CC BY
29УДК 674.031.734.2
КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ЯБЛОНИ
Елена Викторовна Григорьева
аспирант
[email protected] Алексей Андреевич Привалов
аспирант asher_satton@mail .ru Роман Валериевич Папихин кандидат сельскохозяйственных наук, начальник научного центра
биотехнологий и селекции parom 10@mail. ru Ирина Александровна Шамрина
студент [email protected]
Мичуринский государственный аграрный университет
г. Мичуринск, Россия
Аннотация. В статье рассматривается вопрос клонального микроразмножения растений рода Malus. На основе анализа литературы, показано, что некоторые формы яблони обладают низким коэффициентом размножения. Приводятся сведения о способах стимуляции микроразмножения на разных этапах культивирования.
Ключевые слова: яблоня, Malus, клональное микроразмножение, укоренение, регуляторы роста.
Яблоня домашняя (Malus domestica Bork) является наиболее распространённой плодовой культурой в мире, ее культивируют как севере, так и на юге умеренной зоны.
Сорта яблони размножают путём прививки или окулировки на подвойные формы, которые, как и сорта так же получают путём продолжительного селекционного отбора. Это связано в первую очередь с тем, что, как правило, коммерческие сорта невозможно размножить обычными способами: зелёным черенкованием или отводками.
Применение подвоев в садоводстве решает множество проблем, во-первых, их можно относительно легко размножить, во-вторых, подвойные формы приводят к повышению технологичности в саду, например, контролю силы роста деревьев, ускоренному плодоношению, устойчивости к болезням, передающимся через почву и др. [2-4, 6].
В начале разработки методов клонального микроразмножения считалось, что обеспечить быстрое размножение культивирования растительных тканей in vitro можно только у травянистых растений. Данные методы считались трудно применимыми к древесным культурам, в связи с относительно продолжительным этапом развития микрорастений. Однако в некоторых работах 20 века данные тезисы полностью отвергались [15].
Активные исследования в этом направлении привели к разработке эффективных способов микроразмножения растений рода Malus, в том числе коммерческих сортов и подвоев [9].
Культура микропобегов с пролиферацией пазушных побегов является общепринятым методом размножения in vitro для сохранения генетической целостности клона.
Такие методы широко применяются к растениям рода Malus с середины прошлого века, кроме этого, активно используются методы регенерации адвентивных побегов или зародышей из эксплантатов и каллуса. При этом некоторые генотипы обладают хорошей способностью к калусообразованию и регенерации адвентивных побегов. Пример получения такого активного
морфогенетического ответа был продемонстрирован на межвидовых гибридах M. sieboldii при стимулировании эксплантов физическими и химическими факторами воздействия [1, 10].
Однако адвентивная регенерация может приводить к генетическим вариантам или сомаклональным вариантам. Они нежелательны для производства, но могут быть использованы для селекционной работы, если они имеют ценные хозяйственно-биологические признаки [14].
Методы культивирования яблони in vitro аналогичны методам для других растений. В основе лежат классические этапы, начиная от введения почек или кончиков побегов длиной в диапазоне от 0,3 мм до 1,0 см с предварительной стерилизацией различными химическими соединениями [6].
Затем экспланты культивируют в культуральных сосудах, содержащих, как правило, твёрдую питательную среду на основе агара. Наиболее часто используют питательные среды Мурасиге, Скуга (MS) и Кворина-Лепуавра (QL), которые содержат минеральные соли, углевод и регуляторы роста, такие как цитокинин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), а также, возможно, применение некоторого количества ауксина и гиббереллина в зависимости от этапа микроразмножения и конкретного генотипа.
По мнению А. Пуа и С. Чонга [12] сорбитол, который является основной транспортной формой углерода у Malus, может быть более эффективен, чем сахароза.
Такой биологический ответ на сорбит может быть связан с наличием одного или нескольких ферментов. К этим ферментам относятся сорбитолдегидрогеназа, сорбитол-6-фосфатдегидрогеназа и сорбитолоксидаза, ответственные за метаболизм и ассимиляцию сорбита в тканях яблони [5].
Для некоторых генотипов флоридзин (PZ) - наиболее известное фенольное соединение яблони и флороглюцин (PG), который является продуктом распада флоридзина, иногда более чем в два раза ускоряет рост побегов, однако этот эффект, по-видимому, зависит от сорта и физиологического состояния растительных тканей [12].
В культуре in vitro на этапе микроразмножения у многих видов, в том числе яблони, микропобеги могут остановиться в активном росте и находится в таком состоянии продолжительное время. Кроме этого, как правило, это сопровождается формированием скрученных полупрозрачных листьев, это состояние описано как «витрификация» [11].
Однако, для выхода из этого состояния О. Джонес [9], в своей работе, приводит сведения о факторах, способных индуцировать активный рост и размножение. Добиться этого у микрорастений яблони можно путем модификации питательной среды, а именно, сменой концентрации агара, источника углерода, концентрацией азота, добавлением флоридзина или флороглюцина [9].
Растительные клетки, ткани и органы, культивируют in vitro на искусственных питательных средах, которые в своём составе имеют питательные вещества, необходимые для роста и развития до полноценного микрорастения. Ключевым фактором эффективности культивирования является подбор состава питательных сред, которые, как правило, содержат микроэлементы, макроэлементы, гормоны (регуляторы роста), аминокислоты, витамины и углеводы [13].
Обязательным элементом искусственной питательной среды являются сахара. Это связано с тем, что при инкубации клеток in vitro наблюдается явление гетеро/ миксотрофии, для замены углерода, который растения обычно получают в процессе фотосинтеза из атмосферы.
Гетеротрофный тип питания возникает в результате низкой фотосинтетической активности эксплантов и его эффективность является решающей для их дальнейшего развития [8]. В результате того, что углеводы оказывают влияние на морфогенетические процессы, обладают осмотическим потенциалом, который влияет на скорость деления клеток, выполняют функцию в синтезе многих соединений, выступая в качестве строительных блоков макромолекул, а также могут контролировать некоторые процессы развития в клетке, они являются важнейшим элементом для растительных организмов [7].
Этап микроразмножения продолжается в зависимости от поставленных задач по требуемым объёмам тиражирования конкретного сорта или подвоя и заканчивается пересадкой на искусственную питательную среду, стимулирующую образование корней.
Продолжительность этапа укоренения зависит от индивидуальных генетических особенностей конкретной формы растения и условий культивирования. Однако, индуктором корнеобразования обычно выступают ауксины (некоторые генотипы могут образовывать корни после продолжительного культивирования и без наличия ауксинов в питательной среде), которые добавляют в искусственную питательную среду. Наиболее часто применяют индол-3-масляную кислоту (ИМК) и индолил-3-уксусную кислоту (ИУК).
Воздействие на микропобеги периодом темновой фазы при культивировании также может улучшить корнеобразование in vitro [16].
Поскольку подвойные формы обладают высокой способностью к укоренению, т. к. в происхождении многих генотипов подвоев принимали участие яблоня Недзведского (Malus niedzwetzkyana Dieck ex Koehne) и яблоня низкая (Maluspumila Mill.), то разработано много способов укоренения in vitro и акклиматизации ex vitro.
Имеются исследования, которые были направлены на упрощение способа получения полноценных растений слаборослых клоновых подвоев.
Способ заключается в укоренении микропобегов в темноте в нестерильных условиях в растворе ИМК. Таким методом было укоренено несколько сортов [17]. Поскольку подвойные формы обладают высокой способностью к укоренению, т. к. в происхождении многих генотипов подвоев принимали участие яблоня Недзведского (Malus niedzwetzkyana Dieck ex Koehne) и яблоня низкая (Maluspumila Mill.), то разработано много способов укоренения in vitro и акклиматизации ex vitro.
Имеются исследования, которые были направлены на упрощение способа получения полноценных растений слаборослых клоновых подвоев.
Способ заключается в укоренении микропобегов в темноте в нестерильных условиях в растворе ИМК. Таким методом было укоренено несколько сортов [17].
После стадии укоренения микрорастения высаживают в субстрат и переносят в условия повышенной влажности в теплицу для прохождения этапа аккиматизации.
В настоящее время в большей степени клональное микроразмножение используют для тиражирования подвойных форм, так как они генетически более предрасположены к вегетативному размножению. Однако, культивировании in vitro привойных компонентов которые трудно или невозможно размножить обычными методами позволяет сохранять генетическую коллекцию и поддерживать оздоровленный статус растений.
Таким образом, процесс клонального микроразмножения растений рода Malus принципиально не отличается от размножения других растений in vitro, однако предполагает существенные отличия в составе питательных сред. Это связано с физиологическими особенностями, характерными для растений этого рода. Основные разработки последних лет направлены на повышение эффективности индукции пролиферации и ризогенеза микропобегов, регенерации адвентивных побегов или зародышей из каллуса.
Список литературы:
1. Муратова С.А., Папихин Р.В. Влияние ультразвука на процесс ризогенеза при клональном микроразмножении декоративных растений / Геномика и современные биотехнологии в размножении, селекции и сохранении растений: материалы II Международной научно - практической конференции. 2021. С. 137-138.
2. Новые перспективные подвойные формы селекции Мичуринского ГАУ / P.B. Папихин, Н.Л. Чурикова, А.В. Кружков, З.Н. Тарова, Д.Ю. Честных, Л.В. Скороходова // Агротехнологические процессы в рамках импорт замещения: материалы Международной научно-практической конференции 25-
27 октября 2016г. посвящённой 85-летию со дня рождения заслуженного работника высшей школы РФ, доктора с. х. наук, профессора Ю.Г. Скрипникова. Мичуринск. 2016. С. 221-225.
3. Новые слаборослые клоновые подвои яблони / Н.М. Соломатин, Р.В. Папихин, Л.В. Григорьева, И.М. Зуева, Д.Ю. Честных, Н.Л. Чурикова Л.В. Скороходова // Вестник МичГАУ. №1. Ч. 1. 2012. С. 58-61.
4. Устойчивость клоновых подвоев яблони к почвенным патогенным микроорганизмам в многолетних производственных насаждениях / М.Л. Дубровский, Р.В. Папихин, А.В. Кружков, Н.Л. Чурикова // Наука и Образование. 2021. Т. 4. № 1.
5. Comparison of sucrose and sorbitol as main carbon energy source in morphogenesis of peach rootstock GF-677 / T. Ahmad, N.A. Abbasi, I.A. Hafiz, A. Ali // Pak. J. Bot. 2007. V. 39(4). P. 1264-1275.
6. Development of methods for introducing hybrid progeny of Malus sieboldii Rehd. at in vitro conditions / R. Papikhin, S. Muratova, M. Dubrovsky, E. Grigoryeva // E3S Web Conf. Innovative Technologies in Science and Education (ITSE-2020). 2020. V. 210.
7. Du Toit E., Robbertse P., Niederwieser J. Plant carbohydrate partitioning of Lachenaliacv Ronina during bulb production // Sci Hortic. 2004. V. 102(4). P. 433440.
8. Fotopoulos S., Sotiropoulos T. In vitro propagation of the peach rootstock: the effect of different carbon sources and types of sealing material on rooting // Biol Plant. 2004. V. 48(4). P. 629-631.
9. Jones O.P. Propagation of apple in vitro. In: Ahuja M.R. (eds) Micropropagation of Woody Plants // Forestry Sciences. 1993. V 41. P. 169-186.
10. Muratova S.A., Papikhin R.V. The Effect of Ultrasound Irradiation on Induction of Callus Formation and Morphogenesis from the Leaf Discs of Apple Clonal Rootstocks / J. Pharm. Sci. & Res. Vol. 10(10), 2018, 2592-2596.
11. Novatel J.C. L'utilisation des cultures in vitro pour I a multiplication de quelques especes legumieres et fruitieres // CR Acad Agric France. 1980. V. 66. P. 681-691.
12. Pua A.C., Chong C. Requirement for sorbitol (D-glucitol) as carbon source for in vitro propagation of Malus robusta // Can. J. Bot. 1984. V. 62. No. 5. P.
1545-1549.
13. Review: role of carbon sources for in vitro plant growth and development / M. Yaseen, T. Ahmad, G. Sablok, A. Standardi, I.A. Hafiz // Mol. Biol Rep. 2013. V. 40. P. 2837-2849.
14. Simmonds J. Direct rooting of micropropagated M.26 apple rootstocks // Scientia Hort. 1983. V. 21. P. 233-241.
15. Wilkins C.P., Cabrera P., Dodd J.H. Tissue culture propagation of trees // Outlook on Agriculture. 1985. V. 14, P. 2-13.
16. Zimmerman R.H. Rooting apple cultivars in vitro: interactions amongst light, temperature, phloroglucinol and auxin // Plant Cell Tiss Org Cult. 1984. V. 3. P. 301-311.
17. Zimmerman R.H., Fordham I. Simplified method for rooting apple cultivars in vitro // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1985. V. 110. P. 34-38.
UDC 674.031.734.2
APPLE CLONAL MICROPROPAGATION
Elena V. Grigorieva
postgraduate student [email protected] Alexey A. Privalov
postgraduate student asher_satton@mail .ru Roman V. Papikhin
Candidate of Agricultural Sciences, Head of the Scientific Center for Biotechnology and Breeding
parom 10 @mail .ru Irina A. Shamrina student [email protected] Michurinsk State Agrarian University Michurinsk, Russia
Annotation. The article deals with the issue of clonal micropropagation of plants of the genus Malus. Based on the analysis of the literature, it is shown that some forms of apple trees have a low multiplication factor. Information is given on methods of stimulating micropropagation at different stages of cultivation.
Key words: apple tree, Malus, clonal micropropagation, rooting, growth regulators.
Статья поступила в редакцию 14.02.2022; одобрена после рецензирования 12.03.2022; принята к публикации 25.03.2022. The article was submitted 14.02.2021; approved after reviewing 12.03.2022; accepted for publication 25.03.2022.
