CC BY
2
Кни-виосЕисор новой топологии
Для ДЕТЕКЦии МАРКЕРА
острого инфаркта миокарда - ТРопоииНА I
DOI: 10.17691/stm2024.16.1.04 УДК 616.127-005.8-036.11:621.38 Поступила 22.09.2023 г.
A.А. Черемискина, младший научный сотрудник1;
B.В. Красицкая, к.б.н., старший научный сотрудник2:
В.М. Генералов, д.т.н., ведущий научный сотрудник1; профессор факультета автоматики и компьютерной инженерии3; Л.А. Франк, д.б.н., главный научный сотрудник2;
A.В. Глухов, к.т.н., зам. генерального директора по научной работе4; М.В. Кручинина, д.м.н., доцент, ведущий научный сотрудник5;
Г.А. Кудров, младший научный сотрудник1; Д.Е. Сердюк, инженер-конструктор 2-й категории4;
B.К. Грабежова, генеральный директор6
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559;
2Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук — обособленное подразделение ФИЦ КНЦ СО РАН, Академгородок, 50, стр. 50, Красноярск, 660036;
Новосибирский государственный технический университет, проспект К. Маркса, 20, Новосибирск, 630073; 4АО «Новосибирский завод полупроводниковых приборов Восток», ул. Дачная, 60, Новосибирск, 630082; Научно-исследовательский институт терапии и профилактической медицины — филиал Федерального исследовательского центра Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, ул. Бориса Богаткова, 175/1, Новосибирск, 630089; 6Дизайн-центр биомикроэлектронных технологий «ВЕГА», ул. Дачная, 60а, Новосибирск, 630082
Перспективным устройством для детекции биологических молекул, в частности таких как тропонин I, является биосенсор на основе полевых транзисторов на структурах кремний-на-изоляторе (КНИ-биосенсор), который позволяет проводить анализ в режиме реального времени без использования меток.
Цель исследования — разработка конструкции КНИ-биосенсора для детекции маркера острого инфаркта миокарда — тро-понина I.
Особенность биосенсора состояла в интеграции двух электродов заземления непосредственно на поверхность биосенсора, что эффективно уменьшало статический потенциал жидкого образца, а также сводило к минимуму физические поломки конструктивных элементов устройства.
Материалы и методы. Для специфической детекции маркера в качестве рецепторов использовали высокоспецифичный ан-ти-тропонин I ДНК-аптамер. Иммобилизацию аптамера на поверхность биосенсора проводили методом физической адсорбции. Анализируемый диапазон целевого тропонина I составил 10-11-10-9 моль/л, что соответствует клиническому уровню белка в биологической пробе при остром инфаркте миокарда. В течение эксперимента поддерживалось постоянное напряжение — Vds=0,15 В.
Результаты. КНИ-биосенсор успешно обнаружил целевые молекулы тропонина I в концентрации 10-11 моль/л, время анализа занимало примерно 200-300 с на одну пробу. В процессе детекции выявлено заметное снижение тока биосенсора. Это свидетельствует о том, что образующийся комплекс «тропонин I + анти-тропонин I ДНК-аптамер» обладает отрицательным эффективным электрическим зарядом на границе раздела фаз «жидкая проба-нанопроволока».
Для контактов: Черемискина Анастасия Алексеевна, e-mail: [email protected]
Ключевые слова: биосенсор; нанопроволока; кремний-на-изоляторе; полевой транзистор; тропонин I; инфаркт миокарда; ап-тамер; физическая адсорбция.
Как цитировать: Cheremiskina A.A., Krasitskaya V.V., Generalov V.M., Frank L.A., Glukhov A.V., Kruchinina M.V., Kudrov G.A., Serdyuk D.E., Grabezhova V.K. Novel SOI-biosensor topology for the detection of an acute myocardial infarction marker — troponin I. Sovremennye tehnologii v medicine 2024; 16(1): 37, https://doi.org/10.17691/stm2024.16.1.04
English
Novel SOI-Biosensor Topology for the Detection of an Acute Myocardial Infarction Marker - Troponin I
A.A. Cheremiskina, Junior Researcher1;
V.V. Krasitskaya, PhD, Senior Researcher2;
V.M. Generalov, DSc, Leading Researcher1; Professor, Faculty of Automation and Computer Engineering3;
L.A. Frank, DSc, Chief Researcher2;
A.V. Glukhov, PhD, Deputy General Director for Research4;
M.V. Kruchinina, MD, DSc, Associate Professor, Leading Researcher5;
G.A. Kudrov, Junior Researcher1;
D.E. Serdyuk, Design Engineer of Grade 24;
V.K. Grabezhova, General Director6
1Federal Budgetary Research Institution, State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559, Russia;
institute of Biophysics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Federal Research Center "Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences", 50/50 Bld., Akademgorodok St., Krasnoyarsk, 660036, Russia;
Novosibirsk State Technical University, 20 Prospekt K. Marksa, Novosibirsk, 630073, Russia;
"Joint Stock Company "Novosibirsk Factory of Semiconductor Devices VOSTOK", 60 Dachnaya St., Novosibirsk, 630082, Russia;
5Research Institute of Internal and Preventive Medicine — Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, 175/1 B. Bogatkov St., Novosibirsk, 630089, Russia;
6Joint Stock Company "Design Center for Biomicroelectronic Technologies Vega", 60a Dachnaya St., Novosibirsk, 630082, Russia
A biosensor based on field-effect transistors on silicon-on-insulator structures (SOI-biosensor) is a high-potential device for detection of biological molecules, for instance, such as troponin I; the biosensor allows conducting label-free real-time analysis.
The aim of the study is the development of SOI-biosensor design for detection of acute myocardial infarction marker — troponin I.
A notable feature of this design was the integration of two grounding electrodes directly onto the biosensor surface, which effectively nullified the static potential of the liquid sample and minimized physical breakdowns of biosensor elements.
Materials and Methods. The highly specific anti-troponin I DNA aptamer was used as a receptor for specific detection of protein marker. Aptamer immobilization on the biosensor surface was carried out by physical adsorption. The analyzed range of target troponin I molecules concentration in the sample varied within 10-11 to 10-9 mol/L, mirroring clinical levels observed in myocardial infarction cases. During the experiment, a constant voltage of Vds=0.15 V was maintained.
Results. The developed SOI-biosensor successfully detected target troponin I molecules at a concentration of 10-11 mol/L. The detection process exhibited an effective time of approximately 200-300 s per sample. Moreover, analysis of the detection process revealed a noticeable decrease in current within the source-drain circuit, indicative of the negatively charged complex formed by troponin I and anti-troponin I DNA-aptamer at the "liquid sample-nanowire" phase interface.
Key words: biosensor; nanowire; silicon-on-insulator; field-effect transistor; troponin I; myocardial infarction; aptamer; physical adsorption.
Введение
По данным Всемирной организации здравоохранения, ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает ведущее место среди основных причин смертности [1]. Нарушение кровоснабжения сердечной мышцы может
привести к развитию инфаркта миокарда (ИМ), вызванного атеросклеротическим поражением артерий и последующими некротическими процессами в сердечной ткани [2]. Степень поражения сердечной мышцы напрямую коррелирует со временем, прошедшим с момента начала заболевания и восстановления про-
//////////////////////^^^^
38 СТМ | 2024 | том 16 j №1 А.А. Черемискина, В.В. Красицкая, В.М. Генералов, Л.А. франк, А.В. Глухов, ..., В.К. Грабежова
ходимости пораженных сосудов, поэтому своевременная и точная диагностика играет решающую роль в оказании оперативной помощи пациенту.
Одним из диагностических подходов для выявления заболевания является обнаружение молекулярных маркеров, связанных с ИМ. Главным маркером, измеряемым в крови пациентов, считается тропонин I (сТп1) [3]. Этот белок обладает высокой клинической чувствительностью к ИМ и демонстрирует практически исключительную специфичность к ткани миокарда [4-8]. Повышенные уровни сТп1 в кровотоке указывают на гибель сократительных клеток миокарда [6]. Обычно нормальные концентрации сТп1 в сыворотке составляют менее 0,6 нг/мл (приблизительно 2,5х10-11 М) [9, 10]. Незначительное повреждение миокарда можно наблюдать при концентрациях сТп1 в диапазоне от 0,7 до
I,4 нг/мл, тогда как некротическое повреждение миокарда проявляется при концентрациях белка, превышающих 1,5 нг/мл [9].
Современным и перспективным методом детекции тропонина I является биосенсор на основе полевых транзисторов на структурах кремний-на-изоляторе (КНИ-биосенсор) [11-14], который позволяет проводить анализ в режиме реального времени без использования меток. Кроме того, на его основе можно создать портативный инструмент для мультикомплекс-ного анализа различных биологических частиц (белков, вирусных частиц, нуклеиновых кислот и т.д.) [8,
II, 12, 15, 16].
КНИ-биосенсор включает в себя два основных компонента: рецепторный слой (содержит антитела, ап-тамеры, ферменты и т.д.) и трансдьюсер — полевой транзистор, состоящий из кремниевой нанопроволо-ки, расположенной между электродами истока и стока [9]. Слой рецептора обеспечивает биоспецифическое распознавание целевой молекулы: взаимодействие между рецептором и целевой молекулой генерирует химический или физический сигнал. Затем этот сигнал преобразуется в электрический выходной сигнал трансдьюсером [8, 11, 15, 17-19]. Широкое применение получили КНИ-биосенсоры, в которых электрод заземления вводится непосредственно в анализируемую жидкую пробу по принципу «сверху» для устранения случайного электрического потенциала, вызванного ионами и заряженными молекулами [15, 17, 18, 20-22].
На рис. 1 показаны вариант конструкции и электрическая принципиальная схема подключения КНИ-биосенсора [11, 13, 15, 18, 20, 23, 24].
Относительно недавно в качестве рецепторов было предложено использовать аптамеры [25-30]. Они представляют собой короткие синтетические одноце-почечные дезокси- или рибоолигонуклеотиды, которые имеют уникальную форму и могут избирательно связываться с соответствующей целевой молекулой
Рис. 1. Вариант конструкции и электрическая принципиальная схема подключения КНИ-биосенсора [11, 13, 15, 18, 20, 23, 24]:
S — исток; NW — кремниевая нанопроволока; D — сток; SiO2 — скрытый диэлектрик; As — анализируемый раствор, содержащий целевые молекулы; Si-SUB — кремниевая подложка, или тыльный затвор; Vds — источник постоянного напряжения в цепи исток-сток; Vbg — регулируемый источник напряжения на подзатворе; Ids — амперметр; Ge — электрод заземления; native SiO2 — слой естественного оксида кремния
[29-31]. Подобно антителам, аптамеры проявляют высокую аффинность связывания.
Использование КНИ-биосенсора для детекции сТп1 и других биологических молекул осложнено рядом проблем, включая топологию и конструкцию биосенсора, оптимальные условия подготовки поверхности и вероятность того, что целевые молекулы адсорбируются на поверхность биосенсора [13, 15, 16, 20, 24, 32].
Цель исследования — разработка конструкции КНИ-биосенсора для детекции маркера острого инфаркта миокарда — тропонина I.
Материалы и методы
Структура КНИ-биосенсора. Разработана конструкция КНИ-биосенсора с двумя интегрированными электродами заземления на поверхности кристалла микросхемы. Топология кристалла и конструкция КНИ-биосенсора представлены на рис. 2 и 3 соответственно. Нестандартное изделие изготавливали на АО «Новосибирский завод полупроводниковых приборов Восток».
Массив из десяти КНИ-биосенсоров с п-типом проводимости сформирован на кремниевом кристалле размером 6*6 мм (рис. 2, а). Толщина слоя кремния ^^иВ) составила 28-30 нм, слоя скрытого диэлектрика ^Ю2) — 200 нм. Тыльная сторона кристалла приклеена к корпусу микросхемы, контакты осуществлены с помощью алюминиевых проводов. Нанопроволока (NW) биосенсора обладала следующими геометрическими характеристиками: высота (Н) — от 20 до 30 нм, ширина — 3 мкм и длина
— 10 мкм.
КНИ-биосенсоры подключены одним выходом к электроду заземления (3) и истоку (1). Второй выход подключен к контактным площадкам, выполняющим функцию стока, — 4 (см. рис. 2, а).
Рис. 2. Разработанное устройство:
а — топология кристалла на структуре кремний-на-изоля-торе: 1 — исток; 2 — КНИ-биосенсор; 3 — электрод заземления; 4 — сток; 5 — управляющий электрод (контактная площадка затвора); 6 — кристалл; 7 — типовые контактные площадки; б — фотография микросхемы, состоящая из кремниевого кристалла с массивом из десяти КНИ-био-сенсоров (1) и корпуса (2)
Рецептор
Рис. 3. Конструкция и электрическая принципиальная схема подключения разработанного КНИ-биосенсора:
S — исток; NW — кремниевая нанопроволока; D — сток; SiO2 — скрытый диэлектрик; As — анализируемый раствор, содержащий целевые молекулы; Si-SUB — кремниевая подложка, или тыльный затвор; Vds — источник постоянного напряжения в цепи исток-сток; Vbg — регулируемый источник напряжения на подзатворе; Ids — амперметр; Ge — электрод заземления; native SiO2 — слой естественного оксида кремния
КНИ-биосенсоры подключены к источнику постоянного напряжения — Vds (см. рис. 3). Режим работы биосенсора — Vds=0,15 В.
Материалы. В работе использовали хлорид натрия (NaCl), хлорид калия (KCl), гидрофосфат дина-трия (Na2HPO4), дигидрофосфат калия (KH2P04), хлорид магния (MgCl2), этанол (C2H5OH) производства Sigma-Aldrich (США) и рекомбинантный сердечный тропонин I (cTnI) — HyTest (Финляндия).
Высокоспецифичный анти-тропонин I ДНК-аптамер (TnAp12t2) (5'-GGAAGACAAGACATCGGGAGGGAGG GAGGGCAGTCTAGTCTCATGTGTTTCCATGGTTC-3') отобран методом SELEX с использованием биолюминесцентных репортеров для мониторинга обогащения ДНК-библиотек и оценки аффинности полученных кан-дидатных последовательностей [33]. Константа диссоциации (KD) комплекса «тропонин I + анти-тропонин I ДНК-аптамер» составила 6*10-9 моль/л [33].
Перед экспериментом аптамер термически денатурировали при 90°C в течение 5 мин в связывающем буфере (0,15 моль/л NaCl, 50 ммоль/л K-Na фосфатного буфера (рН=7,0) и 1 ммоль/л MgCl2). Затем аптамер ренатурировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Растворы TnAp12t2 и cTnI разбавляли дистиллированной водой (рН=5,9) непосредственно перед экспериментом для снижения ионной силы и проводимости растворов [23, 34].
Измерение. Модификацию поверхности КНИ-биосенсора для создания рецепторного слоя осуществляли посредством физической адсорбции [35]. На начальном этапе поверхность биосенсора промывали 96% этанолом, затем дистиллированной водой. Далее на поверхность наносили 5 мкл TnAp12t2 (CA=10-8 моль/л) и инкубировали в течение нескольких минут [36]. Сигналы биосенсора регистрировали непрерывно (в режиме реального времени) на протяжении всего эксперимента. После внесения аптамера и стабилизации сигнала на поверхность добавляли 5 мкл cTnI в диапазоне концентраций CT=10-11-10-9 моль/л.
Сигналом КНИ-биосенсора служило изменение тока в цепи исток-сток (Ids) при адсорбции биологических молекул, таких как аптамеры или комплекс «тропонин I + анти-тропонин I ДНК-аптамер», на поверхность нанопроволоки. Ток измеряли с помощью амперметра PXIe 4163 (National Instruments, США). Напряжение в цепи исток-сток (Vds=0,15 В) поддерживали постоянным с помощью устройства PXI 4135 (National Instruments, США). Напряжение, подаваемое на подзатвор датчика, выбирали в диапазоне Vbg=0-30 В. Собранные данные визуализировали в виде временной зависимости тока исток-сток — Ids(t).
Результаты
Временные зависимости тока исток-сток Ids(t) КНИ-биосенсоров представлены на рис. 4. Установлено, что ток шести КНИ-биосенсоров изменялся в ходе эксперимента. Другие четыре КНИ-биосенсора находи-
//////////////////ш^
40 СТМ J 2024 j том 16 j №1 А.А. Черемискина, В.В. Красицкая, В.М. Генералов, Л.А. Франк, А.В. Глухов, ..., В.К. Грабежова
лись в режиме отсечки (режим полного закрытия) при заданных условиях в течение эксперимента, поэтому их кривые Ids(t) не представлены на рисунке.
Начальные токи биосенсоров различались в момент включения устройства (см. рис. 4). Зарегистрированные значения тока охватывали широкий диапазон: от Ids=2,1*10-7 А (КНИ-биосенсор №4, зеленая линия) до Ids=6,1xi0-8 А (КНИ-биосенсор №3, желтая линия). В режиме холостого хода (без каких-либо биологических образцов на поверхности биосенсоров) в интервале времени 0-200 с большинство КНИ-биосенсоров демонстрировали стабильное значение Ids, за исключением КНИ-биосенсоров №1 (красная линия) и №4 (зеленая линия), которые показывали незначительный и заметный дрейф тока соответственно.
Добавление 5 мкл раствора TnAp12t2 (CA=10-8 моль/л) на поверхность кристалла в точке (1) вызвало увеличение тока только у КНИ-биосенсоров №1 и №4. Подобная реакция биосенсора с n-типом проводимости объясняется увеличением числа носителей заряда, в данном случае электронов, в объеме нанопроволоки. Это вызвано наличием положительного эффективного электрического заряда на границе раздела фаз «жидкий образец-нанопроволока». Поскольку буферный раствор не оказывал влияния на значения тока, положительный заряд связан с адсорбцией аптамера. Возможно, в условиях эксперимента (рН=5,9) положительный эффективный электрический заряд аптамера может быть обусловлен протонирова-нием аденина (pK ~3,5), цитозина (pK ~4,2) или гуанина (pK ~2,1) [37-41]. Полученные экспериментальные результаты влияния адсорбции аптамера на величину тока КНИ-биосенсора согласуются с исследованием T. Farrow с соавт. [42].
Небольшой дрейф тока наблюдался в КНИ-био-сенсорах №5 (синяя линия) и №6 (фиолетовая линия). С другой стороны, КНИ-биосенсоры №2 (оранжевая линия) и №3 (желтая линия) не показали существенных различий по сравнению с током, наблюдаемым в режиме холостого хода.
В интервале между точками (1) и (2) наблюдалась стабилизация сигнала. Однако в КНИ-биосенсорах №1 и №4 отмечен небольшой дрейф тока, что указывает на динамические процессы, происходящие на их поверхности. Значения остальных биосенсоров остались неизменными.
Добавление 5 мкл раствора cTnl (C1=10-11 моль/л) на поверхность кристалла в точке (2), которая содер-
Рис. 4. Временные зависимости тока исток-сток шести КНИ-биосенсоров при обнаружении тропонина I:
(1) добавление 5 мкл 10-8 моль/л раствора ТпАрШ2; (2) добавление 5 мкл 10-11 моль/л раствора сТп1; (3) повторное добавление 5 мкл 10-8 моль/л раствора ТпАрШ2; (4) добавление 5 мкл 10-10 моль/л раствора сТп1; (5) добавление 5 мкл 10-9 моль/л раствора сТп1. Напряжение в цепи исток-сток Vds=0,15 В
жала молекулы ТпАр1212, приводило к резкому уменьшению значений в КНИ-биосенсорах №1, №3-6 в диапазоне от 10-1 до 3,8 А. Это указывает на наличие отрицательного эффективного электрического заряда на границе раздела фаз «жидкий образец-нанопроволока». Поскольку изолированная молекула тропонина (р1=9,3) в условиях данного эксперимента имела положительный электрический заряд, можно заключить, что образовавшийся комплекс «тропонин I + анти-тро-понин I ДНК-аптамер» имеет отрицательный эффективный электрический заряд на границе раздела фаз [42-44].
Только КНИ-биосенсора №2 увеличилась на 3х10-8 А. Увеличение значений КНИ-биосенсора с п-типом проводимости возможно при возникновении положительного электрического заряда на поверхности нанопроволоки. Результаты нашего эксперимента и литературные данные [42-44] показывают, что увеличение значений может быть вызвано адсорбцией аптамера (например, точка (1) на рис. 4) или изолированной молекулы тропонина (р1=9,3).
Во временном диапазоне между точками (2) и (3) значения всех КНИ-биосенсоров демонстрировали общую тенденцию изменения.
В точке (3) на поверхность кристалла внесли раствор ТпАр1212 (СА=10-8 моль/л), что привело к увеличению тока всех КНИ-биосенсоров. Последующее введение 5 мкл раствора сТп1 с концентрацией С2=10-10 моль/л в точке (4) привело к снижению и
всех шести КНИ-биосенсоров в результате образования новых комплексов «тропонин I + анти-тропо-нин I ДНК-аптамер». В течение этого временного интервала биосенсоры находились в режиме отсечки, что соответствовало их низкой чувствительности. По этой причине изменения Ids, наблюдаемые в точках (3) и (4), были меньше, чем в точках (1) и (2).
Добавление 5 мкл раствора cTnI (C3=10-9 моль/л) в точке (5) привело к нестабильной работе КНИ-био-сенсоров из-за скопления большого количества молекул на их поверхности.
Разброс значений Ids КНИ-биосенсоров может быть связан с технологией изготовления микросхем, которая сказывается на чувствительности биосенсоров. Основанием подобного вывода служит разброс значений Ids шести КНИ-биосенсоров в момент включения устройства и в режиме холостого хода, а также нахождения четырех КНИ-биосенсора в режиме отсечки.
Обсуждение
КНИ-биосенсор представляет собой перспективное аналитическое устройство для детекции целевых молекул без использования меток (флюоресцентных, люминесцентных). Он обладает высокой чувствительностью и способностью регистрировать сигнал в режиме реального времени [11]. Тем не менее существуют определенные факторы, усложняющие его применение. Одним из таких факторов является топология и конструкция биосенсора. В настоящей работе использован КНИ-биосенсор с электродами заземления, расположенными непосредственно на поверхности кристалла микросхемы (см. рис. 2, а). Десять КНИ-биосенсоров на кристалле увеличивают вероятность попадания целевых молекул на поверхность нанопроволоки, повышая достоверность результатов детекции.
Важной составляющей эффективной детекции с помощью биосенсора является наличие рецепторного слоя, а также возможность выбора вида рецепторов и метода их иммобилизации. В настоящее время для детекции cTnI преимущественно применяют монокло-нальные антитела. Синтетические последовательности нуклеиновых кислот (аптамеры) предоставляют альтернативный подход. По специфичности взаимодействия аптамеры сравнимы с антителами. Их можно получить с помощью эволюционного подхода in vitro (SELEX) без использования клеточных линий. Они могут восстанавливать свою активность после термической денатурации и ренатурации, проявляют высокую стабильность в жестких условиях эксплуатации. Более того, аптамеры можно синтезировать и модифицировать химическим путем [31, 42], что делает их более выгодными с точки зрения временных и материальных затрат. Аптамеры также способны связываться с целевыми молекулами в растворах с высокой ионной силой, что позволяет обнаруживать белки в неразбавленных биологических образцах, та-
ких как сыворотка, кровь и т.д. [23, 42]. В исследовании разработан и использован в качестве рецептора высокоспецифичный анти-тропонин I ДНК-аптамер (TnAp12t2); константа диссоциации (KD) комплекса «тропонин I + анти-тропонин I ДНК-аптамер» составила 6*10-9 моль/л. Иммобилизацию аптамера проводили методом физической адсорбции, что позволило сохранить его пространственную конфигурацию и реакционную способность при одновременном сокращении времени подготовки биосенсора к работе.
В данной работе продемонстрировано определение сердечного тропонина I в клиническом диапазоне концентраций 10-11-10-9 моль/л с помощью разработанной конструкции КНИ-биосенсора в режиме реального времени без использования специальных меток. Установлено, что детекция одной пробы с помощью КНИ-биосенсора составляет примерно 200 с. Следует отметить, что высокие концентрации целевых молекул могут привести к выходу биосенсора в режим насыщения и неверным результатам (точка (5) на рис. 4). Обнаружение целевых молекул в низких концентрациях осложнено вероятностью их адсорбции на поверхности биосенсора. Например, добавление раствора аптамера на поверхность кристалла в точке (1) (см. рис. 4) не меняет значение Ids КНИ-биосенсоров №2, 3, 5 и 6. Предполагается, что в этом случае молекулы аптамера не адсорбируются на поверхности. Таким образом, вероятность адсорбции молекул-рецепторов или целевых молекул является ключевым фактором при проведении анализа посредством биосенсора [13, 32]. Теоретическое исследование процесса детекции молекул-мишеней с помощью КНИ-биосенсора обсуждается в ранее опубликованной статье [45].
Заключение
Разработанный КНИ-биосенсор позволяет осуществлять детекцию тропонина I без использования меток в режиме реального времени. Детекция одной пробы тропонина I с помощью КНИ-биосенсора занимает примерно 200 с. Чувствительность биосенсора --10-11 моль/л белка. Установлено, что иммобилизация аптамера методом физической адсорбции позволяет сохранять его реакционную способность. Высокоспецифичный анти-тропонин I ДНК-аптамер (TnAp12t2) проявил в условиях эксперимента положительный эффективный электрический заряд на разделе фаз «жидкая проба-нанопроволока». Комплекс «тропонин I + анти-тропонин I ДНК-аптамер» имел отрицательный эффективный электрический заряд на том же разделе.
Финансирование. Работа выполнена в рамках Государственного задания Роспотребнадзора ГЗ-21/21 и Государственного задания бюджетной темы «Изучение молекулярно-генетических и молекуляр-но-биологических механизмов развития распростра-
//////////////////////^^^^
42 СТМ J 2024 j том 16 j №1 А.А. Черемискина, В.В. Красицкая, В.М. Генералов, Л.А. Франк, А.В. Глухов, ..., В.К. Грабежова
ненных терапевтических заболеваний в Сибири для совершенствования подходов к их ранней диагностике и профилактике», 2024-2028 гг. (FWNR-2024-0002), а также в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ (проект №FWES-2022-0002).
Конфликт интересов. У авторов нет конфликтов интересов.
Литература/References
1. Всемирная организация здравоохранения. 10 ведущих причин смерти в мире. 9 декабря 2020 г. URL: https:// www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death.
World Health Organization. The top 10 causes of death. December 9, 2020. URL: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death.
2. Снежицкий В.А., Ёрш И.Р., Голышко В.С., Литвино-вич С.Н. Инфаркт миокарда: патофизиологические механизмы развития, диагностическая стратегия и тактика лечения. Гродно: Гродненский государственный медицинский университет; 2015; 328 с.
Snezhitsky V.A., Yorsh I.R., Golyshko V.S., Litvinovich S.N. Infarkt miokarda: patofiziologicheskie mekhanizmy razvitiya, diagnosticheskaya strategiya i taktika lecheniya [Myocardial infarction: pathophysiological mechanisms of development, diagnostic strategy, and tactics of treatment]. Grodno: Grodnenskiy gosudarstvennyy meditsinskiy universitet; 2015; 328 p.
3. Pan T.M., Wang C.W., Weng W.C., Lai C.C., Lu Y.Y., Wang C.Y., Hsieh I.C., Wen M.S. Rapid and label-free detection of the troponin in human serum by a TiN-based extended-gate field-effect transistor biosensor. Biosens Bioelectron 2022; 201: 113977, https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.113977.
4. Ojha N., Dhamoon A.S. Myocardial infarction. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2022. URL: https:// europepmc.org/article/nbk/nbk537076#_article-25460_s13_.
5. Gerhardt W., Nordin G., Ljungdahl L. Can troponin T replace CK MBmass as "gold standard" for acute myocardial infarction ("AMI")? Scand J Clin Lab Invest Suppl 1999; 230: 83-89, https://doi.org/10.1080/00365519909168331.
6. Morrow D.A., Cannon C.P., Jesse R.L., Newby L.K., Ravkilde J., Storrow A.B., Wu A.H.B., Christenson R.H., Apple F.S., Francis G., Tang W.; National Academy of Clinical Biochemistry. National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: clinical characteristics and utilization of biochemical markers in acute coronary syndromes. Clin Chem 2007; 115(13): e356-e375, https://doi.org/10.1161/circulationaha.107.182882.
7. Daubert M.A., Jeremias A. The utility of troponin measurement to detect myocardial infarction: review of the current findings. Vasc Health Risk Manag 2010; 6: 691-699, https://doi.org/10.2147/vhrm.s5306.
8. Dhara K., Mahapatra D.R. Review on electrochemical sensing strategies for C-reactive protein and cardiac troponin I detection. Microchem J 2020; 156: 104857, https://doi. org/10.1016/j.microc.2020.104857.
9. Kong T., Su R., Zhang B., Zhang Q., Cheng G. CMOS-compatible, label-free silicon-nanowire biosensors to detect cardiac troponin I for acute myocardial infarction diagnosis. Biosens Bioelectron 2012; 34(1): 267-272, https://doi. org/10.1016/j.bios.2012.02.019.
10. Sharma S., Jackson P.G., Makan J. Cardiac troponins. J Clin Pathol 2004; 57(10): 1025-1026, https://doi.org/10.1136/ jcp.2003.015420.
11. Oliveira D.C.d.B., Costa F.H.M., da Silva J.A.F. The integration of field effect transistors to microfluidic devices. Micromachines (Basel) 2023; 14(4): 791, https://doi. org/10.3390/mi14040791.
12. George Kerry R., Ukhurebor K.E., Kumari S., Maurya G.K., Patra S., Panigrahi B., Majhi S., Rout J.R., Rodriguez-Torres M.d.P., Das G., Shin H.S., Patra J.K. A comprehensive review on the applications of nano-biosensor-based approaches for non-communicable and communicable disease detection. Biomater Sci 2021; 9(10): 3576-3602, https://doi.org/10.1039/d0bm02164d.
13. Tran D.P., Pham T.T.T., Wolfrum B., Offenhäusser A., Thierry B. CMOS-compatible silicon nanowire field-effect transistor biosensor: technology development toward commercialization. Materials (Basel) 2018; 11(5): 785, https:// doi.org/10.3390/ma11050785.
14. Kim K., Park C., Kwon D., Kim D., Meyyappan M., Jeon S., Lee J.S. Silicon nanowire biosensors for detection of cardiac troponin I (cTnl) with high sensitivity. Biosens Bioelectron 2016; 77: 695-701, https://doi.org/10.1016/j. bios.2015.10.008.
15. De Moraes A.C.M., Kubota L.T. Recent trends in field-effect transistors-based immunosensors. Chemosensors 2016; 4(4): 20, https://doi.org/10.3390/chemosensors4040020.
16. Generalov V.M., Naumova O.V., Fomin B.I., P'yankov S.A., Khlistun I.V., Safatov A.S., Zaitsev B.N., Zaitseva E.G., Aseev A.L. Detection of Ebola virus VP40 protein using a nanowire SOI biosensor. Optoelectron Instrum Data Process 2019; 55: 618-622, https://doi.org/10.3103/ s875669901906013x.
17. Patolsky F., Zheng G., Hayden O., Lakadamyali M., Zhuang X., Lieber C.M. Electrical detection of single viruses. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(39): 14017-14022, https:// doi.org/10.1073/pnas.0406159101.
18. Panahi A., Sadighbayan D., Forouhi S., Ghafar-Zadeh E. Recent advances of field-effect transistor technology for infectious diseases. Biosensor (Basel) 2021; 11(4): 103, https://doi.org/10.3390/bios11040103.
19. Wadhera T., Kakkar D., Wadhwa G., Raj B. Recent advances and progress in development of the field effect transistor biosensor: a review. J Electron Mater 2019; 48: 7635-7646, https://doi.org/10.1007/s11664-019-07705-6.
20. Sadighbayan D., Hasanzadeh M., Ghafar-Zadeh E. Biosensing based on field-effect transistors (FET): recent progress and challenges. Trends Analyt Chem 2020; 133: 116067, https://doi.org/10.1016/j.trac.2020.116067.
21. Cetin Y., Aydinlik S., Gungor A., Kan T., Avsar T., Durdagi S. Review on in silico methods, high-throughput screening techniques, and cell culture based in vitro assays for SARS-CoV-2. Curr Med Chem 2020; 29(38): 5925-5948, https://doi.org/10.2174/0929867329666220627121416.
22. Chiang P.L., Chou T.C., Wu T.H., Li C.C., Liao C.D., Lin J.Y., Tsai M.H., Tsai C.C., Sun C.J., Wang C.H., Fang J.M., Chen Y. T. Nanowire transistor-based ultrasensitive virus detection with reversible surface functionalization. Chem Asian J 2012; 7(9): 2073-2079, https://doi.org/10.1002/asia. 201200222.
23. Thriveni G., Ghosh K. Advancement and challenges of biosensing using field effect transistors. Biosensors (Basel) 2022; 12(8): 647, https://doi.org/10.3390/bios12080647.
чшшшшт^тчтчшшшшш^тчтчтчшт
Детекция тропонина I с помощью КНИ-биосенсора СТМ j 2024 j том 16 j №1 43
24. Bulgakova A., Berdyugin A., Naumova O., Fomin B., Pyshnyi D., Chubarov A., Dmitrienko E., Lomzov A. Solution pH effect on drain-gate characteristics of SOI FET biosensor. Electronics 2023; 12(3): 777, https://doi.org/10.3390/ electronics12030777.
25. Vance S.A., Sandros M.G. Zeptomole detection of C-reactive protein in serum by a nanoparticle amplified surface plasmon resonance imaging aptasensor. Sci Rep 2014; 4: 5129, https://doi.org/10.1038/srep05129.
26. Yang X., Wang Y., Wang K., Wang Q., Wang P., Lin M., Chena N., Tan Y. DNA aptamer-based surface plasmon resonance sensing of human C-reactive protein. RSC Adv 2014; 4(58): 30934-30937, https://doi.org/10.1039/ c4ra05011h.
27. Lin M.C., Nawarak J., Chen T.Y., Tsai H.Y., Hsieh J.F., Sinchaikul S., Chen S.T. Rapid detection of natriuretic peptides by a microfluidic LabChip analyzer with DNA aptamers: application of natriuretic peptide detection. Biomicrofluidics 2009; 3(3): 34101, https://doi.org/10.1063/13194283.
28. Pur M.R.K., Hosseini M., Faridbod F., Ganjali M.R. Highly sensitive label-free electrochemiluminescence aptasensor for early detection of myoglobin, a biomarker for myocardial infarction. Microchim Acta 2017; 184: 3529-3537, https://doi.org/10.1007/s00604-017-2385-y.
29. Jo H., Her J., Lee H., Shim Y.B., Ban C. Highly sensitive amperometric detection of cardiac troponin I using sandwich aptamers and screen-printed carbon electrodes. Talanta 2017; 165: 442-448, https://doi.org/10.10167j.talanta.2016.12.091.
30. Negahdary M., Behjati-Ardakani M., Sattarahmady N., Yadegari H., Heli H. Electrochemical aptasensing of human cardiac troponin I based on an array of gold nanodumbbells — applied to early detection of myocardial infarction. Sens Actuators B Chem 2017; 252: 62-71, https://doi.org/10.1016/j. snb.2017.05.149.
31. Chandola C., Kalme S., Casteleijn M.G., Urtti A., Neerathilingam M. Application of aptamers in diagnostics, drug-delivery and imaging. J Biosci 2016; 41(3): 535-561, https://doi.org/10.1007/s12038-016-9632-y.
32. Squires T.M., Messinger R.J., Manalis S.R. Making it stick: convection, reaction and diffusion in surface-based biosensors. Nat Biotechnol 2008; 26(4): 417-426, https://doi. org/10.1038/nbt1388.
33. Krasitskaya V.V., Goncharova N.S., Biriukov V.V., Bashmakova E.E., Kabilov M.R., Baykov I.K., Sokolov A.E., Frank L.A. The Ca2+-regulated photoprotein obelin as a tool for SELEX monitoring and DNA aptamer affinity evaluation. Photochem Photobiol 2020; 96(5): 1041-1046, https://doi. org/10.1111/php.13274.
llagsSen^., Wagner R., Sigworth F.J., Breaker R., Fahmy T.M., Reed M.A. Importance of the Debye screening length on nanowire field effect transistor sensors. Nano Lett 2007; 7(11): 3405-3409, https://doi.org/10.1021/nl071792z.
35. Генералов В.М., Наумова О.В., Пьянков С.А., Колосова И.В., Сафатов А.С., Зайцев Б.Н., Зайцева Э.Г., Бу-
ряк Г.А., Черемискина А.А., Филатова Н.А., Асеев А.Л. Индикация вируса осповакцины с помощью нанопрово-лочного КНИ-биосенсора. Автометрия 2021; 57(1): 42-49, https://doi.org/10.15372/aut20210105.
Generalov V.M., Naumova O.V., P'yankov S.A., Kolosova I.V., Safatov A.S., Zaytsev B.N., Zaytseva E.G., Buryak G.A., Cheremiskina A.A., Filatova N.A., Aseev A.L. Indication of the vaccinia virus by a nanowire silicon-on-insulator biosensor. Avtometria 2021; 57(1): 42-49, https://doi. org/10.15372/aut20210105.
36. Ocana C., del Valle M. A comparison of four protocols for the immobilization of an aptamer on graphite composite electrodes. Microchim Acta 2014; 181: 355-363, https://doi. org/10.1007/s00604-013-1126-0.
37. Tan S.Y., Acquah C., Tan S.Y., Ongkudon C.M., Danquah M.K. Characterisation of charge distribution and stability of aptamer-thrombin binding interaction. Process Biochem 2017; 60: 42-51, https://doi.org/10.1016/j.procbio.2017.06.003.
38. Kantor C.R., Schimmel P.R. Biophysical chemistry: part I: the conformation of biological macromolecules. 1st edition. W.H. Freeman and Company; 1980.
39. Ravindranathan S., Butcher S.E., Feigon J. Adenine protonation in domain B of the hairpin ribozyme. Biochemistry 2000; 39(51): 16026-16032, https://doi.org/10.1021/bi001976r.
40. Кочетков Н.К., Будовский Э.П., Свердлов Е.Д., Си-мукова Н.К., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. М: Химия; 1970.
Kochetkov N.K., Budovskiy E.P., Sverdlov E.D., Simukova N.K., Turchinskiy M.F., Shibaev V.N. Organicheskaya khimiya nukleinovykh kislot [Organic chemistry of nucleic acids]. Moscow: Khimiya; 1970.
41. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. М: Химия; 1978; с. 584.
Shabarova Z.A., Bogdanov A.A. Khimiya nukleinovykh kislot i ikh komponentov [Chemistry of nucleic acids and their components]. Moscow: Khimiya; 1978; p. 584.
42. Farrow T., Laumier S., Sandall I., van Zalinge H. An aptamer-functionalized Schottky-field effect transistor for the detection of proteins. Biosensors (Basel) 2022; 12(5): 347, https://doi.org/10.3390/bios12050347.
43. Filatov V.L., Katrukha A.G., Bulargina T.V., Gusev N.B. Troponin: structure, properties, and mechanism of functioning. Biochemistry (Mosc) 1999; 64: 969-985.
44. Сердечный тропонин I. HyTest; 2019. URL: https://hytest.ru/sites/5cd13840ff4f702c0cbc4c8d/assets/ 5da43ec3fd7fb419e85444c7/Troponin_Booklet_2019.pdf.
Serdechnyy troponin I [Cardiac troponin I]. HyTest; 2019. URL: https://hytest.ru/sites/5cd13840ff4f702c0cbc4c8d/assets/ 5da43ec3fd7fb419e85444c7/Troponin_Booklet_2019.pdf.
45. Generalov V., Cheremiskina A., Glukhov A., Grabezhova V., Kruchinina M., Safatov A. Investigation of limitations in the detection of antibody+ antigen complexes using the silicon-on-insulator field-effect transistor biosensor. Sensors (Basel) 2023; 23(17): 7490, https://doi.org/10.3390/s23177490.
