CC BY
73
КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ И АКТИВНОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
И.Е. Окрут1, К.Н. Конторшикова1, Д.А. Шакерова2,
'ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»,
2ГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Конторшикова Клавдия Николаевна - e-mail: [email protected]
В представленной работе в качестве объекта исследования была использована плазма крови больных раком молочной железы I и II стадии заболевания. Нами оценены показатели метаболитов оксида азота, спонтанной и индуцированнной агрегации тромбоцитов и параметры перекисного окисления липидов. Установлено достоверное повышение активности перекисного окисления липидов в крови больных РМЖ по показателям молекулярных продуктов ПОЛ, уровня спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов. Наряду с этим повышалась концентрация конечных метаболитов оксида азота, что свидетельствует об эндотелиальной дисфункции и о прогрессировании патологического процесса на фоне онкопатологии.
Ключевые слова: оксид азота, эндотелиальная дисфункция, перекисное окисление липидов.
In the present study as a research object was used blood plasma of patients with breast cancer I and II stage disease. We evaluated rates of metabolites of nitric oxide, spontaneous and inducated platelet aggregation and parameters of lipid peroxidation. Established a significant increase in lipid peroxidation in the blood of patients with breast cancer at molecular products of lipid peroxidation parameters, levels of spontaneously and induced platelet aggregation. In addition, the increased concentration of the final metabolites of nitric oxide indicates endothelial dysfunction and the progression of the pathological process in the background of cancer pathology.
Key words: nitric oxide, dysfunction of endothelium, lipid peroxidation.
Введение
У больных злокачественными новообразованиями с развитием заболевания возникают выраженные патологические нарушения функции многих органов. Опухоль оказывает депрессивное влияние на системы и структуры всего организма больного в результате воздействия биологически активных продуктов метаболизма злокачественного роста. Существует предположение, что биологически активные метаболиты, выделяемые в процессе жизнедеятельности раковых клеток, оказывают негативное влияние на эндотелий сосудов. С другой стороны, эндотелиальная дисфункция определяет тяжесть течения заболевания и эффективность выбранной терапии. К началу наступившего века отчетливо сформировалось направление, которое сосредоточило внимание клиницистов на новом объекте - эндотелии, поскольку он является органом-мишенью при развитии различных заболеваний. Поэтому необходима коррекция дисфункции
эндотелия, которая является главным фактором риска почечной недостаточности, атеросклероза, метаболических нарушений, онкологических заболеваний. Обращение к этой теме обусловлено недостаточным арсеналом диагностических средств для многоплановой оценки работы эндотелия кровеносных сосудов при онкологической патологии. Цель настоящего исследования - изучить состояние сосудистого эндотелия по показателям метаболитов оксида азота, параметры тромбоцитарного звена гемостаза и биохимические маркеры, характеризующие свободнорадикальное окисление в крови больных раком молочной железы I и II стадии заболевания.
Эндотелий - однослойный пласт специализированных клеток мезенхимного происхождения, выстилающих кровеносные, лимфатические сосуды и полости сердца. Это не пассивный барьер между кровью и тканями, а активный орган, дисфункция которого является обязательным компонентом
Лабораторная диагностика
патогенеза практически всех сердечно-сосудистых заболеваний, а также участвует в воспалительных реакциях, диабете, тромбозе, росте злокачественных опухолей [1].
Среди изобилия биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, важнейшим является оксид азота
- N0. Открытие ключевой роли N0 в сердечно-сосудистом гомеостазе было удостоено Нобелевской премии в 1998 году. Сегодня это самая изучаемая молекула, вовлеченная в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная выработка N0 с помощью эндотелиальной N0-синтетазы ^N05) из 1_-аргинина [2]. Это необходимо для поддержания нормального тонуса сосудов. В то же время, N0 подавляет пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов, предотвращая патологическую перестройку сосудистой стенки, прогрессирование атеросклероза [3].
В больших концентрациях N0 может оказывать на клетки токсический эффект, связанный с образованием сильного окислителя, очень реакционного и токсичного свободнорадикального соединения пероксинитрита ^N00-), образующегося при взаимодействии N0 с радикальным супероксид анионом. Способствует снижению уровня АТФ и может приводить к клеточной гибели. В клетках, подвергнутых действию высоких концентраций N0, нарушается энергетический обмен и синтез ДНК. В организме эта способность оксида азота используется для уничтожения опухолевых клеток макрофагами, которые не только сами производят N0, но и секретируют фактор некроза опухолей, который вызывает индукцию N05 в опухолевых и других клетках. Активация IN05 имеет место при болезнях иммунной системы, сердечно-сосудистых заболеваниях, злокачественных заболеваниях, остром и хроническом воспалении [4].
Материалы и методы
В качестве объекта исследования была использована плазма крови больных с патологией РМЖ. В качестве контроля исследована кровь, полученная от практически здоровых людей (контрольная группа). Нами было оценено около 50 проб на перекисное окисление липидов и около 50 проб на N0. Нами исследованы показатели спонтанной и индуци-рованнной агрегации тромбоцитов. Для оценки функционирования эндотелия использовалось определение концентраций оксида азота по методике П.П. Голикова [5]. О концентрации оксида азота в крови судили по содержанию в сыворотке его конечных метаболитов - нитрата и нитрита как наиболее верифицированных маркеров оценки метаболизма оксида азота в организме живого человека, измерение концентраций проводилось с помощью спектрофотометра АРЕ_ РР 303 (Япония) при длине волны 546 нм в кювете 10 мм против контроля. В качестве стандарта использовали эталонный раствор с концентрацией нитритов 50 рмоль/л. Расчет производили по формуле (1).
— х50, (1), где
Ек
Е0 - экстинция опыта,
Ек - экстинция эталона,
50 - концентрация нитритов в эталонном растворе.
Для изучения состояния свободнорадикального окисления использовалась спектроскопия молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и биохемилю-
минесцентный метод. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (диеновые конъюгаты, триеновые конъюгаты, основания Шиффа) определяли методом спектро-фотометрии И.А. Волчегорского. Производили замер оптических плотностей (Е) на спектрофотометре СФ-46 при толщине кюветы 1 см. Оценивалась каждая фаза против соответствующего контроля при длинах волн 220 нм (поглощение изолированных двойных связей), 232 нм (поглощение ДК), 278 нм (поглощение ТК), 400 нм (поглощение ОШ). Содержание ДК, ТК, ОШ оценивали по относительным величинам Е232/Е220, Е278/Е220, Е400/Е220 и соответственно выражали в относительных величинах. Анализ свободнорадикального окисления и активности антиоксидант-ной системы в сыворотке крови проводили биохемилюми-несцентным методом. Для регистрации индуцированной хемилюминесценции использовался прибор биохемилю-минометр (БХЛ-07, Н. Новгород), сопряженный с компьютером IBM PC/AT в диалоговом режиме. Результат распечатывался в унифицированной форме в виде хемилюминограм-мы с расчетом следующих параметров:
- Индекс 1тах,где Imax (mv) - максимальная интенсивность свечения, показывающая потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению липидов;
- Индекс S, где S (mv) - светосумма хемилюминесценции за 30 секунд, отражающая содержание в плазме радикалов.
Статистическая обработка полученных результатов произведена с помощью методов вариационной статистики.
Результаты и их обсуждение
Для оценки состояния сосудистого эндотелия при РМЖ (I-II стадии) использовали определение концентрации оксида азота по его конечным метаболитам - нитратам и нитритам - маркеров эндотелиальной дисфукции. Данные, полученные в исследовании, представлены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1.
Содержание нитритов и нитратов в крови больных РМЖ (M±b)
Показатели Концентрация нитритов, мкмоль/л Концентрация нитратов, мкмоль/л
Норма 63,54 ±21,12 160,42+29,21
До лечения 290,41+37,89* 329,87+52,30*
После лечения 65,84+19,08** 170,42+20,23
Примечания: * - р<0,05 по сравнению с нормой,
** - р<0,005 по сравнению с показателями до лечения.
Из данных, представленных в таблице 1, видно, что содержание нитритов и нитратов в крови больных раком молочной железы превышает показатели группы здоровых лиц. Таким образом, у больных раком молочной железы до лечения наблюдалась повышенная концентрация нитритов (в 3 раза) и нитратов (в 2 раза) по сравнению с показателями в крови группы здоровых лиц. N0, соединяясь с кислородом, способен превращаться в нитраты, которые затем восстанавливаются до нитритов. Нитраты - соли азотной кислоты - не относятся к ядовитым веществам, но представляют опасность тем, что из них образуются нитриты - соли азотистой кислоты. Именно нитриты могут оказывать токсическое действие на организм, как прямое, так и опосредованное, через образование других вредных веществ, например нитроза-минов. Считается, что нитриты опасней нитратов в 30 раз. В организме человека нитраты и нитриты быстро всасываются в желудочно-кишечном тракте. Нитраты выводятся с
Лабораторная диагностика
мочой и частично превращаются в нитриты, а нитриты, особенно при поступлении в больших количествах, реагируют с гемоглобином крови, образуя его соединение - метгемо-глобин. Это вещество не может выполнять функции переносчика кислорода, как гемоглобин, что приводит к гипоксии (кислородному голоданию) тканей. В результате - ухудшение самочувствия, снижение работоспособности, общая слабость. У человека в крови в норме метгемоглобин может составлять до 2% от общего количества гемоглобина, что ведет к нарушению микроциркуляции в органах и тканях у онкологических больных.
Патология молочной железы относится к заболеваниям с выраженной воспалительной реакцией, в том числе и к онкологическим новообразованиям. Согласно данным литературы, заболевания с выраженной воспалительной реакцией характеризуются повышением уровня N0 [6]. В то же время, в очаге воспаления накапливается продукт частичного восстановления кислорода - супероксид. N0 и супероксид-анион подвергаются быстрому радикал-радикальному взаимодействию с образованием медиатора окислительного клеточного повреждения - пероксинитри-та. Пероксинитрит повреждает сосудистый эндотелий, увеличивает агрегацию тромбоцитов. Также пероксинитрит окисляет белки и липиды клеточных мембран. Известно, что в присутствии пероксинитрита или продуктов его распада образуются тиильные радикалы глутатиона, в результате чего последний из антиоксиданта превращается в прооксидант, инициируя перекисное окисление липидов [6]. Пероксинитрит проходит через внешнюю и внутреннюю мембраны клеток и, оказавшись внутри клетки, повреждает ДНК клетки-мишени путем ее дезаминирования, а также ингибирования рибонуклеотидредуктазы, которая регулирует скорость репликации ДНК [7].
Воспаление, гипоксия и окислительный стресс способны усиливать синтез цитокинов, которые экспрессируют инду-цибельную N05, а последняя в соответствии с ее уровнем активности генерирует высокий уровень N0. Снижение концентрации конечных метаболитов оксида азота - нитратов и нитритов было отмечено после лечения, что свидетельствует, по нашему мнению, об уменьшении воспалительной реакции.
Исследования, проведенные нами, указывают на повышение уровня свободнорадикального окисления и снижение антиоксидантной защиты при наличии РМЖ. Активность СРО, оцениваемая с помощью спектрофотометрии молекулярных продуктов ПОЛ, показана в таблице 2.
При исследовании содержания молекулярных продуктов ПОЛ у больных РМЖ уровни первичных продуктов ДК и ТК оказались повышенными по сравнению с нормой, соответственно, в 1,5 и 3 раза, показатель ОШ - наиболее токсичный продукта ПОЛ, так же был увеличен - в 4,5 раза. Повышение
показателей перекисного окисления липидов при РМЖ свидетельствует об интенсивности реакций свободнорадикального окисления и снижении уровней эндогенных антиоксидантов [8]. Состояние антиоксидантной системы защиты оценивалось методом биохемилюминесценции. Данные представлены в таблице 3.
ТАБЛИЦА 3.
Показатели общей антиоксидантной активности крови больных РМЖ (M±b)
Показатель Норма До лечения После лечения
I max 1.25+1.02 2.88+1.28* 2.59+1.08**
S 14.00+7.5 22.91+1.79* 22.26+1.12**
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с нормой,
** - р<0,005 по сравнению с показателями до лечения.
Показатели БХЛ говорят о снижении активации антиокси-дантных комплексов и повышении продукции свободных радикалов при наличии патологии, так как значения I max и S значительно превышают норму - в 2 и 1,5 раза соответственно. Такой прооксидантный сдвиг характерен для островоспалительных заболеваний [9]. Однако, после прохождения курса лечения нами отмечено снижение показателей I max и S, это свидетельствует о нормализации свободнорадикальных процессов за счет активации антиоксидантных реакций.
Заключение
1. Выбранные нами методы исследования позволили оценить изменения содержания нитратов и нитритов в крови пациентов с раком молочной железы. Результаты, полученные в ходе исследований, свидетельствуют об эндотелиальном ответе при РМЖ. После лечения их содержание приближалось к норме.
2. При наличии патологии было отмечено повышение уровня свободнорадикального окисления и снижение общей антиоксидантной активности. Показатели свидетельствуют об ингибировании антиоксидантных реакций и накоплении свободных радикалов в крови пациентов с РМЖ до лечения, после лечения активность антиоксидантной системы возрастала на фоне снижения активности ПОЛ.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Петрищев Н.И., Власов Т.Д. Дисфункция эндотелия: причины, механизмы, фармакологическая коррекция. С.-Пб.: Изд-во СПбГМУ, 2003. 184 с.
2.Lowenstein C.J., Dinerman J.L., Snyder S.H. Annual Internfal Medicine. 1994. V. 120. P. 227-237.
3.Nathan C., Xie Q. Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls. Cell. 1994. V. 79. P. 915-918.
4. Кастранова В.П. Биохимия. 2004. Т. 69. Вып. 1. С. 41-47.
5. Голиков П.Л. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний. М. 2004.
С. 180.
6. Коган А.Х., Грачёв С.В., Елисеева С.В., Болевич С.Н. Вопросы медицинской химии. 1996. Вып. 3. С. 193-202.
7. Степуро А.И., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 3. С. 416-429.
8. Янченко О.С. Особенности иммунного ответа на развитие опухоли у гинекологических больных до и после лечения. Автореферат. Н. Новгород. 2006. С. 20-23.
9. Колесова О.Е., Леонтьева М.И., Фролова Т.М., Зайцев В.Я., Синегуб Г.А. Стимулирующий эффект озонированного физиологического раствора на антиоксидантную систему организма. //Озон в биологии и медицине. Тезисы докладов I Всероссийской научно-практической конференции Н. Новгород. 1995. С. 32-33.
ТАБЛИЦА 2.
Активность ПОЛ в крови больных РМЖ (M±b)
Показатель Норма До лечения После лечения
ДК отн. ед. 0.165+0.75 0.232+0.61* 0.22+0.51**
ТК отн. ед. 0.04+0.01 0.112+0.72* 0.10+0.31**
ОШ отн. ед. 3.25+1.25 14.44+6.07* 12.93+5.06**
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с нормой,
** - р<0,005 по сравнению с показателями до лечения.
