CC BY
72
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (142-143), 2010
Н.В. Маркин1,
кандидат биологических наук О.Ф. Горбаченко2, кандидат сельскохозяйственных наук М.А. Тихонова1, аспирантка А.В. Усатов1, доктор биологических наук
1НИИ биологии Южного федерального университета, Россия, 344090, Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1 тел.: (863) 243-33-94, e-mail: nmarkin@mail. ru.
2ГНУ ДОС им. Л.А. Жданова ВНИИМК Россельхозакадемии тел.: 8-928-7616-732
КОДОМИНАНТНЫЕ МАРКЕРЫ ГЕНА Е/1 КУЛЬТУРНОГО ПОДСОЛНЕЧНИКА
Ключевые слова: цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС), гены восстановители
фертильности пыльцы (Я/), 8САЯ-маркеры, маркер-вспомогательная селекция, подсолнечник, ИеИаШкш.
УДК 575.12:547.962:633.854
Введение. Основой современного производства товарных семян подсолнечника являются высокопродуктивные межлинейные гибриды, для получения которых селекционеры используют систему генетического контроля опыления растений, состоящую из материнских линий с цито-плазматической мужской стерильности (ЦМС) на основе цитоплазмона однолетнего дикорастущего вида Н. petiolaris (РЕТ1), и отцовских линий-восстановителей фертильности пыльцы - доноров ядерных генов Я/.
В литературе широко обсуждаются молекулярные механизмы взаимодействия ядерных и цитоплазматических генов, лежащих в основе ЦМС и восстановления фертильности пыльцы у гибридов [1, 2]. Показано, что у подсолнечника ЦМС типа РЕТ1 является результатом реорганизации митохондриального генома растений. В настоящее время уже определена инсерция размером 5 т.п.н., которая возникает на границе с геном atpA и образует новую открытую рамку считывания. Вследствие этого синтезируется новый котранскрипт atpA-or/H522 и белок с молекулярной массой 16 кДа, который, как предполагают, встраиваясь в мембраны митохондрий, блокирует цепь транспорта электронов, тем самым нарушая энергетический баланс в спорогенных клетках [3, 4, 5]. Ядерные гены Я/, контролируют реакцию полиаденилирования atpA-or/H522 транскрипта, что индуцирует его разрушение РНКазой II и в конечном итоге приводит к восстановлению фертильности пыльцы [6].
Гибридологический анализ различных линий-восстановителей ЦМС РЕТ1 позволил определить от одного до четырех ядерных генов с различными типами взаимодействия, супрессирую-щих фенотипический эффект ЦМС РЕТ1 [7]. В то же время установлено, что у большинства линий культурного подсолнечника восстановление мужской фертильности пыльцы у гибридов контролируют в основном два доминантных гена - Я/1 и Я/2. При этом ген Я/2 локализован в геномах практически всех инбредных линий, включая линии-закрепители стерильности, и только ген Я/1 в основном определяет восстановительный потенциал мужской линии [7, 8, 9]. В связи с тем, что создание новых генетических систем ЦМС-И1 на основе ядерно-цитоплазматических комбинаций имеет большую практическую значимость, а идентификация новых генотипов с генами Я/ классическим методом гибридологического анализа длительна и трудоемка, проблема быстрого и точного
определения доноров генов Rf в генофонде этой сельскохозяйственной культуры чрезвычайно актуальна.
Одним из перспективных вспомогательных инструментов поиска растений, восстанавливающих фертильность пыльцы линий ЦМС, является использование надежных ДНК-маркеров, сцепленных с генами Rf. В настоящее время генетическое маркирование гена r/1 проведено с помощью RFLP, RAPD, AFLP, SSR, TRAP маркеров [10, 11, 12, 13, 14]. Многие из них тесно сцеплены с геном Rf1 и демонстрируют определенную надежность в идентификации генотипов-восстановителей фертильности пыльцы ЦМС на основе H. petiolaris.
Ранее нами было показано, что SCAR-маркер HRG02/OPY10, разработанный Р. Хорн с сотрудниками [12], может служить в качестве идентификатора не только восстановителей фертильности пыльцы ЦМС PET1, но и ЦМС RIG0 [15]. Описанные в литературе SCAR-маркеры гена r/1 подсолнечника демонстрируют доминантный тип наследования. Однако известно, что кодоминант-ные маркеры, позволяющие определять аллельные варианты генов, ассоциированные с хозяйственно полезными признаками, являются более информативными для маркер-вспомогательной селекции [16].
В связи с этим целью настоящей работы является амплификация кодоминантных маркеров гена r/1 - восстановителя фертильности пыльцы цитоплазматической мужской стерильности PET1 культурного подсолнечника и определение их нуклеотидного полиморфизма.
Материал и методы. Материалом исследования служили селекционно ценные линии культурного подсолнечника, созданные сотрудниками Донской опытной станции им. Л.А. Жданова ВНИИМК для производства коммерческих высокоурожайных гетерозисных гибридов Fj. Линии-восстановители фертильности пыльцы получены путем самоопыления из восстановленных гибридов или из специально созданных синтетиков и являются гомозиготными по доминантному гену Rf1 (r/1r/1). Линии ЦМС (PET1) получены путем беккроссирования (8-10 беккроссов) стерильных растений (ЦМС) и фертильных растений закрепителей стерильности пыльцы (В-форма), в генотипах которых нет доминантных аллелей Rf1 (rf1rf1). Описание родительских линий и полученных на их основе гибридов F1 приведено в таблице 1.
Для определения молекулярно-генетических маркеров гена Rf1 у исследуемых форм подсолнечника геномную ДНК экстрагировали из молодых листьев по описанной ранее методике [17]. Амплификацию специфического участка ДНК сцепленного (0,8 сМ) с геном Rf1 подсолнечника -HRG01 инициировали с помощью SCAR-праймеров - OPK13, разработанных Р. Хорн с сотрудниками [12]. ПЦР-смесь объемом 25 мкл содержала 67 мМ трис-HCl pH 8,4, 16 мМ (NH^SO^ 2,5 мМ MgSO4, 0,1 мМ меркаптоэтанола, 0,25 мМ каждого ДНТФ (ДАТФ, ДЦТФ, ДТТФ, ДГТФ), 15 пмоль праймера, 2,5 ед. Taq-полимеразы, 30 нг выделенной ДНК. Реакцию амплификации проводили в термоциклере Palm Cycler (Corbett Research, Австралия) по двум программам различающихся температурой отжига праймеров: 1) один цикл: 1 мин 94 °С; 35 циклов: 45 сек. 94 °С , 45 сек. 58 °С, один цикл: 7 мин 72 °С и 2) один цикл: 1 мин 94 °С; 35 циклов: 45 сек. 94 °С , 45 сек. 54 °С, один цикл: 7 мин 72 °С. Ампликоны разделяли электрофоретически в 1,7 % агарозном геле с бромистым этиди-ем и визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Gel Doc 2000 (BioRad, USA).
Очистку фрагментов амплифицированной ДНК для последующего прямого секвенирования выполняли согласно E. Werle [18]. Секвенирование проводили на генетическом анализаторе 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA) с использованием набора реагентов BigDye Terminator v.3.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Хромотограммы анализировали с помощью пакета программ DNAStar.
Результаты и обсуждение. Кодоминантные маркеры гена-восстановителя фертильности пыльцы (r/1) ЦМС PET1 определяли у родительских линий культурного подсолнечника с известными по гену Rf1 генотипами, установленными гибридологическим анализом: доминантные гомозиготы (r/r/1), рецессивные гомозиготы (rf1rf1) и их гибридов F1 (r/1 r/1) (см. табл. 1). Для подтверждения присутствия/отсутствия в генотипе исследуемых форм доминантного гена Rf1 проведен молекулярно-генетический анализ геномной ДНК на наличие локуса HRG01, сцепленного (0,8 сМ) с геном r/1, методом энзиматической амплификации, используя SCAR-праймеры OPK13.
№ Линия Генотип Фенотип Маркер HRG01
1 ЦМС Н 981 А rf1rf1 Стерильная -
2 Н 026 А rf1rf1 Стерильная -
3 IS 1544 А rf1rf1 Стерильная -
4 Восстановители фертильности пыльцы J-8/RT 991 RF Rf1Rf1 Фертильная +
5 J-8/ХФ 4917 RF Rf1Rf1 Фертильная +
6 ВД 114 RF Rf1Rf1 Фертильная +
7 Гибриды F1 Н 981 А х J-8/RT 991 RF Rf1rf1 Фертильный +
8 Н 026 А х J-8/ХФ 4917 RF Rf1rf1 Фертильный +
9 IS 1544 А х DL 114 RF Rf1rf1 Фертильный +
Результаты ПЦР анализа свидетельствуют, что маркер присутствует у гомозиготных (Л/1Л/1) линий-восстановителей фертильности пыльцы - 1-8/ЯТ 991, 1-8/ХФ 4917, ББ114, и гетерозиготных (//1) гибридов - Н 981А х 1-8/ЯТ 991, Н 026А х 1-8/ХФ 4917 и к 1544А х ББ114. У растений ЦМС-линий (г/1г/1) Н 981А, Н 026А, к 1544А - данный маркер не идентифицирован. В случае определения 8САЯ-маркера на электрофореграмме четко визуализируется фрагмент около 450 п.н, что соответствует размеру искомого локуса (рис. 1).
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рисунок 1 - Электрофореграмма продуктов амплификации локуса HRG01, сцепленного
с геном Rf1, при температуре отжига праймеров 58 оС. 1, 2, 6 - ЦМС-линии (rflrfl): Н 981 А, Н 026 А и IS 1544 А соответственно; 3, 4, 5 - линии-восстановители фертильности пыльцы (RflRfl): J-8/RT 991, J-8/ХФ 4917 и BD114 соответственно; 7, 8, 9 - гибриды F1 (rf1rf1): H 981A x J-8/RT 991, H 026A x J-8/ХФ 4917 и Is 1544A x BD114 соответственно. М - маркер (100 - 1000 bp)
Эти результаты полностью согласуются с данными гибридологического анализа, что служит подтверждением идентификационной ценности маркера HRG01 для маркер-вспомогательной селекции подсолнечника при создании родительских линий системы ЦМС-Rf PET1.
Необходимо отметить, что амплифицируемый (температура отжига праймеров 58 оС) фрагмент является доминантным маркером, позволяющим проводить сравнительный анализ исследуемых генотипов по принципу наличие-отсутствие [12]. Однако известно, что SCAR- маркеры, полученные на основании нуклеотидной последовательности доминантных RAPD-фрагментов, могут быть кодоминантны в случаях, когда сайты связывания праймеров у аллельных локусов отличаются инсерциями или делециями. Методические особенности создания SCAR-праймеров подробно описаны в работе О.В. Ковезы, С.А Гостимского [19]. Эти же авторы показали, что некоторые SCAR-маркеры генома гороха в зависимости от температуры отжига демонстрируют полиморфизм нуклеотидной последовательности сайтов прайминга. Следовательно, единичные некомплементарные нуклеотиды в системе праймер-матрица дестабилизируют начальные этапы амплификации и уменьшают выход неспецифического продукта ПЦР, а температура отжига (Ta) праймеров, как один из важнейших параметров высокоспецифичной ПЦР-системы, оказывает оптимизирующий (по специфичности) эффект. Таким образом, если различия сайтов прайминга представлены однонуклеотидным полиморфизмом, изменяя Ta, можно подобрать условия, при которых будет амплифицироваться и другой аллельный локус.
В результате снижения температуры отжига праймеров ОРК13 с 58 оС до 54 оС (уменьшена специфичность ПЦР) в реакции амплификации геномной ДНК гомозиготных образцов (Я/1Я/1 и г/1г/1) синтезировались различающиеся по подвижности в агарозном геле фрагменты (рис. 2).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов амплификации локуса НЯ001, сцепленного с геном я/1, при температуре отжига праймеров 54 оС. 1, 2, 6 - ЦМС-линии (г/1г/1): Н 981 А, Н 026 А и 18 1544 А соответственно; 3, 4, 5 - линии-восстановители фертильности пыльцы (я/1 я/1): 1-8/ЯТ 991, 1-8/ХФ 4917 и ББ114 соответственно; 7, 8, 9 - гибриды (Я/1г/1): Н 981А х 1-8/ЯТ 991, Н 026А х 1-8/ХФ 4917 и 18 1544А х ББ114 соответственно.
Так, у всех трех ЦМС-линий (г/1г/1) получен единичный фрагмент размером около 350 п.н. Однако в генотипах двух отцовских линий (Я/1Я/1) - 1-8/ХФ 4917 КБ и ВД 114 ЯР - определен один маркерный фрагмент размером около 450 п.н., а у линии 1-8/ЯТ 991 ЯР - два фрагмента размерами около 450 и 350 п.н. У всех гибридных растений (Я/1г/1) инициируется амплификация также этих двух фрагментов (450 и 350 п.н.) (рис. 2).
Таблица 2 — Полиморфные сайты кодоминантных маркеров гена Rf1
№ Полиморфные сайты
108 109 110 114 128 153 167 169 171 174 179 184 199 200 209 210 224 229 230 243 278 292 327 333
1 Т C A T T T A T A T G A G A A C C G A G G - A G
2 Т C A T T T A T A T G A G A A C C G A G G - A G
3 T C A T T T A T A T G A G A A G C G A G G - A G
4 A T C C G C T A G C A T A G G C T A C T A C G A
5 A T C C G C T A G C A T A G G C T A C T A C G A
6 A T C C G C T A G C A T A G G C T A C T A C G A
Примечание: 1, 2, 3 - нуклеотидная последовательность SCAR-маркера гена Rf1, амплифицированного
на геномной ДНК линий-восстановителей фертильности пыльцы (температура отжига праймеров 58 оС) - J-8/RT 991, J-8/ХФ 4917 и ВД 114 соответственно; 4, 5, 6 - нуклеотидная последовательность SCAR-маркера гена Rf1, амплифицированного на геномной ДНК ЦМС-линий (температура отжига праймеров 54 оС) - Н 981 А, Н 026 А и IS 1544 А соответственно.
Это означает, что снижение температуры отжига праймеров OPK13 приводит к амплификации кодоминантных маркеров. Однако амплификация одновременно двух фрагментов у одной из трех линий-восстановителей фертильности пыльцы указывает, что сайты отжига SCAR-праймеров при Ta=54 оС полиморфны и, по-видимому, различаются точковыми мутациями.
Известно, что однонуклеотидные перестройки (ОНП, single nucleotide polymorphisms, SNP) лежат в основе возникновения новых аллелей. Высокая плотность и эволюционная стабильность ОНП делают их одними из наиболее удобных генетических маркеров [20]. В этой связи с целью локализации полиморфных сайтов была исследована нуклеотидная последовательность фрагментов геномной ДНК гомозиготных по гену Rf1 линий, амплифицированных при различных температурах отжига праймеров (58 оС (Rf1Rf1) и 54 оС (rf1rf1) с помощью прямого секвенирования продуктов ПЦР, и выявлены гомологичные позиции сравниваемых последовательностей. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей кодоминантных маркеров гена Rf1 гомозиготных линий подсолнечника по распределению полиморфных сайтов приведены в таблице 2. Прямое сек-венирование фрагментов амплификации локуса HRG01 трех доминантных (температура отжига
праймеров 58 оС) и трех рецессивных (температура отжига праймеров 54 оС) гомозиготных по гену Rf1 образцов позволило определить последовательности нуклеотидов участка размером 355 п.н. и 247 п.н. соответственно. Сравнительный анализ выровненных по длине всех шести нуклеотидных последовательностей показал, что степень молекулярно-генетического сходства между маркерами одного ал-лельного варианта составляет 99,6-100 %, между различными аллельными вариантами - 90,7-91,1 %.
Выравнивание шести последовательностей нуклеотидов на участке размером 247 п.н. (с 108 по 355 сайт) выявило 223 гомологичных и 24 полиморфных позиций (см. табл. 2). В основном нуклеотид-ные замены были выявлены при сравнении сиквенсов двух различных локусов (аллелей). Исключением является 210 позиция доминантного аллельного варианта, где определена трансверсия пиримидинового основания на пуриновое (С ^ G). В остальных случаях различия обусловлены следующими заменами: A/G (T/C) - 14 (61 %), A/C (T/G) - 4 (17 %), A/T - 4 (17 %) и одна (4 %) - делеция.
Рассмотренный выше однонуклеотидный полиморфизм представляет практический интерес для разработки простых и эффективных тест-систем на основе ПЦР, позволяющих выявлять гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации, ассоциированные с изучаемым признаком.
Таким образом, путем снижения температуры отжига SCAR-праймеров OPK13, фланкирующих локус HRG01, сцепленный с геном rf1, инициирована амплификация двух кодоминантных маркеров. При этом один размером около 450 п.н. - ассоциирован с доминантным фенотипом восстановления фертильности пыльцы, а другой - размером около 350 п.н. - с рецессивным. Исследование последовательности нуклеотидов этих маркеров позволило определить полиморфные сайты сравниваемых участков (аллелей), которые могут служить основой для разработки аллель -специфичной ПЦР тест-системы, позволяющей идентифицировать аллельные варианты гена-восстановителя фертильности пыльцы Rf1 в целях ее использования для маркер-вспомогательной селекции подсолнечника.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» № 2.1.1/4947).
Список литературы
1. Horn, R. Recombination: Cytoplasmic male sterility and fertility restoration in higher plants / R. Horn // Progress in Botany. - 2006. - Vol. 67. - P. 31-52.
2. Иванов, М.К. Цитоплазматическая мужская стерильность и восстановление фертильности пыльцы у высших растений / М.К. Иванов, Г.М. Дымшиц // Генетика. - 2007. - Т. 43. - № 4. - С. 451-468.
3. Kohler, T. Cytoplasmic male sterility in sunflower is correlated with the co-transcription of a new open reading frame with the atpA gene / T. Kohler, R. Horn, A. Lossl, K. Zetsche // Mol. Gen. Gen. -1991. - Vol. 262. - № 2. - P. 283-290.
4. Horn, R. A mitochondrial 16kD protein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower / R. Horn, R.H. Kohler, K.A. Zetsche // Plant Mol. Biol. - 1991. -Vol. 17. - P. 29-36.
5. Moneger, F. Nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in sunflower is associated with tissue-specific regulation of a novel mitochondrial gene / F. Moneger, C.J. Smart, C.J. Leaver // EMBO J. - 1994. - Vol. 86. - P. 259-268.
6. Gagliardi, D. Polyadenylation accelerates the degradation of the mitochondrial mRNA associated with cytoplasmic male sterility in sunflower / D. Gagliardi, C.J. Leaver // EMBO J. - 1999. -Vol. 18. - P. 3757-3766.
7. Serieys, H. Identificаtion, study, and utilization in breeding programs of new CMS sources / H. Serieys // Helia. - 1996. - Vol. 19. - P. 144-160.
8. Reddy, P.S. Inheritance of fertility restoration in sunflower (Helianthus annuus L.) / P.S. Reddy, B. Thammiraju // Euphytica. - 1977. - Vol. 26. - P. 409-412.
9. Анащенко, А.В. Изучение генетической системы ЦМС-Rf у подсолнечника (Helianthus annuus L.). Сообщ. II. Восстановление мужской фертильности у гибридов на основе ЦМСр / А.В. Анащенко, М.В. Дука // Генетика. - 1985. - Т. 21. - № 12. - С. 1999-2004.
10. Gentzbittel, L. Development of a consensus linkage RFLP map of cultivated sunflower (Helianthus annuus L.) / L. Gentzbittel, F. Vear, Y.X. Zhang, A. Berville // Theor. Appl. Genet. - 1995. -Vol. 90. - P. 1079-1086.
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (142-143), 2010
11. Berry, S.T. Molecular marker analysis of Helianthus annuus L. 2. Construction of a RFLP linkage map for cultivated sunflower / S.T. Berry, A.J. Leon, C.C. Hanfrey, P. Challis, A. Burkholz, S.R. Barnes, G.K. Rufener, M. Lee, P.D.S. Galigari // Theor. Appl. Genet. - 1995. - Vol. 91. - P. 195-199.
12.Horn, R. Molecular mapping of the Rf1 gene restoring pollen fertility in PET1 - based Fi hybrids in sunflower (Helianthus annuus L.) / R. Horn, B. Kusterer, E. Lazarescu, M. Prüfe, W. Friedt // Theor. Appl. Genet. - 2003. - Vol. 106. - P. 599-606.
13. Kusterer, B. Molecular mapping of the fertility restoration locus Rf1 in sunflower and development of diagnostic markers for the restorer gene / B. Kusterer, R. Horn, W. Friedt // Euphytica. - 2005.
- Vol. 143. - P. 35-43.
14. Yue, B. Genetic mapping for the Rf1 (fertility restoration) gene in sunflower (Helianthus annuus L.) by SSR and TRAP markers / B. Yue, B.A. Vick, X. Cai, J. Hu // Plant Breeding. - 2010. - Vol. 129. - I.1. - P. 24-28.
15. Маркин, Н.В. SCAR-маркер гена Rf1 подсолнечника у линий восстановителей фертильности пыльцы растений с различными типами ЦМС / Н.В. Маркин, М.А. Тихонова, И.Н. Анисимова, В.Т. Рожкова, В.А. Гаврилова, А.В. Усатов // Масличные культуры. - 2009. - Вып. 2 (141). - С. 3-5.
16. Irish, B.M. Characterization of a resistance locus (Pfs-1) to the spinach downy mildew pathogen (Peronospora farinose f. sp. spinaciae) and development of a molecular marker linked to Pfs-1 / B.M. Irish, J.C. Correll, C. Feng, T. Bentley, B.G. Reyes // Phytopathology. - 2008. - Vol. 98. - № 8. - P. 894-900.
17. Маркин, Н.В. RAPD-анализ генотипов солеустойчивых форм горчицы (Brassica juncea L.) / Н.В. Маркин, А.В. Усатов, М.Г. Федоренко // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. - 2006. - № 2. - С. 78-81.
18. Werle, E. Convenient single-step, one tube purification of PCR products for direct sequencing
/ E. Werle, C. Schneider, M. Renner, M. Volker, W. Fiehn // Nucl. Acids Res. - 1994. - Vol. 22. - № 20.
- p.4354-4355.
19. Ковеза, О.В. Создание и изучение SCAR-маркеров у гороха (Pisum sativum L.) / О.В. Ковеза, С.А. Гостимский // Генетика. - 2005. - Т. 41. - № 11. - С. 1522-1530.
20. Gupta, P.K. Single nucleotide polymorphisms: a new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants / P.K. Gupta, J.K. Roy, M. Prasad // Curr. Sci. - 2001. - Vol. 80. - P. 524-535.
