическое маркирование популяции нервных клеток мозга, отвечающих за решение определенной когнитивной задачи. С этой целью может быть использована широко применяемая в нейробиологии система сайт-специфических ре-комбиназ [11-13], в частности, система с модифицированной Сге-рекомбиназой бактериофага P1, которая соединена с мутантным лигандсвязывающим доменом рецептора эстрогена [14, 15]. В присутствии тамоксифена, синтетического антагониста эстрогена, Сге-рекомбиназа распознает гомотипические loxP-сайты и вырезает ДНК, фланкированную этими сайтами. Сайты loxP обычно ограничивают STOP-кодон, расположенный перед последовательностью репортерного гена, кодирующего флуоресцент-
ный белок (GFP, tdTomato и др.), Р-галактозидазу или каналородопсин [13, 16]. В настоящее время созданы десятки трансгенных линий мышей, у которых Сге-рекомбиназа экспрессируется избирательно в разных тканях или разных типах клеток, например, в отдельных типах интернейронов [17], или на определенных стадиях развития нейро-нальных предшественников [13]. Таким образом, технология генетического маркирования нейронов с помощью Сге-рекомбиназы в настоящее время хорошо развита, однако применяется преимущественно для анатомического картирования нервной системы или для эмбриональных исследований.
Методической инновацией стала работа Guenthner и соавт. [18], которые создали линии трансгенных мышей, экспрессирующих Cre-рекомбиназу под управлением промоторов НРГ - c-fos и arc. Скрещивание мышей линии Fos-Cre или Arc-Cre с мышами репортерной линии, несущей красный флуоресцентный белок tdTomato, дало возможность впервые получить перманентное генетическое маркирование нейронов, в которых активируются НРГ [18].
Нами получены двойные трансгенные мыши Fos-Cre-eGFP, которые были использованы в настоящей работе для исследования морфологического и молекулярного фенотипа нейронов различных структур головного мозга, подвергающихся Cre-рекомбинации при приобретении животными нового опыта. Мы также впервые апробировали возможность использования трансгенных мышей Fos-Cre-eGFP для маркирования и сравнения двух популяций нейронов, активных у одного и того же животного в двух разных ситуациях нового опыта.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение двойных трансгенных мышей линии Fos-Cre-eGFP
Для получения мышей линии Fos-Cre-eGFP проводили скрещивание трансгенных мышей линий B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J (The Jackson Laboratory, стоковый номер: 021882), несущих Cre-рекомбиназу под промотором c-fos, с линией Tg(CAG-Bgeo/GFP)21Lbe/J (The Jackson Laboratory, стоковый номер 003920), несущей ген усиленного зеленого флуоресцентного белка eGFP под loxP-сайтами. Мышей содержали в индивидуально вентилируемых клетках по пять животных со свободным доступом к воде и пище при световом цикле 12/12 ч. Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ (19.06.2003 г.), а также с постановлением локального этического комитета по вопросам биомедицин-
ских исследований НИЦ «Курчатовский институт» (Протокол № 1 от 09.07.2015).
Генотипирование
У обеих родительских линий трансген находится в гетерозиготном состоянии, поэтому для выявления двойных трансгенных животных использовали генотипирование по каждому трансгену. В возрасте двух месяцев у мышей собирали образцы тканей и выделяли ДНК путем лизирования раствором протеиназы К (Sigma) в 1% SDS-буфере (Хеликон) с последующим осаждением 96% этанолом. Осадок ДНК растворяли в TE-буфере. Полученную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймера-ми к Сге-рекомбиназе и eGFP в среде ScreenMix (ЗАО «Евроген»). Использовали следующие прай-меры: для Сге - CACCAGTGTCTACCCCTGGA (общая прямая последовательность для дикого типа и трансгена), CGGCTACACAAAGCCAAACT (обратная последовательность дикого типа), CGCGCCTGAAGATATAGAAGA (обратная последовательность трансгена); для GFP - TGGACGGC-GACGTAAACGGC (первая последовательность трансгена), GGCGGTCACGAACTCCAGCA (вторая последовательность трансгена), CTAGGCCAC-AGAATTGAAAGATCT (прямая последовательность внутреннего позитивного контроля), GTAGGTGGA-AATTCTAGCATCATCC (обратная последовательность внутреннего позитивного контроля). Условия ПЦР указаны в таблице. Продукты ПЦР выявляли в 2.5% агарозном геле в TAE-буфере с бромистым этидием.
Условия проведения полимеразной цепной реакции при генотипировании
Индукция Сге-рекомбинации тамоксифеном
Для индукции Сге-рекомбинации использовали однократную внутрибрюшинную инъекцию тамоксифена (Sigma) в дозе 150 мг/кг, растворенного в кукурузном масле (Sigma), согласно описанной ранее методике [18]. Для опыт-индуцируемой Сге-рекомбинации инъекцию тамоксифена проводили за 24 ч до получения животным нового опыта.
Обследование обстановки
При обследовании обстановки мышей помещали в экспериментальную камеру на 5 мин и давали свободно ее обследовать. Известно, что такое обследование приводит к формированию у животных долговременной памяти [19].
В работе использовали две обстановки. Обстановка А представляла собой освещенную диффузным белым светом камеру (средний уровень освещенности 87 лк) размером 20 х 30 х 20 см, снабженную с электродным полом; уровень шума в камере составлял 7 дБ. Перед помещением каждого животного камеру протирали 40% раствором этилового спирта. Обстановка В представляла собой камеру размером 20 х 15 х 20 см с электродным полом; камера была освещена только источником ближнего инфракрасного света, невидимого для мышей; уровень шума в камере составлял 25 дБ. Перед помещением каждого животного камеру протирали 3% раствором уксусной кислоты.
Нанесение немедленного электрокожного раздражения
Нанесение электрокожного раздражения (ЭКР) проводили через 3 дня после обследования обстановки А. Для этого мышей помещали в обстановку А или обстановку В и немедленно наносили ЭКР силой 1 мА и длительностью 2 с, после чего сразу же возвращали в домашнюю клетку.
Обучение в задаче условно-рефлекторного замирания (УРЗ)
Для обучения УРЗ мышей помещали в обстановку А и через 120 с подавали звуковой сигнал (90 дБ, 5 кГц) длительностью 30 с. Последние 2 с звука сочетали с подачей ЭКР силой 1 мА. Через 30 с после окончания ЭКР мышей возвращали в домашнюю клетку.
Экспериментальные группы
Для оценки фоновой и опыт-индуцированной экспрессии eGFP использовали две группы животных: мышей группы «Обучение» (n = 4) обучали в задаче УРЗ как описано выше; мыши из группы «Контроль» (n = 4) при этом оставались в домаш-
Этап Температура, °С Время Примечание
1 94 2 мин
2 94 20 с
3 65 15 с Снижение температуры на 0.5°С за цикл
4 68 10 с
5 Повторение этапов 2-4 в течение 10 циклов
6 94 15 с
7 60 15 с
8 72 10 с
9 Повторение этапов 6-8 в течение 28 циклов
10 72 2 мин
11 10 Остановка
них клетках и не подвергались каким-либо воздействиям.
Для определения фенотипа клеток, проходящих опыт-зависимую Сге-рекомбинацию, брали животных, которые обследовали обстановку А в течение 5 мин (n = 5).
Для выявления двух популяций когнитивно активных нейронов в одном мозге использовали группы «А - А + ЭКР» (n = 5) и «А - В + ЭКР» (n = 5). Мыши группы «А - А + ЭКР» обследовали обстановку А и затем через 3 дня получали немедленное ЭКР в той же обстановке; мыши группы «А - В + ЭКР» обследовали обстановку В и через 3 дня получали немедленное ЭКР в обстановке В.
Взятие образцов мозга и изготовление плавающих срезов
Образцы мозга мышей забирали через 3 дня после предъявления животным нового опыта, сопровождавшегося Сге-рекомбинацией. В экспериментах по выявлению двух популяций активных нейронов образцы мозга мышей брали через 90 мин после второго когнитивного эпизода (нанесения ЭКР).
Мышей наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией 15% хлоралгидрата в физиологическом растворе. После этого проводили интракардиальную перфузию растворами фосфатного буфера и 4% па-раформальдегида в фосфатном буфере и извлекали мозг. Полученные образы мозга постфиксирова-ли 4% раствором параформальдегида в фосфатном буфере: 2 ч при комнатной температуре и 14-18 ч при +4 °С. После этого образцы переносили в фосфатный буфер на 2 ч и изготавливали фронтальные срезы мозга толщиной 50 мкм с помощью вибратома Leica VT1200S (Leica). Срезы брали на расстоянии +2.46 и -1.34 мм от брегмы. Координаты срезов определяли с помощью стереотаксического атласа мозга мыши [20].
Выявление флуоресцентного белка eGFP и двойное иммуногистохимическое окрашивание
В экспериментах по определению фоновой и опыт-индуцированной экспрессии eGFP клетки, подвергшиеся Сге-рекомбинации, выявляли по собственной флуоресценции белка eGFP. Изготовленные срезы мозга заключали под покровные стекла с помощью водной среды Fluoromount™ Aqueous Mounting Medium (Sigma-Aldrich) и проводили оцифровку как описано ниже.
В экспериментах по определению фенотипа и доли клеток, проходящих опыт-зависимую Cre-рекомбинацию, а также выявлению двух популяций когнитивно активных нейронов, подвергшиеся Cre-рекомбинации клетки выявляли иммуногистохими-
чески при помощи окраски на белок eGFP. Срезы мозга подвергали процедуре пермеабилизации в 1% растворе Triton-X100 (Sigma) в фосфатном буфере с 5% нормальной сывороткой осла (Sigma) и 5% нормальной сывороткой козла (Abcam) в течение 60 мин. После этого срезы трижды отмывали 0.2% раствором Triton-X100 в фосфатном буфере по 5 мин. Затем проводили инкубацию с первичными антителами в течение 18 ч при +4°С. В разных реакциях использовали следующие первичные антитела для выявления различных маркеров: eGFP (Rabbit Anti-GFP Antibody, Life Technologies; разведение 1 : 250), eGFP (Chicken Anti-GFP Antibody, Aves Labs; разведение 1 : 500), с-Fos (Goat Anti-c-Fos Antibody, Santa Cruz Biotechnology; разведение 1 : 150), GFAP (Chicken Anti-GFAP Antibody, Abcam; разведение 1 : 500), NeuN (Mouse Anti-NeuN Antibody, EMD Millipore; разведение 1 : 500), CaMKII (Mouse Anti-CaMKII Antibody, EMD Millipore; разведение 1 : 200), SOM (Rabbit Anti-Somatostatin Antibody, Santa Cruz Biotechnology; разведение 1 : 1000), NPY (Rabbit Anti-Neuropeptide Y Antibody, Novus Biologicals; разведение 1 : 10000) и PV (Rabbit Anti-Parvalbumin Antibody, Abcam; разведение 1 : 10000). По окончанию инкубации срезы отмывали 0.2% раствором Triton-X100 в фосфатном буфере 3 раза по 5 мин. Далее инкубировали срезы с вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. В разных реакциях были использованы следующие вторичные антитела: AlexaFluor® 488 Donkey Anti-Goat Antibody (Life Technologies; разведение 1 : 500), AlexaFluor® 488 Goat Anti-Chicken Antibody (Life Technologies; разведение 1 : 500), AlexaFluor® 568 Donkey Anti-Rabbit Antibody (Life Technologies; разведение 1 : 500), AlexaFluor® 568 Goat Anti-Chicken Antibody (Life Technologies; разведение 1 : 500) или AlexaFluor® 568 Donkey Anti-Mouse Antibody (Life Technologies, разведение 1 : 500). После инкубации с вторичными антителами срезы отмывали 3 раза по 5 мин в 0.2% растворе Triton-X100 в фосфатном буфере. После окончания окраски срезы заключали под покровные стекла с помощью водной среды Fluoromount™ Aqueous Mounting Medium (Sigma-Aldrich). Оцифровку срезов проводили на конфокальном микроскопе Olympus FV1000BW61WI (Olympus) при увеличении X20. С каждого среза мозга получали 10-13 оптических срезов с шагом 5 мкм по оси Z.
Подсчет eGFP-положительных клеток и анализ колокализаций
Обработку полученных изображений и дальнейший анализ проводили в программе Imaris 7.1.0 (Bitplane). Поскольку окраска на eGFP является цитоплазмати-
ческой и выявляет не только тела, но и отростки клеток, автоматический подсчет eGFP-положительных нейронов затруднителен. В связи с этим, eGFP-положительные клетки отмечали вручную, а затем подсчитывали их количество автоматически. Окраски на NeuN и с-Fos являются ядерными, поэтому NeuN-положительные и с-Fos-положительные клетки выделяли и подсчитывали автоматически на основании размера и порогового уровня интенсивности окраски в красном канале. Для окрасок на eGFP, NeuN и с-Fos отмечали все положительные клетки, сомы которых полностью помещались в глубине среза по оси Z; клетки, сомы которых лежали на верхней и нижней границах срезов мозга по Z, не отмечали. Колокализацию eGFP с NeuN или с-Fos оценивали экспертно для каждой клетки в трех проекциях. Двойными положительными считали клетки, у которых NeuN- или ^Fos-положительное ядро было полностью окружено окрашенной на eGFP цитоплазмой. Двойные положительные клетки отмечали вручную и затем подсчитывали автоматически. Подсчет положительных клеток проводили по всей площади фронтальной ассоциативной коры на срезе мозга, а для совместной окраски с NeuN - также отдельно в слоях 1, 2/3, 5 и 6. Границы фронтальной ассоциативной коры определяли с помощью стерео-таксического атласа мозга мыши [20]. Границы слоев определяли в соответствии с Алленовским атласом мозга мыши (Allen Mouse Brain Atlas, http://mouse. brain-map.org/static/atlas). От каждого животного анализировали по 3 среза фронтальной ассоциативной коры. Результаты подсчета положительных клеток усредняли для правого и левого полушария на одном срезе и трех срезов с одного мозга.
Статистический анализ данных
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета Prism 7 (GraphPad) с использованием двухвыборочного t-критерия, а также двухфактор-ного дисперсионного анализа ANOVA или дисперсионного анализа ANOVA с повторными измерениями и t-теста Сидака. Критический уровень значимости принимали равным р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Фоновая и опыт-индуцированная экспрессия зеленого флуоресцентного белка в мозге двойных трансгенных мышей Fos-Cre-eGFP
В результате скрещивания мышей линий B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J и Tg(CAG-Bgeo/GFP)21Lbe/J получено потомство, часть которого была двойными трансгенными животными, несущими одновременно ген Cre-рекомбиназы
Л
eGFP
Б CreER
173 п.н. 324 п.н.
tg tg Wt
1 2 3
« » * »
tg wt wt
1 2 3
215 п.н. 293 п.н.
Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР для выявления двойных трансгенных мышей линии Fos-Cre-eGFP, несущих одновременно гены eGFP (А) и Сге-рекомбиназы (Б). 173 п.н. - фрагмент, соответствующий трансгену по гену eGFP; 324 п.н. - внутренний позитивный контроль; 215 п.н. - фрагмент, соответствующий дикому типу по гену Сге-рекомбиназы; 293 п.н. - фрагмент, соответствующий трансгену по гену Сге-рекомбиназы; wt - животное дикого типа по данному гену, tg - трансгенное животное по данному гену; 1, 2, 3 - номер животного. Двойным трансгенным животным является только мышь № 1
под промотором c-fos и ген усиленного флуоресцентного белка eGFP под loxP-фланкированным стоп-сигналом (рис. 1). Для оценки базового уровня Cre-рекомбинации и опыт-зависимой индукции рекомбинации трансгенным мышам вводили тамокси-фен и через 24 ч после инъекции обучали в задаче УРЗ (группа «Обучение») или оставляли в домашних клетках (группа «Контроль»). Через 3 дня на срезах мозга мышей выявляли eGFP (рис. 2). Нейроны, в которых выявлялся зеленый флуоресцентный белок - это нейроны, в которых происходила активация промотора гена c-fos и следующая за ней Cre-рекомбинация.
У мышей из группы «Обучение» выявлено большое количество eGFP-положительных нейронов во всех структурах, специфически связанных с обучением УРЗ [21], а именно: в обонятельных ядрах, гиппо-кампе, миндалине, вентральном таламусе, а также в различных областях неокортекса - фронтальной ассоциативной, прелимбической, инфралимбической, цингулярной, ретросплениальной, теменной ассоциативной, височной ассоциативной, энторинальной, соматосенсорной, слуховой, зрительной, моторной, инсулярной и орбитальной (рис. 2Б,Г,Е,З). При этом
Контроль
Контроль
Обучение
а р
д
я е ы н ь л е т я н о б о
а р
о к я а н ь л а т н
о р
е
? LO rVO 4
\ > ,MOIÎ
Обучение
' I s iv
lo ; vo \
' DIO' ' I
\1МОВ
Рис. 2. Сопоставление базового уровня Cre-рекомбинации у мышей группы «Контроль», не получавших никаких поведенческих воздействий (А, В, Д, Ж), и опыт-индуцированной Сге-рекомбинации у мышей группы «Обучение», прошедших обучение УРЗ (Б, Г, Е, З). AON - передняя обонятельная область; BLA - базолатеральное ядро миндалины; СА1 - зона СА1 гиппокампа; DG - зубчатая фасция гиппокампа; DLO -дорсолатеральная орбитальная кора; FrA - фронтальная ассоциативная кора; LO - латеральная орбитальная кора; M1 - первичная моторная кора; MO - медиальная орбитальная кора; MOB - основная обонятельная луковица; PrL - прелимбическая кора; S1 - первичная сомато-сенсорная кора; VO - вентральная орбитальная кора. Шкала - 100 мкм
А
Б
у контрольных мышей eGFP-положительные клетки в перечисленных выше областях мозга почти не выявлялись (рис. 2А,В,Д,Ж). Единичные eGFP-положительные клетки у контрольных животных отмечены только в некоторых областях неокортекса: в фронтальной ассоциативной, дорсолатеральной орбитальной, моторной, соматосенсорной, пириформ-ной и экторинальной. Эти результаты свидетельствуют о том, что метод генетического маркирования активных нейронов у мышей Fos-Cre-eGFP позволяет успешно визуализировать активацию широко распределенной популяции нейронов, захватывающей большое число разнообразных структур головного мозга.
Определение фенотипа клеток, проходящих опыт-зависимую Сге-рекомбинацию
В эксперименте по определению типа клеток, проходящих опыт-зависимую Сге-рекомбинацию, мышей после инъекции тамоксифена помещали в новую для них обстановку А и через 3 дня выявляли пары маркеров: eGFP и одного из специфических маркеров типов клеток.
В качестве маркера зрелых нейронов был выбран белок NeuN, который локализуется в ядрах практически всех типов нейронов в центральной нервной системе млекопитающих, за исключением клеток Пуркинье мозжечка, митральных клеток обонятельной луковицы и фоторецепторных клеток сетчатки [22]. В качестве клеточного маркера астроцитов был выбран белок GFAP [23]. Во всех исследованных структурах все eGFP-положительные клетки были также NeuN-положительными (рис. 3А,Б); при этом не выявлено ни одного случая колокализации eGFP с белком GFAP (рис. 3В).
Нейроны головного мозга можно разделить на возбуждающие (пирамидные) и тормозные (интернейроны). Маркером возбуждающих нейронов может служить СаМКП. Данный фермент принимает участие в организации возбуждающих синапсов и никогда не синтезируется в ГАМКэргических интернейронах [24]. Интернейроны очень вариабельны по своим морфологическим, электрофизиологическим и биохимическим свойствам, в связи с чем их подразделяют на несколько разных типов, например, на основании синтеза специфических биохимических
СА1 РоМЗРР .1 о Роа-СРР
I В
СА1
г» ' Ой ф
Рис. 3. Опыт-зависимая Сге-рекомбинация происходит только в нейронах. Зеленый канал - eGFP. Красный канал - маркер нейронов NeuN (А, Б) или астроцитов GFAP (В). А - неокортекс (фронтальная ассоциативная кора); Б, В - дорсальный гиппокамп; шкала: 150 мкм. На микрофотографиях а1, а2, а3 показана область, выделенная рамкой на А, отдельно по каналам: а1 -цитоплазматическая окраска на eGFP, а2 - ядерная окраска на NeuN, а3 - их наложение; шкала: 70 мкм
маркеров: PV, SOM и NPY [25]. Чтобы определить, к какому типу нейронов относятся клетки, проходящие Сге-рекомбинацию, мы оценили колокализацию белка eGFP и маркера возбуждающих пирамидных нейронов СаМКП или одного из маркеров тормозных интернейронов (PV, SOM и NPY).
Нами не обнаружено колокализации eGFP ни с одним из маркеров интернейронов (рис. 4-6). При этом eGFP-положительные нейроны были также СаМКП-положительными, т.е. относились к возбуждающим пирамидным клеткам (рис. 7). СаМКП-положительные eGFP-положительные нейроны были выявлены в различных слоях неокортек-са (рис. 7А), а также в пирамидном слое зоны СА1
и гранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа (рис. 7Б). При иммуногистохимическом выявлении белка eGFP окрашивались не только тела клеток, но и значительная часть отростков. Визуальный анализ анатомии таких eGFP-положительных клеток также подтвердил заключение о том, что опыт-зависимая Сге-рекомбинация происходила именно в пирамидных клетках (рис. 7В,Г).
Таким образом, по результатам молекулярного фенотипирования клеток было установлено, что опыт-зависимая Сге-рекомбинация у мышей Fos-Cгe-eGFP происходит только в нейронах, но не в гли-альных клетках. При этом нейроны, проходящие Сге-рекомбинацию, относятся к возбуждающим пирамидным клеткам.
Определение доли клеток, проходящих Cre-рекомбинацию после обследования животным новой обстановки
Для того чтобы определить, какая доля нейронов подвергается опыт-зависимой Сге-рекомбинации после получения животным нового опыта, а также проанализировать паттерны распределения таких клеток в мозге, оценивали количество eGFP-положительных нейронов в различных слоях фронтальной ассоциативной коры у мышей, обследовавших обстановку на фоне действия тамоксифена (п = 5). Для оценки доли eGFP-положительных клеток от всех нейронов данного слоя проводили совместное выявление eGFP и маркера зрелых нейронов NeuN [22].
eGFP-положительные клетки обнаружены во всех слоях фронтальной ассоциативной коры, однако их количество было наибольшим в слоях 2/3 и 5 ^(1.298,5.191) = 41.47, р = 0.0009; попарные сравнения слоев 2/3 и 5 с другими слоями: р < 0.02), тогда как в слое 1 выявлялись только единичные нейроны, прошедшие Сге-рекомбинацию (рис. 8А). При этом доля eGFP-положительных клеток от всех нейронов, помеченных NeuN, также была наибольшей в слоях 2/3 и 5 ^(1.203,4.812) = 7.122, р = 0.0425; попарные сравнения слоев 2/3 и 5 со слоем 6: р < 0.02), и для всей фронтальной ассоциативной коры составляла в среднем 11.0% (рис. 8Б).
Использование Cre-рекомбинации для выявления двух популяций когнитивно активных нейронов в одном мозге
Активность Сге-рекомбиназы приводит к перманентному маркированию нейронов, активных во временном окне, ограниченном действием тамоксифена. Это открывает возможность повторно помещать такое животное с генетически маркированными нейронами в ситуацию приобретения нового или реактивации прошлого опыта, и затем выявлять в одном мозге две
Б
Fos-GFP
,. PV
1
* 4 ----
£: •
*
, 2/3
i ■ *
1 •
V1 i
i ф
'1 ■ ; 4
i'-f Ъ 5
*
' ■ г' .** * t
Щш * " -i
• . / " , ' *
* * *
в *
6
Б ' '■"■ V :."' ' ■ * ■ ' *■ Fos-GFP PV' CA1
СД2 -V Ts
САЗ DG
-
Рис. 4. Совместная окраска на eGFP (нейроны, прошедшие опыт-зависимую Cre-рекомбинацию, зеленый канал) и маркер интернейронов пар-вальбумин (PV, красный канал). А - неокортекс (фронтальная ассоциативная кора), цифрами отмечены слои неокортекса; Б - дорсальный гиппокамп; шкала: 150 мкм. На микрофотографиях а и б показаны выделенные рамками на А и Б области в неокортексе и гиппокампе соответственно; шкала: 70 мкм. СА1 - зона СА1 гиппокампа; СА2 - зона СА2 гиппокампа; СА3 - зона СА3 гиппокампа; DG - зубчатая фасция гиппо-кампа
А Fos-GFP
SOM
К
2/3 •
— ■ ' i
i . * | t
' .1 á
5 i
t m \ *
é
■ .1t V. > ' ■■ i ~ «
6 t K1 -I
'i '. ■; ■ ■
Б ' Fos-GFP
CA1 SOM
CA2
\ DG
CA3
■. "-
Рис. 5. Совместная окраска на eGFP (нейроны, прошедшие опыт-зависимую Сге-рекомбинацию, зеленый канал) и маркер интернейронов сома-тостатин ^ОМ, красный канал). А - неокортекс (фронтальная ассоциативная кора), цифрами отмечены слои неокортекса; Б - дорсальный гиппокамп; шкала: 150 мкм. На микрофотографиях а и б показаны выделенные рамками на А и Б области в неокортексе и гиппокампе соответственно; шкала: 70 мкм. СА1 - зона СА1 гиппокампа; СА2 - зона СА2 гиппокампа; СА3 - зона СА3 гиппокампа; DG - зубчатая фасция гиппо-кампа
отдельные популяции нейронов, активные при двух разных когнитивных нагрузках. При этом нейроны, прошедшие Сге-рекомбинацию после первого когнитивного эпизода, можно выявить по наличию белка eGFP, а нейроны, активированные после второго эпизода, можно визуализировать иммуногистохимиче-ски по присутствию белка с-Fos.
Ранее во фронтальной ассоциативной коре выявлен высокий уровень перекрытия популяций нейронов, помеченных при обследовании мышами новой обстановки (первый когнитивный эпизод) и после-
дующем нанесении немедленного ЭКР в этой же обстановке через 25 мин после ее обследования (второй когнитивный эпизод) [26]. В связи с этим в нашем эксперименте для визуализации двух популяций нейронов, вовлеченных в различные когнитивные эпизоды, мышам давали обследовать новую обстановку на фоне действия тамоксифена и через 3 дня наносили немедленное ЭКР. Двойное иммуногистохимиче-ское окрашивание образцов мозга позволило выявить нейроны активные при обследовании обстановки (по белку eGFP) или при нанесении немедленного ЭКР
Б СА1 Fos-GFP ■NPY .
СА2 \ ч
САЗ DG
б 4
Рис. 6. Совместная окраска на eGFP (нейроны, прошедшие опыт-зависимую Cre-рекомбинацию, зеленый канал) и маркер интернейронов нейро-пептид Y (NPY, красный канал). А - неокортекс (фронтальная ассоциативная кора), цифрами отмечены слои неокортекса; Б - дорсальный гиппокамп; шкала: 150 мкм. На микрофотографиях а и б показаны выделенные рамками на А и Б области в неокортексе и гиппокампе соответственно; шкала: 70 мкм. СА1 - зона СА1 гиппокампа; СА2 - зона СА2 гиппокампа; СА3 - зона СА3 гиппокампа; DG - зубчатая фасция гиппо-кампа
. . СаМКИ
-* í £л. i -А
■ ; Л
* .
Б CA1 ÉOs'-GFP CaMKII
CA2
Ж
САЗ 3 с □ G
а
*
i
f> v - ¿ ' _
w
Рис. 7. Колокализация eGFP-положительных нейронов, прошедших опыт-зависимую Cre-рекомбинацию (зеленый канал), с маркером пирамидных нейронов CaMKII (красный канал). А - неокортекс (фронтальная ассоциативная кора), цифрами отмечены слои неокортекса; Б - дорсальный гиппокамп, отмечены зоны СА1, CA2, CA3 и зубчатая фасция (DG); шкала: 150 мкм. На микрофотографиях а и б показаны выделенные рамками на А и Б области в не-окортексе и гиппокампе соответственно; шкала: 70 мкм. B и Г - микрофотографии отдельных нейронов, прошедших опыт-зависимую Cre-рекомбинацию в неокортексе и гиппокампе соответственно. Видны дендритные деревья клеток и отходящие от сомы аксоны; шкала: 20 мкм
А
б
(по белку c-Fos), а также нейроны, которые были активны в обоих когнитивных эпизодах (eGFP и c-Fos) в различных областях мозга мышей (рис. 9).
Нами проведена оценка количества нейронов, активированных при обследовании обстановки и последующем нанесении немедленного ЭКР, а так-
ь А
э
* 0 40-
а)
с
х 30
+
О.
О 20
о
ь с 10
е
х с о 0
Б
^ 25-1 +
15 20-<и
^ 154
+
? 10
■ ■
+ 5-1
О. и_
1:5 о
1 2/3 5
1 2/3 5
Л
6 всего
Рис. 8. Анализ паттернов распределения нейронов, прошедших опыт-зависимую Сге-рекомбинацию после обследования животным новой обстановки, по слоям фронтальной ассоциативной коры. А - количество eGFP-положительных клеток; Б - доля eGFP-положительных клеток от всех нейронов, выявленных по окраске на NeuN. Цифрами обозначены слои неокортекса, столбец «всего» - среднее значение по всей фронтальной ассоциативной коре. * - р <0.02, +— р <0.02 при сравнении со слоями 1 и 6 соответственно, /-тест Сидака. Данные представлены как среднее ± 95% доверительный интервал
же степени перекрытия этих популяций нейронов, во фронтальной ассоциативной коре мышей группы «А - А + ЭКР» и контрольных мышей из группы «А - В +ЭКР» (рис. 10). Обследование новой обстановки и нанесение немедленного ЭКР активировали сходные по объему популяции нейронов фронтальной ассоциативной коры, однако большее число нейронов активировалось в том случае, если ЭКР наносили в ранее обследованной обстановке А, чем в новой обстановке В (фактор «группа»: F(1,8) = 12.33, р = 0.0080; фактор «когнитивный эпизод»: F(1,8) = 11.37, р = 0.0098; взаимодействие факторов: F(1,8) = 3.947, р = 0.0404; сравнение количества с-Fos-положительных клеток у групп «А - А + ЭКР» и «А - В + ЭКР»: р = 0.0212) -см. рис. 10А. Кроме того, нанесение ЭКР в знакомой обстановке активировало больше нейронов, чем ее изначальное обследование (сравнение количества с-Fos-положительных и eGFP-положительных клеток у группы «А - А + ЭКР»: р = 0.01924). При этом доля нейронов, активных во время обследования новой обстановки и затем повторно активировавшихся при нанесении ЭКР, была значимо выше у группы «А - А + ЭКР» (48.8%), чем у группы «А - В + ЭКР» (4.2%) - р < 0.0001. Аналогичный результат получен и для доли нейронов, активных в обоих когнитивных эпизодах, от всех нейронов, активируемых при нанесении ЭКР (рис. 10Б).
Результаты этого эксперимента указывают на возможность использования метода Сге-управляемого
<ЗРР - - Рое СРР+Роз
... -1.
• , . * • * * •*
•V . • * • • • , •
V 11»,«ЛГ- « • ! « I
•. *
V* - ' . ■ ■
» • # ' «9 ,
• ■ -
Б ■ " * * к БРР . р05 С егр+роз
■ • ч •
В ОРР
Рм • " (ЗРР+Ров
" - Л ^ *
..в ' Нг*;'"? -• * 4 * * "
|в1 •л
Рис. 9. Иммуногистохимическое выявление нейронов, активных во время двух когнитивных эпизодов. Нейроны, активные во время первого эпизода, обследования новой обстановки, помечены eGFP (зеленый канал); клетки, активные во время второго эпизода, нанесения ЭКР, помечены эндогенным белком c-Fos (красный канал). Белым псевдоцветом окрашены клетки, положительные как по eGFP, так и по с^об -т.е. активные в обоих когнитивных эпизодах. А - фронтальная ассоциативная кора, цифрами отмечены слои неокортекса; Б - зубчатая фасция гиппокампа; В - паравен-трикулярное ядро таламуса; шкала: 100 мкм. На микрофотографиях в1, в2, в3 показана область, выделенная рамкой на В, отдельно по каналам: в1 - цитоплазматическая окраска на eGFP; в2 - ядерная окраска на с^об; в3 - их наложение; шкала: 70 мкм
6
А
л Б
— А - А+ЭКР |_| А - В+ЭКР
А - А+ЭКР А - В+ЭКР
Рис. 10. Количественный анализ перекрытия популяций нейронов фронтальной ассоциативной коры, активных во время двух когнитивных эпизодов. Л - популяции нейронов, активных при обследовании обстановки А (клетки, положительные по eGFP) и нанесении немедленного ЭКР (клетки, положительные по с-Fos); Б - доля нейронов, активных в обоих когнитивных эпизодах, от всех нейронов, вовлекшихся в обследование новой обстановки (GFP+Fos+ / GFP+), или от всех нейронов, вовлекшихся в нанесение немедленного ЭКР (GFP+Fos+/Fos+). # - р = 0.0192 при сравнении количества с-Fos-положительных и eGFP-положительных клеток у группы «А - А + ЭКР», @ - р = 0.0212 при сравнении количества с-Fos-положительных клеток у групп «А - А + ЭКР» и «А - В + ЭКР», /-тест Сидака; * - р <0.0001 при сравнении с группой «А - В + ЭКР», двухвыборочный /-критерий. Данные представлены как среднее ± 95% доверительный интервал
генетического маркирования нейронов для выявления и последующего анализа популяций нейронов, активных в одном мозге во время двух разных когнитивных эпизодов.
Ранее для мечения двух популяций когнитивно активных нейронов была применена трансгенная технология, основанная на использовании системы СТАЧеЮ. В статье Reijmers и соавт. систему 1ТАЧе-Ю использовали для анализа перекрытий популяций нейронов, активных во время формирования и реактивации памяти [27]. При этом для сопоставления этих популяций использовали два разных генетических маркера транскрипционной активации клеток - c-fos и zif268. Однако известно, что эти два гена имеют различный базовый уровень экспрессии, различные клеточные функции, разную специфичность по отношению к типам клеток мозга и активируются в ответ на различающиеся типы когнитивной активности животных [28]. Поэтому соотнесение вовлечения популяций нейронов в два эпизода когнитивной активности по этим двум различающимся маркерам представляет большие теоретические сложности и вызывает серьезные возражения. Кроме того, система 1ТА-1еЮ имеет и ряд методических ограничений: трансгенным мышам 1ТА-1еЮ в течение всей жизни необходимо вводить доксициклин, а генетическое маркирование нейронов возможно только в пе-
риод отмены препарата. При этом временное окно активации системы после отмены доксициклина может занимать несколько дней, что приводит к большому числу неспецифически маркированных нейронов [27, 29]. Таким образом, трансгенная система с Сге-рекомбиназой представляется более адекватной для применения в экспериментах по выявлению в одном мозге двух нейрональных сетей, активных в разных когнитивных эпизодах.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе получены двойные трансгенные мыши Fos-Cre-eGFP, у которых в результате опыт-зависимой Сге-рекомбинации происходит генетическое маркирование нейронов, активных в период действия тамоксифена. У данных мышей наблюдали низкий фоновый уровень Сге-рекомбинации в спокойном состоянии и значительное увеличение количества eGFP-экспрессирующих генетически маркированных нейронов после эпизода приобретения нового опыта. Опыт-индуцированная Сге-рекомбинация у этих мышей проходит в большом числе структур головного мозга, принадлежащих к разным функциональным группам. При этом Сге-рекомбинация проходит в пирамидных возбуждающих нейронах, но не в тормозных интернейронах. Также показано, что метод Сге-опосредованного генетического мар-
кирования нейронных сетей может быть успешно применен для выявления в одной нервной системе активности двух разных популяций нейронов, связанных с разными когнитивными эпизодами, а также для анализа степени перекрытия этих популяций нейронов.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-15-00685). Работа проведена с использованием оборудования Ресурсного центра нейрокогнитивных исследований Курчатовского комплекса НБИКС-технологий.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анохин К.В. // Журн. высш. нервн. деят. им. И.П. Павлова.
1997. Т. 47. № 2. С. 262-286.
2. Kaczmarek L. // Handbook of Chem. Neuroanatomy. Amsterdam: Elsevier, 2002. V. 19. P. 189-215.
3. Korb E., Finkbeiner S. // Trends Neurosci. 2011. V. 34. № 11. P. 591-598.
4. Perez-Cadahla B., Drobic B., Davie J.R. // Biochem. Cell Biol. 2011. V. 89. № 1. P. 61-73.
5. Anokhin K.V., Rose S.P. // Eur. J. Neurosci. 1991. V. 3. № 2. P. 162-167.
6. Alberini C.M. // Physiol. Rev. 2009. V. 89. P. 121-145.
7. Abramova A.B., Anokhin K.V. // Neurosci. Behav. Physiol.
1998. V. 28. № 6. P. 616-619.
8. Zvorykina S.V., Anokhin K.V. // Neurosci. Behav. Physiol. 2004. V. 34. № 8. P. 869-872.
9. Kuptsov P.A., Pleskacheva M.G., Voronkov D.N., Lipp Kh.P., Anokhin K.V. // Neurosci. Behav. Physiol. 2006. V. 36. № 4.
P. 341-350.
10. Barth A.L., Gerkin R.C., Dean K.L. // J. Neurosci. 2004. V. 24. № 29. P. 6466-6475.
11. Branda C.S., Dymecki S.M. // Dev. Cell. 2004. V. 6. P. 7-28.
12. Nagy A. // Genesis. 2000. V. 26. P. 99-109.
13. Wu S., Ying G., Wu Q., Capecchi M.R. // Nat. Genet. 2007. V. 39. P. 922-930.
14. Metzger D., Clifford J., Chiba H., Chambon P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 6991-6995.
15. Feil R., Wagner J., Metzger D., Chambon P. // Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 1997. V. 237. P. 752-757.
16. Imayoshi I., Sakamoto M., Kageyama R. // Front. Neurosci. 2011. V. 5. № 64. P. 1-11.
17. Taniguchi H., He M., Wu P., Kim S., Paik R., Sugino K., Kvitsani D., Fu Y., Lu J., Lin Y., et al. // Neuron. 2011. V. 71. P. 998-1013.
18. Guenthner C.J., Miyamichi K., Yang H.H., Heller H.C., Luo L. // Neuron. 2013. V. 78. № 5. P. 773-784.
19. Воробьева Н.С., Ивашкина О.И., Торопова К.А., Анохин К.В. // Журн. высш. нервн. деят. им. И.П. Павлова. 2016. Т. 66. № 3. С. 352-360.
20. Fraklin K.B.J., Paxinos G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. 3rd ed. N.Y.: Acad. Press, 2007. 346 p.
21. Tovote P., Fadok J.P., Luthi A. // Nat. Rev. Neurosci. 2015. V. 16. P. 317-331.
22. Mullen R.J., Buck C.R., Smith A.M. // Development. 1992. V. 116. № 1. P. 201-211.
23. Funchs E., Weber K. // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 345-382.
24. Liu X.B., Murray K.D. // Epilepsia. 2012. V. 53. P. 45-52.
25. Markram H., Toledo-Rodriguez M., Wang Y., Gupta A., Silberberg G., Wu C. // Nat. Rev. Neurosci. 2004. V. 5. № 10. P. 793-807.
26. Nakayama D., Baraki Z., Onoue K., Ikegaya Y., Matsuki N., Nomura H. // Curr. Biol. 2015. V. 25. № 1. P. 117-123.
27. Reijmers L.G., Perkins B.L., Matsuo N., Mayford M. // Science. 2007. V. 317. P. 1230-1233.
28. Lee J.L., Everitt B.J., Thomas K.L. // Science. 2004. V. 304. № 5672. P. 839-843.
29. Glazewski S., Bejar R., Mayford M., Fox K. // Neuropharmacology. 2001. V. 41. P. 771-778.
