CC BY
54
DOI: 10.23868/201811036
КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИЙ ГЕНОВ DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 И WT1 У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ МИЕЛОИДНЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ В ВОЗРАСТНОЙ ГРУППЕ 15-45 ЛЕТ
А.В. Виноградов1, 2, А.В. Резайкин1, С.В. Сазонов1, 3, А.Г. Сергеев1
1 Уральский государственный медицинский университет, Екатеринбург, Россия
2 Свердловская областная клиническая больница № 1, Екатеринбург, Россия
3 Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург, Россия
CLINICAL AND PATHOLOGiCAL FEATURES DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 AND
WT1 GENES MUTATIONS DETECTION IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENTS AGED 15-45 YEARS
OLD
A.V. Vinogradov2, A.V. Rezaykin1, S.V. Sazonov1, 3, A.G. Sergeev1
1 Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russia
2 Sverdlovsk Regional Clinical Hospital № 1, Ekaterinburg, Russia
3 Institute of Medical Cell Technologies, Ekaterinburg, Russia
Частота возникновения острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) увеличивается с возрастом, соответственно, спектр выявляемых генных мутаций и задействованные механизмы онкогенеза могут варьировать и влиять на прогноз лечения.
Цель исследования — определить частоту мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 у больных ОМЛ в возрастной группе от 15 до 45 лет.
Анализировали пробы костного мозга и периферической крови 36 больных ОМЛ (возраст 15-45 лет), которые были разделены на группы в соответствии с морфологическим вариантом ОМЛ: МО — 2 пациента, М1 — 1, М2 — 15, М3 — 2, М4 — 11, М4эо — 2, М5 — 2, бластная плазмацитоидная дендритоклеточ-ная опухоль — 1. Детекцию мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 проводили методом прямого автоматического секвенирования.
В исследованной группе преобладали больные ОМЛ из подгрупп неблагоприятного (41,7 %, n=15) и промежуточного (30,6 %, n=11) цитогенетического прогнозов. Дополнительный анализ биоматериала пациентов с использованием технологии прямого автоматического секвенирования позволил в 41,7 % (n=15) случаев обнаружить криптические генные мутации, в т. ч. у 6 больных (40,0 %) — в подгруппе неблагоприятного, у 6 (54,5 %) — промежуточного и у 3 (37,5 %) — благоприятного ци-тогенетического прогнозов. С наибольшей частотой выявлялись мутации в экзонах 12-15 и 19-21 гена FLT3 (21,9 % проб, n=7). Частота детекции клинически значимых мутаций в остальных исследованных генах составила: NRAS — 13,0 % (n=3), NPM1 — 10,7 % (n=3), KIT — 10,0 % (n=3), WT1 — 11,1 % (n=2), DNMT3A — 7,1% (n=1). Патогенетически значимые мутации ТР53 в исследованных пробах (n=29) не выявлялись. Множественные (две и более) функционально значимые мутации определялись в 13,9 % пробах (n=5). При этом наиболее часто в кооперации участвовали мутации гена KIT, в т. ч. у 2 пациентов — трансверсия с. 1621 А>С. Выявление криптических генных мутаций методом секвенирования позволило у 7 пациентов (36,8 %) уточнить прогноз ОМЛ из подгрупп благоприятного и промежуточного прогнозов. В целом, по результатам цитогенетического и дополнительного молекулярно-генетического исследования благоприятный прогноз вероятностной выживаемости установлен у 6 больных (16,7 %), промежуточный — у 10 (27,8 %), неблагоприятный — у 18 (50,0 %), неуточненный — у 2 (5,6 %).
Ключевые слова: мутация, острый миелоидный лейкоз, прогноз, ген DNMT3A, ген FLT3, ген KIT, ген NPM1, ген NRAS, ген TP53, ген WT1, прямое автоматическое секвенирование.
Введение
Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) представляют собой гетерогенную группу опухолевых заболеваний системы крови, характеризующихся клональной пролиферацией в костном мозге и других органах, подвергшихся злокачественной трансформации кроветворных клеток, что приводит к развитию клинико-лабораторного синдрома костномозговой недостаточности.
The frequency of acute myeloid leukemia (AML) increases with age, respectively, the range of identified gene mutations and the pathways involved carcinogenesis can vary and affect the prognosis of treatment.
The aim of the study was to estimate the frequency of mutations in DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 and WT1 genes in acute myeloid leukemia (AML) patients (pts) aged 15-45 years old using direct automatic sequencing technique.
Bone marrow and peripheral blood samples obtained from 36 AML pts aged 15 to 45. Distribution of the pts according to FAB-classification was as follows: AML M0 - 2, M1 — 1, M2 - 15, M3 -2, M4 — 11, M4eo — 2, M5 — 2, blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm-1. Detection of mutations in ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 and WT1 genes performed by automatic direct sequencing technique.
The average frequency of functionally significant mutations in all investigated genes among the treated AML pts was 41,7 % (n=15), including 6 cases (40,0 %) with unfavorable cytogenetics, 6 cases (54,5 %) with normal karyotype, 3 cases (37,5 %) with favorable cytogenetics. These data correspond to the average frequency of point mutation in AML with normal and abnormal karyotype. Average frequency of mutations in FLT3 gene exons 12-15 and 19-21 — 21,9 %, NRAS gene exons 1-4 — 13,0 %, WT1 gene exons 6-9 — 11,1%, NPM1 gene exons 9-12 was 10,7 %, KIT gene exons 7-12 and 16-19 — 10,0 %, DNMT3A exons 18-26 — 7,1 %, TP53 gene exons 4-11 — 0,0 %. Multiple point mutations in investigated genes detected in 13.9 % AML specimens (usually KIT gene non-synonymous substitution c. 1621 A>C). Cryptic gene mutations detection using direct sequencing technique allowed to clarify the prognostic stratification of AML from groups of favorable and intermediate prognosis in 36,8 % (n=7). Thus, using of cy-togenetic and additional molecular genetic research, a favorable prognosis of overall survival was established in 6 cases (16,7 %), intermediate — in 10 cases (27,8 %), adverse — in 18 cases (50,0 %), and unspecified — in 2 (5,6 %).
Keywords: acute myeloid leukemia, DNMT3A gene, FLT3 gene, KIT gene, NPM1 gene, NRAS gene, TP53 gene, WT1 gene, sequencing.
Злокачественная трансформация гемопоэтических клеток обусловлена возникновением мутаций в ряде ключевых генов, продукты которых вызывают нарушение молекулярных механизмов внутриклеточной сигнализации, регуляции клеточного цикла и программированной гибели [1-3]. Возникновение случайных соматических мутаций и их аккумуляция в стволовых кроветворных клетках по мере старения организма укладывается в одну
из гипотез старения и находит подтверждение в экспериментах [4]. Соответственно, частота возникновения ОМЛ неодинакова в разных возрастных группах: минимальная у детей и подростков, максимальная — у лиц старческого возраста. Однако молекулярно-генетические паттерны ОМЛ отличаются в различных возрастных группах пациентов. Так, для ОМЛ первого года жизни характерны аберрации с вовлечением гена MLL, тогда как для ОМЛ детей старшего возраста они более редки. У подростков и взрослых пациентов чаще встречаются транслокации t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), инверсия inv(16) (p13;q22), а также мутации генов NPM1 и CEBPA [5-8].
В предыдущих работах нами было показано, что детекция мутаций прото- и антионкогенов методом прямого секвенирования при ОМЛ в разных цитогенетических подгруппах позволяет выявлять криптические молеку-лярно-генетические аномалии, имеющие патогенетическое и прогностическое значение [9-11]. Однако исследований, посвященных анализу частот мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 в возрастном аспекте, в доступной литературе нами не обнаружено.
Цель исследования — определить частоту мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 у больных ОМЛ в возрастной группе от 15 до 45 лет.
Материал и методы
Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 36 больных ОМЛ в возрасте от 15 до 45 лет после получения информированного согласия, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематоло-гическом центре в период 2008-2017 гг. Среди пациентов было 17 мужчин (47,2 %) и 19 женщин (52,7 %). Средний возраст больных составлял 32,0±2,4 года.
Диагностику ОМЛ проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ [4-6] на основании клинической картины, цитологического анализа крови и костного мозга, цитохимического и иммунофенотипического исследования бластных клеток. По медицинским показаниям выполняли трепанобиопсию подвздошной кости с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованием [8]. Морфологический вариант ОМЛ определяли согласно франко-американо-британской (FAB) классификации [4, 12], в соответствии с которой пациенты были разделены на группы: М0 — 2 пациента, М1 — 1, М2 — 15, М3 — 2, М4 — 11, М4эо — 2, М5 — 2, бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль — 1.
Всем пациентам было выполнено цитогенетическое и (или) молекулярно-генетическое исследование аспирата костного мозга. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени исследовали транслокации t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), t(9;22) (q34;q11), инверсию inv(16)(p13;q22), аномалии сегмента 11(q23). В двух пробах костного мозга пациентов с ОМЛ М2 уточнить вариант генетической поломки с применением цитогенетического и ПЦР-методов не удалось. Они, соответственно, были классифицированы как ОМЛ с неуточненным кариотипом [9].
Детекцию криптических генных мутаций осуществляли с помощью технологии прямого автоматического сек-венирования. Всего на наличие мутаций в кодирующих последовательностях экзонов 12-15 и 19-21 гена FLT3 в изучаемой выборке были протестированы 32 пробы периферической крови и костного мозга, экзонов 7-12 и 16-19 гена KIT — 30, экзонов 4-11 гена ТР53 — 29, экзонов 9-12 гена NPM1 — 28, экзонов 1-4 гена NRAS— 23, экзонов 6-9 гена WT1 — 18, экзонов 18-26 гена DNMT3A — 14. Праймеры, использованные для детекции мутаций в указанных генах, описаны нами ранее [13, 14].
Проверку статистических гипотез проводили с помощью точного критерия Фишера (F). Доверительные интервалы (ДИ) для средних частот мутаций генов определяли на основе биномиального распределения.
Результаты
Преобладающим типом хромосомных аберраций в исследуемой группе больных являлись специфические генетические аномалии (38,9 %, n=14, при 95 % ДИ от 24,8 до 55,1 %), у 11 пациентов (30,6 %, при 95 % ДИ от 18,0 до 46,9 %) был определен нормальный кари-отип лейкозных бластов. Специфические структурные аберрации хромосом, ассоциированные с благоприятным прогнозом, были выявлены у 8 пациентов (22,2 %, при 95 % ДИ от 11,7 до 38,1 %), при этом с наибольшей частотой среди них определялась инверсия хромосомы 16, (у 6 пациентов, 16,7 %, при 95 % ДИ от 7,9 до 31,9 %) при морфологических вариантах ОМЛ М2 и М4.
Специфические структурные аберрации, ассоциированные с неблагоприятным прогнозом, были определены у 5 пациентов (13,9 %, при 95 % ДИ от 6,0 до 28,7 %), в том числе транслокация t(9;22)(q34;q11) — в 2 случаях (5,6 %, при 95 % ДИ от 1,6 до 18,2 %), изолированные моносомия хромосомы 5, делеция длинного плеча хромосомы 5, транслокация t(11;19)(q23;p13) — по одному случаю (2,8 %, при 95 % ДИ от 0,5 до 14,2 %). Комплексные изменения кариотипа лейкозных бластов также были обнаружены в 5 пробах больных (1 3,9 %, при 95 % ДИ от 6,0 до 28,7 %) с ОМЛ М0, М2, М4 и М5, а также в пробе пациента с бластной плазмацитоидной дендритоклеточной опухолью.
Генетические изменения в экзонах 12-15 и 1921 гена FLT3 были выявлены у 9 пациентов (28,1 %, при 95 % ДИ от 15,5 до 45,3 %), при морфологических вариантах М0, М2, М3 и М4. Среди них в одной пробе периферической крови была определена несинонимичная нуклеотидная замена с. 1471 G>T (3,1%, при 95 % дИ от 0,5 до 15,7 %), в другой — несинонимичная трансверсия с. 2522 A>T (3,1 %, при 95 % ДИ от 0,5 до 15,7 %), в двух пробах (6,2 %, при 95 % ДИ от 1,8 до 20,2 %) — синонимичные однонуклео-тидные замены (с. 1683 A>G), в 5 (15,6 %, при 95 % ДИ от 6,8 до 31,7 %) — внутренние тандемные дупли-кациии (ITD) кодирующей последовательности юкста-мембранного и киназного доменов (рис. 1). Последние оказались наиболее частыми функционально значимыми генными мутациями, выявленными в исследуемой группе. Важно отметить, что точка дупликации и длина дуплицирующегося фрагмента при FLT3 ITD варьировали в каждой из исследуемых проб [15, 16].
В одной из проб периферической крови больного ОМЛ М4, наряду с FLT3 ITD, была показана инсерция в экзоне 12 гена NPM1, описанная нами ранее [8]. При ОМЛ М3, FLT3 ITD выявлялась в пробах периферической крови и ликвора в сочетании с заменами с. 1621 А>С и с. 2586 G>C в гене KIT (табл. 1). Кроме того, было доказано сочетание несинонимичной трансверсии с. 1471 G>T в гене FLT3 с заменами с. 1621 А>С и с. 2586 G>C в гене KIT при ОМЛ М2 с инверсией хромосомы 16.
Инсерции в экзоне 12 гена NPM1, ассоциированные с благоприятным прогнозом ОМЛ [4-6], были определены у 3 пациентов (10,7 %, при 95 % ДИ от 3,7 до 27,2 %). Они были представлены инсерциями типа А, В, а также Ural-1 [8], описанной нами ранее (по 1 случаю, 3,6 % при 95 % ДИ от 0,6 до 17,8 %, при вариантах ОМЛ М4, М2 и М4, соответственно, табл. 2). При этом в случае ин-серции типа Ural-1 частично утраченный NoLS-мотив сочетался с типичным NES-мотивом (L-xxx-V-xx-V-x-L), что,
Рис. 1. Результаты прямого автоматического секвенирования кодирующей последовательности гена ПТ3 при ОМЛ М2 с диплоидией и ПТ3 Ий, резистентном к программной химиотерапии
по данным ранее проведенного иммуногистохимическо-го анализа, сопровождалось аномальной цитоплазмати-ческой экспрессией белка Npm1 [8].
У 2 пациентов с ОМЛ М4, наряду с инсерциями в экзоне 12 гена NPM1, выявлялись мутации в других исследованных генах, в том числе FLT3 ITD и делеция в гене KIT (по одному случаю, табл. 1). Проведенные ранее расчеты показали, что мутации генов NPM1 и FLT3 являлись неслучайными генетическими событиями, кооперирующимися в онкогенезе, и их наличие могло обусловливать ухудшение прогноза вероятностной выживаемости NPM1 -позитивных ОМЛ [8, 10].
Структурные изменения экзонов 7-12 и 16-19 гена KIT относительно референсной последовательности NM_000222 были выявлены у 12 пациентов (40,0 %, при 95 % ДИ от 24,6 до 57,7 %). Среди них в 7 случаях были показаны синонимичные однонуклеотид-ные замены (23,3 %, при 95 % ДИ от 11,8 до 40,9 %, с. 2586 G>C, с. 1638 A>G, с. 2394 С>Т), в 2 (6,7 %, при 95 % ДИ от 1,9 до 21,4 %) — несинонимичная однонукле-отидная замена с. 1621 А>С в сочетании с синонимичной трансверсией с. 2586 G>C, по 1 случаю (3,3 %, при 95 % ДИ от 0,6 до 16,6 %) — несинонимичная замена с. 2447 A>T, инсерция и делеция (n. Del 1529-1774). В последнем случае, ОМЛ М4, наряду с делецией в гене KIT, была обнаружена инсерция типа А в экзоне 12 гена NPM1 (табл. 1). В 2 пробах (при ОМЛ М2 и М3) с несинонимичной трансверсией с. 1621 A^ в сочетании с синонимичной с. 2586 G>C определялись также изменения в кодирующей последовательности гена FLT3 — несинонимичная замена с. 1471 G>T и ITD (по 1 случаю, табл. 1). По литературным данным, трансверсия с. 1621 A^ является полиморфным аллельным вариантом гена KIT, не имеющим прогностического значения [17, 18], что соответствует полученным ранее данным о случайном характере ее сочетания с другими мутациями прото-и антионкогенов при ОМЛ [9-11].
Изменения в кодирующей последовательности гена WT1 были обнаружены в пробах периферической крови 2 пациентов (11,1 %, при 95 % ДИ от 3,1 до 32,8 %) с ОМЛ М2 и М3. В первой пробе, при резистентном ОМЛ М2 в исходе МДС с делецией длинного плеча хромосомы 5 (синдром 5q-), определялась делеция 84 нуклеоти-дов в позициях с 1289 по 1372 от начала кодирующей последовательности, соответствующих экзону 8 (n. Del 1289-1372). Аналогичные делеции, ассоциированные с неблагоприятным прогнозом, были описаны нами ранее при ОМЛ М5 с нормальным кариотипом с инсерцией типа D в экзоне 12 гена NPM1 и ОМЛ с неуточненным кариотипом [9, 10]. Во второй пробе (ОМЛ М3) выявлялась нонсенс-мутация с. 1288 С>Т в гене WT1, а также ITD FLT3 и замены с. 1621 A>a с. 2586 G>C в гене KIT (табл. 1). Указанная нонсенс-мутация по первой позиции триплета CGA приводила к формированию стоп-кодона TGA, что обусловливало укорочение и потерю функциональной активности кодируемого полипептида Wt1.
Частота детекции точечных мутаций в кодирующей последовательности экзонов 18-26 гена DNMT3A в исследуемой выборке составила 7,1 % (при 95 % ДИ от 1,3 до 31,4 %). Выявленная мутация была представлена несинонимичной транзицией с. 2644 С^ и определялась при ОМЛ М4 с комплексными хромосомными аберрациями (кариотип 48, ХХ, +4, +21 [2]/47, XX, +4 [3]/46, XX [2]) и функционально значимой трансверсией с. 2447 A>T в гене KIT (табл. 1).
Точечные мутации в гене NRAS были выявлены у 3 пациентов (13,0 %, при 95 % ДИ от 4,5 до 32,1 %) с ОМЛ М0, М2базо и м2, представлены, соответственно, несинонимичными функционально значимыми однонуклеотидными заменами с. 35 G>A, с. 1 82 А>С, с. 188 А>Т и ассоциировались с неблагоприятным прогнозом вероятностной выживаемости пациентов.
Патогенетически значимые для ОМЛ мутации в экзонах 4-11 гена TP53 в исследованных пробах
Таблица 1. Характеристика проб больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет с множественными мутациями в исследованных генах. Функционально значимые мутации (в т. ч. KIT с. 1621 А>С) выделены полужирным шрифтом; WT — «дикий тип», «-» — исследование не проводилось, ITD — внутренняя тандемная дупликация, NK — нормальный кариотип
Характеристика генных мутаций Подтип Аберрации Кол-во -
по FAB хромосом мутаций ^^^ FLT3 KIT NPM1 WT1
М3 М4
М2
М4 М4
t(15;17), inv(9) (p12;q12)
48, ХХ, +4, +21 [2]/47, XX, +4 [3] /46, XX [2]
inv(16)
NK NK
2 2
WT
с. 2644 C>T
ITD
WT
с. 1471 G>T
ITD
WT
с. 1621 А>С,
с. 2586 G>C
с. 2447 A>T
с. 1621 А>С,
с. 2586 G>C
WT
WT*
WT
с. 1288 С>Т
с. 2394 С>Т 4 bp INS n. Del 1529-1774 4 bp INS
WT
WT
5
4
3
Таблица 2. Изменения в кодирующих последовательностях экзона 12 гена МРМ1, возникающие вследствие инсерций типа А, В и 1_1гаИ. полужирным шрифтом выделены остатки триптофана образующие сигнал ядрышковой локализации; подчеркнуты аминокислотные остатки, образующие сигнал ядерного экспорта белка Ырт1
Мутация Нуклеотидная последовательность ДНК экзона 12 гена NPM1 Аминокислотная последовательность белка*
A gatctctg TCTG gcagtggaggaagtctctttaagaaaatag DLCLAVEEVSLRK
B gatctctg CATG gcagtggaggaagtctctttaagaaaatag DLCMAVEEVSLRK
Ural-1 gatctctg GCTG gcagtggaggaagtctctttaagaaaatag DLWLAVEEVSLRK
Таблица 3. Частота выявления криптических генных мутаций у больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет в сравнении с результатами исследований больных ОМЛ с нормальным и аберрантными кариотипами
Частота мутаций в исследованных генах, %
Исследуемая группа -
DNMT3A FLT3 KIT NPM1 NRAS TP53 WT1
Нормальный кариотип [9] 8,3 22,0 16,7 50,0 13,0 3,1 4,5
Аберрантный кариотип [11] — 9,6 14,3 — 19,2 18,4 3,6
ОМЛ возраст 15-45 лет 7,1 21,9 10,0 10,7 13,0 0,0 11,1
не определялись (n=29). Однако у 1 пациента (3,4 %, при 95 % ДИ от 0,6 до 17,1 %) с ОМЛ М2 с t(9;22) была обнаружена синонимичная транзиция с. 891 С>Т.
Обсуждение
Функционально значимые мутации в кодирующих последовательностях экзонов 18-26 гена DNMT3A, 1215 и 19-21 гена FLT3, 7-12 и 16-19 гена KIT, 1-4 гена NRAS, 9-12 гена NPM1, 4-11 гена ТР53 и 6-9 гена WT1 были выявлены с использованием технологии прямого автоматического секвенирования в 1 5 пробах от больных ОМЛ в возрасте от 15 до 45 лет (41,7 %, при 95 % ДИ от 27,2 до 57,8 %), что коррелировало с ранее полученными результатами (табл. 3) [9-1 1 ]. По две и более функционально значимые криптические мутации в исследованных генах определялись у 5 больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет (13,9 %, при 95 % ДИ от 6,1 до 28,7 %).
В предшествующих исследованиях нами было показано [9], что при ОМЛ с нормальным кариотипом с наибольшей частотой выявлялись мутации генов NPM1 и FLT3 (50,0 % и 22,0 %, соответственно), которые у 40,0 % больных кооперировались друг с другом,
причем указанное взаимодействие носило неслучайный характер. Напротив, при ОМЛ с аберрантными кариотипами наиболее часто определялись мутации генов NRAS и TP53 (19,2 % и 18,4 %, соответственно) и кооперации указанных молекулярных событий не наблюдалось [11]. В группе больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет с диплоидным кариотипом бластов инсерции в экзоне 12 гена NPM1 были обнаружены в 37,5 % случаев, FLT3 ITD — в 30,0 %, и их кооперация определялась только в одной из трех NPM1 -позитивных проб. Среди больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет с аберрантными кариотипами лей-козных бластов установить преобладающий тип крипти-ческих генных мутаций оказалось невозможным, так как максимальная частота выявляемых методом прямого автоматического секвенирования молекулярных повреждений исследованных генов не превышала 14,2 %, а в диапазоне частот от 10,0 до 14,2 % определялись мутации в пяти из них (WT1, FLT3, NRAS, KIT и DNMT3A). При этом патогенетически значимые для ОМЛ мутации гена ТР53 в исследуемых пробах выявлены не были.
Известно, что наличие криптических мутаций в генах DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS и WT1 является прогностически неблагоприятным молекулярным предиктором при
ОМЛ [1, 6, 7, 19]. Следовательно, их обнаружение у больных ОМЛ с благоприятным и промежуточным цитогене-тическим прогнозами позволяло уточнить вероятность достижения стойкой продолжительной ремиссии при проведении стандартной полихимиотерапии.
В исследованной группе больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет преобладали пациенты из групп неблагоприятного (41,7 %, при 95 % ДИ от 27,2 до 57,8 %) и промежуточного (30,6 %, при 95 % ДИ от 18,0 до 46,9 %) цитогенетического прогнозов. Однако дополнительное исследование биоматериала пациентов с использованием технологии прямого автоматического секвениро-вания позволило в 41,7 % случаев выявить криптиче-ские патогенетически значимые мутации генов, в т. ч. в 6 случаях (40,0 %, при 95 % ДИ от 19,8 до 64,2 %) — в подгруппе неблагоприятного, в 6 (54,5 %, при 95 % ДИ от 28,0 до 78,7 %) — промежуточного и в 3 (37,5 %, при 95 % ДИ от 13,7 до 69,4 %) — благоприятного прогнозов. При этом прогностическая стратификация ОМЛ улучшалась лишь в одном случае (2,8 %, при 95 % ДИ от 0,5 до 14,2 %) при детекции изолированной ин-серции в экзоне 12 гена NPM1, а в двух случаях (5,6 %, при 95 % ДИ от 1,6 до 18,2 %) при сочетании инсерции в гене NPM1 с FLT3 ITD и делецией в гене KIT с диплои-дией прогноз не изменялся. Во всех остальных случаях криптические генные мутации оказались ассоциирова-ными с неблагоприятным прогнозом. Таким образом применение прямого автоматического секвенирова-ния позволило уточнить прогноз у 7 (36,8 %, при 95 % ДИ от 15,9 до 44,0 %) больных ОМЛ из групп благоприятного и промежуточного цитогенетического прогнозов.
В целом, по результатам цитогенетического и дополнительного молекулярно-генетического исследования, благоприятный прогноз общей вероятностной
ЛИТЕРАТУРА:
1. The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epig-enomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. NEJM 2013; 368: 2059-74.
2. Ho T.C., LaMere M., Stevens B.M. et al. Evolution of acute myelogenous leukemia stem cell properties after treatment and progression. Blood 2016; 128: 1671-8.
3. Murati A., Brecqueville M., Devillier R. et al. Myeloid malignancies: mutations, models and management. BMC Cancer 2012; 12: 304.
4. Shlush L.I., Zandi S., Itzkovitz S. et al. Aging, clonal hematopoiesis and preleukemia: not just bad luck? Int. J. Hematol. 2015; 102: 513-22.
5. Vardiman J.V., Thiele J., Arber D.A. et al. The 2008 revision of the WHO classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 2009; 114: 937-52.
6. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016; 127: 2391-405.
7. Metzeler K.H., Herold T., Rothenberg-Thurle M. et al. Spectrum and prognostic relevance of driver gene mutations in acute myeloid leukemia. Blood 2016; 128: 686-98.
8. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р. и др. Сравнительный анализ результатов типирования молекулярных повреждений гена NPM1 при острых миелоидных лейкозах с использованием прямого автоматического секвенирования и иммуногистохимическо-го метода. Вестник Уральской медицинской академической науки 2013; 4: 124-7.
9. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Изотов Д.В. и др. Применение технологии прямого автоматического секвенирования для детекции мутаций генов ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах с неуточненным кариотипом. Вестник Уральской медицинской академической науки 2016; 4: 38-51.
10. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р. и др. Детекция мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, KRAS, NRAS, NPM1, TP53 и WT1 при
выживаемости был установлен у 6 пациентов (16,7 %, при 95 % ДИ от 7,9 до 31,9 %), промежуточный—у 10 (27,8 %, при 95 % ДИ от 15,9 до 44,0 %), неблагоприятный — у 18 (50,0 %, при 95 % ДИ от 34,5 до 65,5 %) и неуточненный — у 2 (5,6 %, при 95 % ДИ от 1,6 до 18,2 %). Мы считаем, что полученные данные необходимо учитывать для планирования и разработки у больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет персонализированных программ противоопухолевого лечения, включающих назначение таргетных биофармацевтических препаратов, специфичных к ключевым молекулярным повреждениям лейкемических клеток, а также при определении медицинских показаний к проведению трансплантации костного мозга [19, 20].
Выводы
1. Кумулятивная частота детекции патогенетически значимых криптических мутаций в генах DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, NPM1 и WT1 у больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет составляла 41,7 %.
2. С максимальной частотой у больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет определялись мутации в гене FLT3 (21,9 %), частота клинически значимых мутаций остальных исследованных генов варьировала в диапазоне 7,1-13,0 %. Значимые для патогенеза ОМЛ мутации гена TP53 в исследованных пробах не определялись.
3. Частота обнаружения множественных крип-тических генных мутаций у больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет составляла 13,9 %, наиболее часто в кооперации участвовали мутации гена KIT.
4. Применение прямого автоматического секвени-рования позволило уточнить прогноз у 36,8 % больных ОМЛ. Прогноз стандартного химиотерапевтического лечения ОМЛ при этом ухудшался во всех случаях, за исключением выявления инсерций в экзоне 12 гена NPM1.
острых миелоидных лейкозах с нормальным кариотипом бластных клеток. Вестник Уральской медицинской академической науки 2016; 2: 89-101.
11. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция мутаций генов FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах с аберрантными кариотипами. Вестник Уральской медицинской академической науки 2015; 1: 77-84.
12. Walter R.B., Othus M., Burnett A.K. et al. Significance of FAB subclassification of "acute myeloid leukemia, NOS" in the 2008 WHO classification: analysis of 5848 newly diagnosed patients. Blood 2013; 121: 2424-31.
13. Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мутаций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах. Российский онкологический журнал 2013: 4: 34-5.
14. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция точечных мутаций в гене DNMT3A при острых миелоидных лейкозах методом прямого автоматического секвенирования. Бюллетень сибирской медицины 2015; 14 (1): 18-23.
15. Chan P.M. Differential signaling of Flt3 activating mutations in acute myeloid leukemia: a working model. Protein Cell 2011; 2: 108-15.
16. Smith C.C., Wang Q., Chin C.S. et al. Validation of ITD mutations in FLT3 as a therapeutic target in human acute myeloid leukaemia. Nature 2012; 485: 260-3.
17. Szatkowski D., Hellmann A. The overexpression of KIT proto-onco-gene in acute leukemic cells is not necessarily caused by the gene mutation. Acta Haematol. 2015; 133: 116-23.
18. Heldin C.H., Lennartsson J. Structural and functional properties of platelet-derived growth factor and stem cell factor receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013; 5(8): a009100.
19. Grossmann V., Schnittger S., Kohlmann A. et al. A novel hierarchical prognostic model of AML solely based on molecular mutations. Blood 2012; 120: 2963-72.
20. Coombs C.C., Tallman M.S., Levine R.S. Molecular therapy for acute myeloid leukaemia. Nature Rev. Clin. Oncology 2016: 13: 305-18.
Поступила: 19.04.2018
