CC BY
40
'4 (52) сентябрь 2011 г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ^ 101
РЕВМАТОЛОГИЯ
м.в. ильин, П.А. мАЛьцЕвА, Е.в. рЕчкИнА, н.И. коршунов 616.5-002.525.2
Ярославская государственная медицинская академия
Клинико-патогенетическое значение определения показателей функциональной активности и апоптоза нейтрофилов у больных системной красной волчанкой
I Ильин михаил Битальевич
кандидат медицинских наук, доцент кафедры терапии
150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5, тел./факс (4852) 24-14-17, e-mail: [email protected]
В статье изучалось клинико-патогенетическое значение экспрессии факторов окислительного стресса и апоптоза нейтрофилов у 50 больных системной красной волчанкой. Обнаружено снижение экспрессии антигена bak нейтрофилами при системной красной волчанке, ассоциированное с увеличением количества лейкоцитов и поражением почек. Выявлена гетерогенность показателей экспрессии факторов окислительного стресса нейтрофилов в зависимости от уровня их апоптоза. Снижение уровня апоптоза нейтрофилов сопровождается усилением образования активных форм кислорода и уменьшением резервного потенциала клеток.
Ключевые слова; системная красная волчанка, нейтрофилы, кислородзависимый метаболизм, апоптоз.
M.V. ILYIN, P.A. MALTSEVA, E.V. RETCHKINA, N.I. KORSHUNOV
Yaroslavl State Medical Academy
Clinical and pathogenetic value of the functional activity and neutrophil apoptosis rate in patients with systemic lupus erythematosus
The article examined the clinical and pathogenetic significance of expression of factors in oxidative stress and apoptosis of neutrophils in 50 patients with systemic lupus erythematosus. It was found decreased expression of antigen bak by neutrophils in systemic lupus erythematosus associated with an increase in the number of leukocytes and kidney damage, geterogeneity of indicators of oxidative stress factors expression in neutrophils depending on the level of apoptosis. Reduced apoptosis of neutrophils is accompanied by increased generation of active oxygen species and a decrease in reserve capacity of cells.
Keywords; systemic lupus erythematosus, neutrophils, oxygen-dependent metabolism, apoptosis.
Исследованиями последних лет убедительно показано, что развитие системной красной волчанки (СКВ) сопровождается нарушением регуляции апоптоза лейкоцитов и ассоциировано с поражением внутренних органов, прежде всего легких и сердечно-сосудистой системы [5, 9]. Увеличение уровня апоптоза нейтрофилов наряду с окислительным повреждением ДНК клеток является фактором аутоантигенного эксцесса и иммунной активации у больных СКВ [12].
Свободные радикалы кислорода, источником которых являются активированные лейкоциты, запускают каскад воспаления, ассоциированный с экспрессией молекул адгезии, пептидных факторов роста и цитокинов, обладающих антивос-палительным эффектом, частично обусловленным индукцией апоптоза нейтрофилов [1].
Гиперпродукция активных форм кислорода, наблюдающаяся при СКВ, перепрограммирует макрофаги путем активации ну-клеарного фактора (NF-kappa B) и транскрипционного фактора (AP-1), вызывая циклооксигеназную экспрессию, приводящую к подавлению апоптоза нейтрофилов [16]. Активные формы кислорода функционируют в роли вторичных передающих звеньев, активирующих NF-kappa B, который регулирует спектр генов, ответственных за воспалительный ответ [8].
Установлено, что нейтрофилы являются связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом, который характеризуется появлением антинуклеосомальных антител и развитием аутотолерантности, свойственной СКВ. После многолетних исследований, посвященных изучению роли Ти В-клеток в патогенезе СКВ, получены данные, свидетель-
102 ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
'4 (52) сентябрь 2011 г.
ствующие о важной роли нейтрофилов в системном воспалении, особенно на заключительном этапе, сопровождающемся тканевым повреждением [10].
Целью настоящего исследования было определение клинико-патогенетического значения изменения экспрессии факторов окислительного стресса и апоптоза нейтрофилов у больных системной красной волчанкой.
Материалы и методы
В исследование были включены 50 женщин в возрасте от 18 до 73 лет, страдающих системной красной волчанкой. Заболевание развивалось преимущественно в возрастном периоде от 20 до 50 лет (в среднем 42 года — 84%). Длительность заболевания составляла в среднем 8,2±7,4 года. Группу контроля составили 11 относительно здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту с больными основной группы наблюдения.
Диагноз СКВ устанавливали на основании клинических проявлений заболевания, данных лабораторных и инструментальных методов исследования и классификационных критериев Американской ассоциации ревматологов. Для характеристики вариантов течения по критерию активности заболевания использовали классификацию В.А. Насоновой (1972). Определяли индексы активности SLAM и SLEDAI.
Развитие заболевания сопровождалось возникновением поражения сердца — в 50 (100%), сосудов — в 10 (20,0%), легких — в 4 (8%), почек — в 23 (46%), кожи — в 14 (28%), желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) — в 5 (10,0%), костномышечной системы (КМС) — в 33 (66%), нервной системы (НС) — в 6 (12%) случаях.
Лабораторные исследования показали наличие анемии — у 16 (32%), лейкоцитоза — у 18 (36%), лейкопении — у 16 (32%), повышение СОЭ — у 17 (34%) больных. Положительный АНФ выявлен в 48 (96%), анти-ДНК антитела — в 17 (34%), LE-клеточный феномен — в 33 (66%) случаях. Повышение уровня ЦИК и появление антител к кардиолипину обнаружено у 27 (54%) и 6 (12%) пациенток соответственно.
Выделение нейтрофилов периферической крови проводили на двойном градиенте плотности фиколла-урографина. Функциональную активность клеток исследовали хемилюминес-центным методом. Для усиления хемилюминесценции (ХЛ) использовали люминол (ЛЛ), а также люцигенин (ЛН), который является селективным индикатором супероксид-аниона. О функциональном резерве клеток судили по коэффициентам активации хемилюминесценции (КА ХЛлл и КА ХЛлн), которые рассчитывали как отношение индуцированного показателя (иХЛлл и иХЛлн) к спонтанному (сХЛлл и сХЛлн). В качестве индуктора кислородзависимого метаболизма нейтрофилов использовали 1х109 взвесь убитых нагреванием клеток S. aureus штамма p-209.
Для определения экспрессии проапоптозного антигена bak на поверхности нейтрофилов использовали стрептавидин-биотиновый метод (реагенты DAKOCytomation, Дания). Исследование проводили в соответствии со стандартным протоколом, учитывая процент bak-положительных клеток. Использовали моноклональные мышиные антитела к гранулоцит-ассоциированному антигену CD15 для положительного контроля и разводящую жидкость для антител в качестве отрицательного контроля.
Статистическая обработка данных проводилась при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Для количественных признаков, имеющих распределение отличное от нормального, производилось вычисление медиан и интерквартильных интервалов (Me (25%; 75%)). Для срав-
нения двух независимых групп по одному признаку применяли критерий Манна — Уитни. Критическое значение уровня статистической значимости принималось равным 5%. При установлении референтного интервала для количественных признаков использовалось процентильное определение нормы, основанное на измерениях, предпринятых на здоровой популяции [4].
Основываясь на определении референтных значений показателей апоптоза нейтрофилов, пациенты были разделены на группы с низким (12,4 (8,6; 14,9)), средним (17,6 (15,5; 18,8)) и высоким (20,3 (19,3; 21,8)) уровнем экспрессии белка bak нейтрофилами. В данных группах регистрировались частота встречаемости клинических признаков поражения внутренних органов, костно-мышечной системы, нервной системы, кожные проявления, показатели характера течения и активности заболевания (СОЭ, СРБ, ^, ^М, IgG, ЦИК, гипоальбумине-мия, лейкоцитоз, лейкопения, лихорадка, лимфаденопатия, анемия).
Результаты
Высокий уровень экспрессии антигена bak на поверхности нейтрофилов у больных СКВ встречался в небольшом проценте случаев (п=3 (6,0%)). В связи с этим для обеспечения статистической корректности данная группа больных в анализ не включалась. Сравнительная характеристика клинико-лабораторных показателей у больных СКВ в зависимости от уровня спонтанного апоптоза нейтрофилов представлена в таблице 1.
Таблица 1.
Частота обнаружения клинико-лабораторных признаков (п (%)) у больных системной красной волчанкой в зависимости от уровня экспрессии антигена bak нейтрофилами
Показатель I. СКВ с низким уровнем экспрессии bak (n=29) II. СКВ со средним уровнем экспрессии bak (n=18) Р (I-II)
СОЭ >20 мм/ч 10 (34,5) 4 (22,2) 0,92
СРБ >5 мг/л 9(31,0) 3 (16,7) 0,86
IgA >3,5 г/л 6 (20,7) 2 (11,1) -
IgM >2,5 г/л 5 (17,2) 1 (5,56) -
IgG >18 г/л 26 (89,7) 17 (94,4) 0,54
ЦИК >65 ед.опт. пл. 20 (69,0) 12 (66,7) 0,67
Alb <35 г/л 0 0 -
Hb <120 г/л 10 (34,5) 6 (33,3) 0,31
поражение сердца 29 (100) 18 (100) -
поражение сосудов 6 (20,7) 4 (22,2) 0,87
поражение легких 4 (13,8) 0 -
поражение почек 17 (58,6) 6 (33,3) 0,034
поражение ЖКТ 4 (13,8) 1 (5,56) 0,92
поражение кожи 10 (34,5) 4 (22,2) 0,96
лейкоцитоз 14 (48,3) 4 (22,2) 0,031
лейкопения 0 6 (33,3) -
лихорадка 7 (24,1) 3 (16,7) 0,83
лимфаденопа- тия 11 (37,9) 4 (22,2) 0,94
'4 (52) сентябрь 2011 г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ^ 103
Таблица 2.
Характеристика показателей метаболической активности нейтрофилов в зависимости от уровня их апоптоза у больных системной красной волчанкой
Показатель Контроль (п=11) I. СКВ с низким уровнем экспрессии bak (п=29) II. СКВ со средним уровнем экспрессии bak (п=18) р о-п)
сХЛлл, 104, имп/мин 1,1 (0,5; 1,8) 5,0 (1,2; 8,7) * 1,3 (1,0; 5,0) 0,017
иХЛлл, 104, имп/мин 1,1 (0,2; 3,0) 1,0 (0,1; 4,1) 3,2 (1,0; 6,0) * 0,014
сХЛлн, 104, имп/мин 0,55 (0,2; 1,1) 1,25 (0,6; 3,0) * 1,35 (0,5; 2,0) * 0,84
иХЛлн, 104, имп/мин 0,3 (0,1; 0,9) 0,9 (0,1; 1,0) 0,95 (0,1; 1,0) 0,80
КА ХЛлл, Ед 1,69 (0,92; 3,3) 0,3 (0,1; 1,4) * 1,5 (1,0; 2,9) 0,001
КА ХЛлн, Ед 0,75 (0,25; 1,5) 0,5 (0,25; 1,9) 0,45 (0,25; 1,6) 0,71
Примечание. * — р < 0,05 по сравнению с контролем
Установлено, что в группе больных СКВ, клетки которых обладали низким уровнем экспрессии белка Ьак, более часто, в сравнении с группой больных СКВ со средним уровнем апоптоза нейтрофилов, регистрировалось поражение почек (17 (58,6%)>6 (33,3%); р=0,034), ассоциированное со статистически значимым увеличением числа лейкоцитов (14 (48,3%)>4 (22,2%); р=0,031). Кроме того, при СКВ с низким уровнем апоптоза нейтрофилов чаще встречалось поражение легких, желудочно-кишечного тракта, кожи, костно-мышечной и нервной систем, не имевшее статистической значимости.
При анализе показателей кислородзависимого метаболизма нейтрофилов в зависимости от уровня спонтанного апоптоза клеток у больных СКВ обнаружены следующие различия (таблица 2).
В отличие от группы контроля при СКВ с низким уровнем апоптоза нейтрофилов наблюдалось статистически значимое повышение функциональной активности нейтрофилов, по данным сХЛлл (5,0 (1,2; 8,7)>1,1 (0,5; 1,8); р<0,05) и сХЛлн (1,25 (0,6; 3,0)>0,55 (0,2; 1,1); р<0,05), а также снижение резерва продукции активных форм кислорода, по данным КА ХЛлл (0,3 (0,1; 1,4)<1,69 (0,92; 3,3); р<0,05).
При СКВ со средним уровнем экспрессии антигена Ьак обнаружено повышение резервного потенциала клеток, по результатам иХЛлл (3,2 (1,0; 6,0)>1,1 (0,2; 3,0); р<0,05) и увеличение уровня продукции супероксид-аниона (сХЛлн) по сравнению с показателями контрольной группы (1,35 (0,5; 2,0)>0,55 (0,2; 1,1); р<0,05).
У больных СКВ с низким уровнем экспрессии нейтрофилами проапоптозного белка Ьак выявлено значительное повышение сХЛлл, по сравнению с пациентами, нейтрофилы которых демонстрируют средний уровень спонтанного апоптоза (5,0 (1,2; 8,7)>1,3 (1,0; 5,0); р=0,017). Во второй группе обнаружено статистически значимое увеличение показателей резерва образования активных форм кислорода нейтрофилами, по данным иХЛлл (3,2 (1,0; 6,0)>1,0 (0,1; 4,1); р=0,014) и КА ХЛлл (1,5 (1,0; 2,9)>0,33 (0,11; 1,36); р=0,001).
Обсуждение
Установлено, что в условиях активного воспаления гиперэкспрессия факторов биоцидности нейтрофилов сопровождается усилением их апоптоза, что является одним из компенсаторных механизмов, позволяющих локализовать воспалительный процесс [2]. Ключевая роль в регуляции функциональной активности и апоптоза нейтрофилов, вероятно, принадлежит гранулоцитарно-макрофагальному колониестимулирующему фактору (ГМ-КСФ), известному также как колониестимулирующий фактор-2. ГМ-КСФ увеличивает респираторный взрыв в нейтрофилах, усиливает генерацию супероксидного анион-радикала и антителозависимую клеточную цитотоксичность [3], а также задерживает апоптоз нейтрофилов путем ингибирования синтеза проапоптозных белков семейства Вс1-2 [7].
Поскольку свободные радикалы, продуцируемые комплексом НАДФ-оксидазы, совместно с ГМ-КСФ, задерживают апоптоз нейтрофилов, регулируя активность митоген-активированной протеинкиназы [17], постольку уменьшение секреции активных форм кислорода нейтрофилами и увеличение их резервного потенциала сопровождается стабилизацией механизмов регуляции программированной клеточной гибели. Снижение экспрессии факторов апоптоза нейтрофилов, как было показано в настоящем исследовании, сопровождается увеличением циркулирующего пула клеток и приводит к развитию лейкоцитоза. В низких концентрациях ГМ-КСФ способствует увеличению хе-мотаксической подвижности нейтрофилов, а в высоких тормозит ее, приводя к накоплению нейтрофилов в очаге воспаления [6, 14], стимулирует синтез интерлейкина-6 и интерлейкина-8 [18], повышает экспрессию молекул II класса главного комплекса гистосовместимости и увеличивает продукцию а-фактора некроза опухоли, который значительно усиливает системные воспалительные проявления [13].
Поражение почек при СКВ, как правило, ассоциировано с бактериальной инфекцией, стимулирующей мезангиальные клетки к синтезу провоспалительных цитокинов, в том числе интерлейкина-18 [15], который ингибирует апоптоз нейтрофилов путем активации фосфатидилинозитол 3-киназы (Р13К) и внеклеточной сигнал-регулируемой протеинкиназы [11].
Выводы
Таким образом, установлено изменение кислородзависимо-го метаболизма нейтрофилов в зависимости от уровня экспрессии проапоптозного антигена Ьак. Определение показателей спонтанного апоптоза нейтрофилов является перспективным методом оценки возможности развития лейкоцитоза и поражения почек при системной красной волчанке.
ЛИТЕРАТУРА
1. Маянский Н.А. Каспазозависимый механизм апоптоза нейтрофилов: апоптогенный эффект ТНФ-а // Иммунология. — 2002. — № 1. — С. 15-18.
2. Маянский А.Н., Маянский Н.А., Заславская М.И. и др. Апоптоз нейтрофилов // Иммунология. — 1999. — № 6. — С. 11-20.
3. Птушкин В.В. Роль гранулоцитарного и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующих факторов в лечении инфекции при нейтропении // Современная онкология. — 2001. — № 3. — С. 102-104.
4. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. — М.: Медиасфера, 2006. — 312 с.
5. Романова Н.В. Окислительный стресс циркулирующих фагоцитов и поражения органов и систем при системной красной волчанке // Фундаментальные исследования. — 2005. — № 2. — С. 34.
Полный список литературы на сайтах www.mfvt.ru,www.pmarchive.ru
