CC BY
212 tyjf* Генетика
www. agroyug. ru
DOI 10.24412/cl-33489-2025-l-12-13 УДК 636.082:573.6.086.83
Семенова Е.И., ветеринарный врач-эмбриолог биотехнологической лаборатории, e-mail: [email protected], Кириенко К.В., Миронова А.Г., Икономов П.Г., Апрышко В.П., Бондаренко М.С., Гришин Д.С., Заводовская М.С., Мартын В.Ф., Васильева О.В., Шокирова Н.С., Яковенко С.А. ООО «Альтраген»
Аннотация. В статье рассматривается соматический метод клонирования млекопитающих, в частности, крупного рогатого скота голштинской породы. В нашей лаборатории «Альтраген» была освоена и отработана на практике технология HMC (Handmade Cloning), разработанная австралийским ученым Габором Вайта, в результате чего была получена первая в России клонированная соматическим методом корова Звёздочка.
Ключевые слова: соматическое клонирование, крупный рогатый скот, клонирование животных, биотехноло гическая лаборатория, «ручное» клонирование.
Annotation. The article discusses the somatic method of cloning mammals, in particular, Holstein cattle. In our laboratory "Altragen" the HMC (Handmade cloning) technology developed by the Australian scientist Gabor Vajta was mastered and tested in practice, as a result of which the first cow in Russia cloned by the somatic method, Zvezdochka, was obtained.
Keywords: somatic cloning, cattle, animal cloning, biotechnology laboratory, Handmade cloning.
КЛОНИРОВАНИЕ КРС ТЕХНОЛОГИЕЙ HMC: ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА, ДОСТИЖЕНИЯ
В данной статье рассматривается клонирование животных как получение новых организмов, идентичных оригинальной особи. Такое клонирование в настоящее время осуществляется двумя основными способами ядерной трансплантации (SCNT - somatic cell nuclear transfer, перенос ядра соматической клетки): традиционный метод клонирования (с помощью микроманипуляторов) и метод HMC (Handmade cloning, «ручное» клонирование).
Всеми известная клонированная овечка Долли была получена в 1996 году традиционным (классическим) методом ядерной трансплантации, который подразумевает использование инвертированного микроскопа и микроманипуляторов, что является дорогостоящим оборудованием [3]. Это в свою очередь ограничивает широкое распространение классического способа клонирования. Handmade cloning - усовершенствованный метод получения клонов животных, не требующий высоких затрат на необходимое оборудование [1 ]. Также «ручной» метод, в отличие от традиционного, позволяет получать большее количество бластоцист за аналогичное время.
Клонирование методом HMC подразумевает получение реконструированных эмбрионов путем слияния соматической клетки клонируемого животного со зрелыми и лишенными генетического материала яйцеклетками животных того же вида. Голштинская порода крупного рогатого скота является самой распространенной в молочном производстве, благодаря чему именно с ней велась наша работа.
Технология HMC при клонировании крупного рогатого скота, разработанная Gabor Vajta [4], представляет собой ряд определенных последовательных этапов и включает: получение культуры соматических клеток клонируемого животного, получение ооцит-кумулюсных комплексов из яичников коров, постановка ОКК на дозревание, чистка
ооцитов, удаление из них генетического материала (получение цитопластов), электрослияние цитопла-стов с соматической клеткой (фибробластом) клонируемой коровы, химическая активация полученных реконструированных эмбрионов и последующее их культивирование.
Получение культуры соматических клеток (фибро-бластов) происходит в результате пассажа биоптата кожи клонируемого животного и дальнейшего его культивирования [2]. Образованный монослой клеток можно использовать для клонирования.
В лаборатории выполняется вакуумная аспирация содержимого фолликулов яичников, взятых с бойни мясокомбината. Из аспирата при помощи микроскопа пипеточными дозаторами собираются ооцит-кумулюсные комплексы, в результате чего производится их постановка в среду IVM для дозревания в течение 22-24 часов в инкубаторе [2]. За это время ооциты дозревают до стадии метафаза II, после чего можно приступать к непосредственно процедуре клонирования.
Согласно технологии HMC, разработанной Gabor Vajta [4], первым этапом работы со зрелыми клетками является денудация (чистка ооцитов от ку-мулюса), которая осуществляется при помощи гиалуронидазы. Сразу после денудации яйцеклетки помещаются в среду IVM с добавлением демекол-цина, действие которого направлено на деполимеризацию микротрубочек и вытеснение ядра с генетическим материалом на периферию ооцита.
Следующим этапом является бисекция, при которой у яйцеклеток ферментативно удаляется блестящая оболочка и производится энуклеация с помощью микролезвия путем отсекания части ооцита, содержащей экструдирующееся веретено деления. В дальнейшем, цитопласт (часть ооцита, лишенная генетического материала) соединяется с фибробластом и помещается между двумя
ЭФФЕКТИВНОЕ ЖИВОТНОВОДСТВО
Триплет цитопласт-фибробласт-цитопласт, где цифрами 1 и 3 обозначены цитопласты, цифрой 2 - фибробласт, 4 - электроды.
электродами, притягиваясь перпендикулярно к одному из них, где под воздействием переменного тока присоединяется второй цитопласт. Полученный триплет цитопласт-фибробласт-цитопласт подвергается электрослиянию однократным импульсом постоянного тока и затем переносится в среду с содержанием 20% белка до полного слияния и образования реконструированного эмбриона [2].
После инкубирования полученных реконструированных эмбрионов в течение двух часов в среде для культивирования (МС) производится их активация раствором ионофора кальция, который способствует повышению уровня содержания Са2+ в реконструированных эмбрионах, чем в свою очередь «запускает» начало деления. После этого РЭ помещаются в среду мС с содержанием раствора 6^МАР и переносятся в инкубатор с трехкомпонентной газовой
ЛИТЕРАТУРА
смесью (5% О2, 5% СО2, 90% N2) при 38,5 °С на 5 часов [2].
Культивирование реконструированных эмбрионов происходит в индивидуальных микролунках WOW (well-of-the-well, «лунка в лунке») в течение 8 суток [2]. На 7-й и 8-й день развития, полученные клонированные бластоцисты трансплантируются в матку заранее отобранных и подготовленных тёлок-реципиентов, либо подвергаются криоконсервации.
Выпускниками Кубанского Государственного аграрного университета в лаборатории «Альтраген» в сотрудничестве с АО «Рассвет»(Усть-Лабинский район, Краснодарский край) по технологии Габора Вайта была отработана на практике технология клонирования HMC, в результате которой была получена первая в России клонированная данным методом корова Звёздочка.
й
Кириенко К.В., Апрышко В.П., Яковенко С.А. Технология клонирования сельскохозяйственных животных методом hand-made cloning (обзор литературы). // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2023. Т. 4, № 60. С. 15-22.
Кириенко, К.В. Апробация прогрессивной технологии клонирования крупного рогатого скота [Текст] / К.В. Кириенко, А.Г. Миронова, П.Г. Икономов, В.П. Апрышко, М.С. Бондаренко, Д.С. Гришин, М.С. Заводовская, В.Ф. Мартын, О.В. Васильева, Е.И. Семенова, Н.С. Шокирова, М.Е. Крашенинников, С.А. Яковенко // Научно-теоретический журнал. - 2024. - № 2. - С. 32-44.
Vajta G., Kragh P.M., Mtango N.R., Callesen H. 2005. Hand-made cloning approach: potentials and limitations. Reprod. Fertil. Dev. 17: 97-112. DOI: 10.1071/RD04116.
Vajta G., Lewis I.M., Tecirlioglu R.T. (2006). Handmade Somatic Cell Cloning in Cattle. In: Verma P.J., Trounson A.O. (Eds) Nuclear Transfer Protocols. Methods in Molecular Biology™, Vol, 348. Humana Press.
Altra
gen
Краснодарский край, <? 0-18
г. Усть-Лабинск,
ул. Тельмана, д. 47. ® [email protected] <3 altragen.ru
