CC BY
43
УДК 631.421.1
КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ VIVIPAROUS-1 У ДИКОРАСТУЩИХ СОРОДИЧЕЙ ПШЕНИЦЫ
© А. А. Кочешкова*, М. Г. Дивашук, П. Ю. Крупин, Г. И. Карлов
Центр молекулярной биотехнологии.
Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К. А. Тимирязева Россия, 127550 г. Москва, ул. Тимирязева, 49.
E-mail: alina. kocheshkova@gmail. com
В результате клонирования и секвенирования были получены нуклеотидные последовательности генов ортологов гена Viviparousl шести видов дикорастущих сородичей пшеницы: Thinopyrum elongatum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypirum villosum, Thinopyrum bessarabicum, Thinopyrum intermedium, Thinopyrum ponticum. Полученные сиквенсы имеют высококонсервативные последовательности в области экзонов и полиморфны в области интро-нов.
Ключевые слова: Viviparous-1, Thinopyrum elongatum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypi-rum villosum, Thinopyrum bessarabicum, Thinopyrum intermedium, Thinopyrum ponticum.
Введение
Предуборочное прорастание зерновых является проблемой, которая приводит к потерям урожая и качества конечной продукции [1]. Как правило, прорастание зерна в колосе возникает в ответ на влажные условия и связанно с ранним прерыванием покоя семян [2]. Ген Viviparous-1(Vp-1) является основным регулятором позднего развития зародыша у многих злаковых культур и имеет две различные функции: обеспечение созревания зародыша и регуляция перехода в покой [2, 3]. У мягкой пшеницы были клонированы и секвенированы три гена гомолога Vp-1 и показано, что каждый из них потенциально кодирует полноразмерную цепь аминокислот [4]. У устойчивых к предуборочному прорастанию генотипов каждый из генов Vp-1 функционирует как транскрипционный фактор и играет важную роль в детерминации покоя семян, тогда как у высокочувствительных к прорастанию сортов их роль менее значительна [5]. McKibbin и др. (2002) сообщили, что неправильный сплайсинг пре-мРНК TaVp1 происходит вокруг домена B3, приводя к синтезу аберрантных мРНК с наличием стоп-кодонов в открытой рамке считывания (ORF) [6]. Неправильный сплайсинг был также обнаружен в большинстве последовательностей гена Vp-1 у диплоидных и тетраплоидных предков мягкой пшеницы, это позволяет предположить, что пшеница унаследовала его структуру еще до доместикации [7].
Анализ структуры и функционирования гена Vp-1 у различных злаков может дать новые сведения о механизмах взаимодействия генетических систем в организме, а также понять принципы регуляции важнейшего процесса - толерантности к прорастанию на корню. Все это в целом позволит разработать биоинженерные и другие подходы к регуляции прорастания зерновых на корню.
Таким образом, исследования гена Vp-1 у диких сородичей пшеницы могут послужить как для изучения функционирования данного гена у раз-
личных видов, что приблизит нас к понимаю всех сторон его функциональных особенностей, так и в дальнейшем для направленного трансгеноза или отдаленной гибридизации для интрогрессии в пшеницу генов, обеспечивающих устойчивость ее к прорастанию на корню. Ранее, нами были клонированы и секвенированы участки генов-ортологов Vp-1 включающие два последних интрона и экзона генов [8, 9].
Целью нашей работы было клонирование, сек-венирование и сравнительный анализ четвертого-пятого экзонов и третьего-четвертого интронов гена Vp-1 у следующих видов дикорастущих сородичей пшеницы: Thinopyrum elongatum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypirum villosum, Thinopyrum bessarabicum, Thinopyrum intermedium, Thinopyrum ponticum.
Материалы и методы
Растительный материал. В работе использовали образцы Thinopyrum elongatum (PI 401007), Pseudoroegneria stripifolia (W621759), Dasypyrum villosum (W621717), Th. bessarabicum (PI 531711), Th. intermedium PI 547312 и Th. ponticum PI 401200 полученные из Germplasm Research International Network.
ПЦР, клонирование, секвенирование. В работе использовались прямой праймер на ген Vp-1 пшеницы Vp-1A2F и обратные праймеры подобранные нами на сиквенсы полученые для каждого отдельного вида в предыдущих работах.
Лигирование амплифицированной ДНК осуществляли с помощью pGEM®-T Easy Vectors. Се-квенирование выделенных нами плазмид с клонированными последовательностями гена Vp-1 различных видов дикорастущих злаков осуществлялась на приборе «3130 Genetic Analyzer». Проведение реакции секвенирования осуществлялось с использованием коммерческого набора реагентов для секвенирования ДНК Big Dye Terminator v3.1 Sequencing RR-100 и по протоколам рекомендуемым производителями.
* автор, ответственный за переписку
ISSN 1998-4812
Вестник Башкирского университета. 2013. Т. 18. №3
737
Результаты и обсуждение
На основе нуклеотидных последовательностей гена Vp-1 полученных нами на предыдущих этапах исследования были разработаны молекулярные маркеры специфичные для каждого вида. В качестве прямого праймера был использован праймер разработанный на ген Vp1 пшеницы Vp-1 A1F.
Нами были клонированы последовательности со следующих видов: Thinopyrum intermedium (JJJsJsSS, 2n = 6x = 42), Thinopyrum elongatum (EE, 2n = 2x = 14), Thinopyrum bessarabicum (EbEb, 2n = 2x = 14), Thinopyrum ponticum (JJJJJJJSJSJSJS, 2n = 10x = 70), Pseudoroegneria stripifolia (StSt 2n = 2x = 14), Dasypirum villosum (VV, 2n = 2x = 14). После проведения секвенирования клонов нами были получены нуклеотидные последовательности, включающие в себя четвертый и пятый экзоны и третий и четвертый интроны гена Vp-1.
Для образцов Thinopyrum elongatum была получена нуклеотидная последовательность 903 п.н. После секвенирования клонов относящихся к третьему региону гена Vp-1 вида Pseudoroegneria stripifolia была получена нуклеотидная последовательность 1074 п.н. Для разных растений Dasypirum villosum были получены различные нуклеотидные последовательности, которые укладывались в два варианта 957 п.н. и 898 п.н., поэтому мы выделили у D. villosum два гаплотипа этого участка гена Vp-1. Для образцов Thinopyrum bessarabicum были получены различные нуклеотидные последовательно-
сти, которые объединялись в две группы 901 п.н. и 921 п.н., поэтому были выделены два аллеля третьего региона гена Vp-1. Для образцов Thinopyrum intermedium были получены ^^e^bi, которые укладывались в шесть вариантов, поэтому мы посчитали целесообразным выделить шесть гаплоти-пов этого участка гена Vp-1. Для образцов Thinopyrum ponticum были получены нуклеотидные последовательности, которые укладывались в четыре варианта. Однако у двух из них были выявлены стоп-кодоны в области экзонов, поэтому у пырея понтийского нами было выделено два гаплоти-па гена Vp-1.
Выравнивание нуклеотидных последовательностей полученных нами для гена Vp-1 на шести видах злаковых представлено на рисунке 1. С помощью анализа в программе BlastX нами были выделены возможные экзоны и интроны. Вариативность в области экзонов определялась лишь одно-нуклеотидными заменами у отдельных видов или гаплотипов. При этом структура интронов значительно различалась как между различными видами, так и внутри одного вида по гаплотипам. Следует отметить, что определенный полиморфизм в ин-тронах у белозерных сортов пшеницы вызывает различия в устойчивости к прорастанию на корню, что связывают с альтернативным сплайсингом [6]. Следовательно, на функционирование гена Vp-1 оказывает влияние не только информация закодированная в экзонах, но и полиморфизм в интронах.
Рис. 1. Выравнивание полученных нами последовательностей участка гена Viviparous у диких сородичей пшеницы.
Красным цветом обозначены экзоны.
Выводы
1. Получены сиквенсы ортологов гена Vivi-parous-1 у 6 видов дикорастущих сородичей пшеницы, которые имеют высококонсервативные последовательности в области экзонов и полиморфны в области интрона.
2. Выделены по одному гаплотипу Thinopy-rum elongatum и Thinopyrum ponticum, два аллель-ных варианта у Dasypirum villosum, Thinopyrum bessarabicum и Thinopyrum ponticum. У Thinopyrum intermedium выделено шесть гаплоипов.
ЛИТЕРАТУРА
3
Chang C., Feng J.M., Si H.Q., Yin B., Zhang H.P., and Ma C.X. Validating a novel allele of viviparous-1(Vp-1Bf) associated with high seed dormancy of Chinese wheat landrace, Wanxianbaimaizi Molecular Breeding. 2010. 25. P. 517-525.
4. Xia, L. Q., Y. Yang, Y. Z. Ma, X. M. Chen, Z. H. He, M. S. Ruder, H. D. Jones, P. R. Shewry What can the Viviparous-1 gene tell us about wheat pre-harvest sprouting. Euphytica. 2009. 168. 385-394.
5. Zentella R., Yamauchi D., Ho T. H. Molecular dissection of the gibberellin/abscisic acid signaling pathways by transiently expressed RNA interference in barley aleurone cells. Plant Cell. 2002. 14, 2289-2301.
6. Gomez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., and Ho, T. H. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 2001. 13. 667-679.
7. Крупнов В. А., Сибикеева С. Н., Крупнова О. В. Генетический контроль покоя и устойчивоси к предуборочному прорастанию семян у пшеницы. С.-х. биол. 2010. 3. P. 316.
8. McKibbin R. S., Wilkinson M. D., Bailey P. C., Flintham J. E., Andrew L. M., Lazzeri P. A., Gale M. D., Lenton J. R., and Holdsworth M. J. Transcripts of Vp-1 homeologues are misspliced in modern wheat and ancestral species. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99. 10203-10208.
9. Yang Y., Zhao X. L., Xia L. Q., Chen X. M., Xia X. C., Yu Z., He Z. H., Roder M. Development and validation of a Viviparous- 1 STS marker for pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats. Theor. Appl. Genet. 2007. 115: 971-980.
10. Дивашук М. Г., Крупин П. Ю., Фесенко И. А., Коротаева А. С., Разумова О. В., Карлов Г. И. Клонирование и анализ интрон-экзонного участка гена VIVIPAROUS 1 У Thinopy-rum intermedium и Thinopyrum ponticum. Современные проблемы науки и образования. 2011. №4. С. 49.
11. Дивашук М. Г., Крупин П. Ю., Фесенко И. А., Карлов Г. И. Клонирование и анализ интрон-экзонного участка генов ортологов гена VIVIPAROUS некоторых видов диких сородичей пшеницы. Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2010. №2. С. 76-81.
Поступила в редакцию 12.08.2013 г.
