CC BY
52
УДК 616.314.14.-008.1-089.844-07
по указанной активности. При накоплении повреждения (повторная гипоксия с последующей реоксигенацией) ЛХТ 51-93 и ЛХТ 52-93 приводили к сохранению функционального резерва сердца практически в равной степени.
При моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда производные арилалканов ЛХТ 51-93 и ЛХТ 52-93 приводили к сохранению миокардиального резерва, причем ЛХТ 51-93 превосходил ЛХТ 52-93 по указанной активности.
Наличие у производных арилалканов ЛХТ 51-93 и ЛХТ 52-93 защитного действия при моделировании ко-ронароокклюзионного инфаркта миокарда и гипоксии с последующей реоксигенацией дает, по нашему мнению, основания для рассмотрения данных веществ в качестве перспективных кардиопротективных средств.
Поступила 21.12.2006
ЛИТЕРАТУРА
1. Биленко М. Б. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М.: Медицина, 1989. 368 с.
2. Оковитый С. В., Смирнов А. В. Антигипоксанты // Экспер. и клин. фармакол. № 3. 2001. С. 76-80.
3. Ольбинская Л. И., Литвицкий П. Ф. Коронарная и миокардиальная недостаточность. М.: Медицина, 1986. 272 с.
4. Литвицкий П. Ф., Сандриков В. А., Демуров Е. А. Адаптивные и патогенные эффекты реперфузии и реоксигенации миокарда. М.: Медицина, 1994. 320 с.
5. Сернов Л. Н., Гацура В. В. Элементы экспериментальной фармакологии. М., 2000. С. 91-98.
E. N. PASHIN, I. A. LAZAREVA
CARDIOPROTECTIVE ACTION OF DERIVATIVES ARYLALKANES LHT 51-93 AND LHT 52-93
Experimental studies LHT 51-93 and LHT 52-93, the derivatives of arylalkanes, in rats were performed on the model of coronary-occluded myocardial infarction. Findings of studies would allow to suppose the cardioprotective action of LHT 51-93 and LHT 52-93. LHT 51-93 and LHT 52-93, the derivatives of arylalkanes, have promoted the keeping of myocardial functional reserves in the experimental occlusion of coronary arteries and hypoxia-reperfusion state.
Key words: experimental myocardial infarction, hypoxia, functional reserve, derivatives of arylalkanes.
М. Д. ПЕРОВА, А. В. ФОМИЧЕВА, В. Б. КАРПЮК
КЛИНИКО-ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ТЯЖЕЛОМ ПАРОДОНТИТЕ
Краснодарский центр пародонтологии и дентальной имплантации, Южно-Российский центр косметологии и пластической хирургии
При хроническом генерализованном развившемся пародонтите, когда потеря опорных тканей зуба составляет 50% и выше, наблюдается дефицит собственного пластического материала с ограничением способности к пролиферации и дифференцировке в клеточные линии, с помощью которых в тканях пародонта может быть достигнут морфофункциональный исход регенерации [1, 2, 5].
Использование методов лечения, основанных на стимуляции потенций оставшихся структур опорного аппарата зуба со значительно редуцированным регионарным кровотоком, например с помощью локальной доставки в зону дефекта рекомбинантных факторов роста, имеет мало убедительных аргументов. Так, было показано, что имплантация геля «Эмдогейн» (США), действие которого связано с присутствием в его составе трансформирующего фактора роста-Р и костного морфогенетического белка-6, способна увеличивать прирост зубодесневого прикрепления только в 3- и 2-стеночных пародонтальных дефектах и в межкорне-вых зонах при легкой и средней степени повреждения тканей пародонта [3].
Наше внимание привлекли исследования в области клеточной биологии, направленные на изучение стволовых и прогениторных клеток, в которых заложены неограниченные терапевтические возможности. Анализ научной литературы показал, что находящиеся в тканях - производных мезенхимы мультипотентные
стромальные клетки взрослого организма могут трансформироваться в остеобласты, хондроциты,эндотелиальные клетки, адипоциты и другие линии in vitro и in vivo [4, 10]. В этой связи представляется перспективной трансплантация дополнительного количества малодифференцированных клеток в зону разрушенных тканей опорного аппарата зуба, который был сформирован в эмбриогенезе из эктомезенхимы.
Цель данного исследования - оценить ближайшие и отдаленные клинические результаты использования мультипотентных стромальных клеток при лечении развившегося пародонтита и гистологически верифицировать полученные данные.
Материалы и методы
Группа исследования (I гр.) представлена 23 пациентами (12 мужчин и 11 женщин в возрасте от 28 до 70 лет) с хроническим развившимся пародонтитом средней и тяжелой степени, которые добровольно согласились на использование в их лечении клеточных технологий на безвозмездной основе.
В целом по группе диагностировано 419 внутрикос-тных пародонтальных дефектов, 449 супраальвеоляр-ных дефектов, 34 фуркационных дефекта II класса и 53 фуркационных дефекта III класса.
Пациентам I группы после хирургической санации пародонтальных дефектов, деминерализации поверх-
ностей поврежденных корней зубов (PrefGel) в область пародонтальных дефектов под биосовместимый мембранный барьер («Экофлон», СПб) трансплантировался аутологичный клеточный материал, полученный ex tempore.
Контрольную группу (II гр.) составили 28 пациентов, идентичных тестируемой группе по полу и возрасту. У этих пациентов применялась традиционная мембранная техника. Пациентам обеих групп в подмембранное пространство дополнительно имплантировался остеокондуктор биоситалл («Биосит-Элкор», СПб).
До лечения (т. е. до проведения инициальной терапии) оценивались индекс налета Loe (1964), десневой индекс Loe & Silness (1963), глубина зондирования, уровень рецессии десневого края, потеря зубодесневого прикрепления, прирост зубодесневого прикрепления [2].
Ближайшие клинические результаты оценивались через 2 месяцев после операции, отдаленные результаты - через 6 месяцев и в сроки 12-18 месяцев. Состояние прироста минерализованных структур определялось с помощью цифрового радиовизиогра-фического комплекса Gendex (Dentsply).
Для приготовления клеточного материала использовали жировую ткань околоколенной области пациента. Выделяли фракцию ядросодержащих (мононуклеар-ных) клеток (по методике Zuk et al., 2001, в собственной модификации), дважды пропускали через нейлоновые фильтры и центрифугировали для очищения от зрелых адипоцитов и тканевого детрита [10]. В клеточный материал добавляли аутологичную сыворотку крови в количестве 5% от общего объема. Свежевыделенную васкулярно-клеточную фракцию без дополнительного культивирования использовали для аутотрансплантации в область глубоких пародонтальных дефектов (заявка на патент 2006116152(017539), приоритет от 10.05.06 г.).
При гистологическом анализе тканей регенерата, взятых после оперативного вмешательства у 9 добровольцев обеих групп через 2-4 месяца (начальный этап заживления тканей пародонта), изучались клеточный состав, особенности и скорость формирования молодой грануляционной ткани. В работе использованы окраски гематоксилином-эозином, толуидиновым синим при рН 1,0 и толуидиновым синим с поверхностным докрашиванием основым фуксином для выявления гликозаминогликанов.
Обработка цифровых данных проведена методами вариационной статистики с использованием парного
t-критерия Стьюдента и программного обеспечения «Биостат» (1999). Различия параметров до и после лечения и в сравнении с контрольной группой расценивали как значимые при р<0,05.
Результаты исследования их обсуждение
В тестируемой группе после лечения отмечено отсутствие воспалительной реакции тканей десны (0,7 балла) в ближайшие сроки наблюдения, даже в контакте с микробным налетом (2,1 балла) и с последующей устойчивой тенденцией к уменьшению показателя десневого индекса в отдаленном периоде (таблица). При этом значения десневого индекса в тестируемой группе оказывались существенно ниже, чем в контроле, несмотря на отсутствие медикаментозной противовоспалительной терапии в периоде подготовки к операции. Наши клинические данные можно рассматривать в качестве одного из подтверждений известного феномена
0 нивелировании иммунопатологических реакций в присутствии стволовых и прогениторных клеток. Полученные нами данные согласуются с недавно опубликованными результатами Di Nicola с соавт. (2002), Plumas с соавт. (2005), Pierdomenico с соавт. (2005), продемонстрировавшими снижение уровня пролиферации активизированных Т-клеток и ограничение хемотаксиса, пролиферации, дифференцировки В-лимфоцитов [7, 8, 9]. В своей работе Beyth с соавт. (2006) показал, что, несмотря на экспрессию ИЛ-1Р, в антиген-представля-ющих клетках снижается уровень провоспалительного ИЛ-12, ФНОа и возрастает экспрессия противовоспалительного цитокина ИЛ-10 [6]. Исследователи высказали предположение, что медиатором этих изменений в ан-тиген-представляющих клетках может служить ТФР-Р, активно секретируемый стволовыми и прогениторными клетками после взаимодействия с микроокружением.
Обращает на себя внимание сокращение времени формирования мягкотканного прикрепления в I группе по сравнению с контролем. Если после применения мембранной техники показатель глубины зондирования постепенно уменьшается, начиная с полутора месяцев после операции, то при аутотрансплантации васкулярно-клеточной фракции этот эффект наступает быстрее. Уже к моменту извлечения мембран глубина зондирования уменьшается вдвое, а через
1 месяц после операции соответствует значениям нормального пародонта, что указывает на формирование уже в эти сроки аппарата прикрепления. При этом объем тканевого регенерата возрастает в тестируемой группе за счет горизонтальной
Индексная оценка до и после лечения в группах сравнения
Индексы До лечения После лечения
2 месяца 6 месяцев 12 месяцев
Индекс налета тест 2,6 ± 1,2 2,1 ± 0,9 1,3 ± 0,4 1,1 ± 0,2 *
Индекс налета контроль 2,4 ± 1,0 2,3 ± 1,0 1,6 ± 0,6 1,4 ± 0,5
Десневой индекс тест 2,8 ± 1,5 0,7 ± 0,4 0,4 ± 0,3 * 0,2 ± 0,1 *
Десневой индекс контроль 2,3 ± 1,1 1,9 ± 1,0 1,2 ± 0,3 0,9 ± 0,2
Примечание: * - значимость различий параметров до и после лечения при Р= 0,01.
мм
9 8 і б б 4
з 2 і о
Рис. 1. Клиническая оценка параметров до и после лечения в группах сравнения
Доля прироста кости альвеолы 3,6 мм
Доля прироста кости альвеолы 1,3 мм
Тест 5,4 мм
Контроль 3,8 мм
б
Рис. 2. Результаты прироста зубодесневого прикрепления в группах сравнения
и вертикальной составляющих, существенно увеличивая ширину альвеолярного гребня. При использовании мембранной техники (контроль) заполнение подмембранного пространства отмечается только при оптимальных характеристиках региональной микроциркуляции и при потере опорных тканей не более 60% от нормы, в то время как в тестируемой группе отмечается выраженный рост тканевого регенерата при тяжелом повреждении пародонта и у курящих пациентов, то есть у лиц с дефицитом собственного пластического клеточного материала и редуцированным кровотоком в тканях пародонта [3]. Уровень рецессии десны в I группе исследования либо снижается, либо не изменяется, в контроле же имеет тенденцию к увеличению (рис. 1). Достигнутые клинические эффекты продемонстрировали, что лечебный подход при тяжелой воспалительной деструкции тканей пародонта, направленный на устранение дефицита клеточных форм, является более эффективным, чем стимуляция резидентных клеток сохраненного опорного аппарата зуба с помощью, например, мембранных барьеров.
Основным показателем эффективности проведенного регенеративного лечения является прирост нового зубодесневого прикрепления, включающего формирование мягкотканной и костной составляющих. В тестируемой группе общий прирост тканей de novo составляет 5,4 мм, в контрольной группе - 3,8 мм (рис. 2).
Существенная разница обнаружена в показателях прироста молодой кости альвеолы в группе исследования и контроле: доля прироста кости в общей структуре зубодесневого прикрепления составляет в I группе 3,6 мм, во II группе - только 1,3 мм. В тестируемой группе произошло увеличение доли костного прикрепления почти в 2 раза - 67% против 34% (в контроле). Однако в единичных случаях мы не наблюдали роста новых костных структур, при том что удавалось достичь формирования мягкотканного прикрепления при снижении глубины зондирования до нормы и сокращении уровня рецессии десневого края. Такой исход рассматривается также как регенеративный, характеризующийся отсутствием остаточного пародонтального кармана - источника возникновения рецидива.
Гистологическая картина тканевого регенерата в тестируемой группе в сроки от 2 до 4 месяцев существенно отличалась от таковой в контроле. Прежде всего отмечается высокая степень васкулогенеза в образцах тестируемой группы: количество капилляров и мелких артериол, по ходу которых располагается большое количество веретеновидных уплощенных клеток с темным ядром и базофильной гомогенной цитоплазмой (по-видимому, адвентициальных), в регенерате увеличено почти в 3 раза по сравнению с гистологической картиной во II группе. Это дает косвенные основания полагать об участии трансплантированных клеток в
ангиогенезе ткани регенерата. В то же время мы не исключаем индуцирующего эффекта ММСК и на резидентные эндотелиальные клетки, что диктует необходимость проведения дополнительных исследований. Нужно отметить также, что активность неоангиогене-за с высокой плотностью мелких сосудов сохраняется почти на одинаковом уровне через 2 и 4 месяца после операции. То есть стромальные клетки, выделенные из жировой ткани пациента и пересаженные в зону па-родонтальных дефектов, довольно долго сохраняют способность поддерживать высокий уровень секреции ростовых факторов для стимуляции ангиогенеза.
В соединительной ткани регенерата после пересадки клеток отмечается мощная фибробластичес-кая реакция с выраженной экспрессией вещества межклеточного матрикса в течение ближайших 4 месяцев. Базофильно окрашенные фибробласты выявляются в гораздо большем количестве в составе молодой соединительной ткани, чем крупные (до 50 |j) отростчатые фибробласты с нерезкими границами и светлым ядром, чаще с двумя ядрышками и слабоба-зофильной цитоплазмой. Проксимальнее сохраненной кости челюстной альвеолы (в глубоких порциях образцов) наблюдается формирование остеобластами межклеточного вещества - остеоидного матрикса на месте конверсирования гранул остеокондуктора биоситалла. Уменьшение числа недифференцированных клеток и увеличение количества зрелых фибробластов происходят во времени и коррелируют со степенью созревания грануляционной ткани: к 4 месяцам юные формы фибробластов практически не выявляются в составе ткани регенерата. Это может указывать на способность малодифференцированных фибробластов к пролиферации, при том что в окраске толуидиновым синим уже в ранние сроки выявляется типичный компонент межклеточного вещества соединительной ткани - гликозаминоглика-ны. Между пучками коллагеновых волокон на фоне сформированной сетки соединительнотканной основы регенерата обнаруживаются мононуклеарные клетки разных размеров (преимущественно малые и средние) с резко базофильной цитоплазмой и светлым ядром, а также макрофаги с небольшим ядром и зернистой цитоплазмой. Ни в одном образце не было отмечено появления плазматических клеток. Гранулоциты или отсутствовали вовсе, или были поодиночке разбросаны в пределах регенерата. Учитывая, что морфологически ММСК идентифицируются как малые лимфоциты, которые располагаются в зоне активной васкуляризации ткани пародонта, образованной de novo, клинически не выявляется воспалительная реакция стромы соединительной ткани после аутотрансплантации клеток. Это позволяет предположить присутствие ММСК в составе регенерата. Косвенным подтверждением эффектов ММСК может являться быстрое и безрубцовое заживление раны после взятия биоптатов в пределах регенерата околозубных тканей.
Кроме того, интерес представляет следующее наблюдение: случайно оставшиеся в составе трансплантированной васкулярно-клеточной фракции адипоциты способны подвергаться регрессивным процессам в пределах микроокружения и превращаться в фиброб-ластоподобные клетки (морфологически напоминающие юные формы фибробласта) с возвращением себе функции синтеза межклеточного вещества соедини-
тельной ткани (идентифицировано в окраске толуиди-новым синим с поверхностным докрашиванием препаратов основным фуксином).
Над поверхностью регенерата формируется пласт эпителия с хорошо развитой системой межклеточных контактов. По всей протяженности срезов прослеживается базальный слой эпителия, состоящий из нескольких рядов клеток, вытянутых перпендикулярно направлению коллагеновых волокон подлежащей соединительной ткани, с выраженной полярностью. Остальные слои эпителия имеют разную степень детерминации, что четко коррелирует с процессом созревания соединительной ткани; в ряде образцов к окончанию срока оценки ближайших результатов микроархитектоника многослойного плоского ороговевающего эпителия полностью восстанавливалась.
Заключение
Проведенное исследование позволило заключить о высоких стимуляторных потенциях трансплантированного клеточного материала, содержащего ММСК. Были отмечены увеличение скорости и улучшение качества заживления значительно поврежденных в результате воспалительно-деструктивного процесса тканей паро-донта при снижении уровня ретракции регенерата во времени. Различия клинических параметров при аутотрансплантации васкулярно-клеточной фракции с данными контрольной группы, в которой искусственно моделировались условия для активизации резидентных клеток-предшественников, признаны значимыми. Важным представляется рост зубодесневого прикрепления и доля в нем сформированной de novo кости челюстной альвеолы, что существенно меняет качество структур опорного аппарата зуба, повышая резистентность к повторным антигенным атакам. Это выражается степенью неоваскуляризации, которая почти втрое превышает ее проявления в контрольной группе, а также длительно сохраняющейся во времени пролиферативной активностью клеток в зоне регенерации тканей пародонта.
Терапевтический эффект трансплантированных мультипотентных стромальных клеток, выделенных из жировой ткани, как подтверждено настоящим исследованием, определяется не только пролиферацией и дифференцировкой клеточных форм, но и регуляторной функцией этих клеток. Анализ клинических данных и результаты гистологической верификации в группах наблюдения показали отсутствие иммунопатологических изменений в регенерате тканей пародонта без проведения предварительной противовоспалительной, антимикробной терапии и иммунокоррекции.
Поступила 11.12.2006
ЛИТЕРАТУРА
1. Кречина Е. К. Нарушения микроциркуляции в тканях пародонта при его заболеваниях и клинико-функциональное обоснование методов их коррекции: Автореф. дис. доктора мед. наук. М., 1996. 36 с.
2. Перова М. Д. Ткани пародонта: норма, патология, пути восстановления. М.: Триада, Лтд., 2005. 312 с.
3. Перова М. Д., Фомичева А. В., Фомичева Е. А., Карпюк В. Б. Оценка роста нового зубодесневого прикрепления после аутотрансплантации стромальных клеток, выделенных из жировой ткани // Пародонтология, 2007 (в печати).
УДК 616. 12 - 008.331.1 + 616-005.4] - 092
4. Перова М. Д., Шубич М. Г., Карпюк В. Б., Фомичева А. В., Мельник Е. А. Возможности мезенхимных стромальных клеток для регенерации тканей пародонта и их взаимодействие с тканевым микроокружением // Морфология, 2007 (в печати).
5. Bartold P. M., Narayanan A. S. Biology of the periodontal connective tissues. Chicago: Quint. Int. 1998. Р. 278.
6. Beyth S., Borovsky Z., Mevorach D. et al. Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness. Blood. 2005. Vol. 105 (5). Р. 2214-2219.
7. Di Nicola M., Carlo-Stella C., Magni M. et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood. 2002. Vol. 99. Р. 3838-3843.
8. Pierdomenico L., Bonsi L., Calvitti M. et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplant. 2005. Vol. 80 (6). Р. 836-842.
9. Plumas J., Chaperot L., Richard M.-J. et al. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T-cells. Leukemia. 2005. Р. 1-8.
10. Zuk P. A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for call-based therapies // Tissue Eng. 2001. V. 7. Р. 211-226.
M. D. PEROVA, A. V. FOMICHEVA, V. B. KARPYUK
CLINICAL AND HYSTOLOGICAL RESULTS OF CELLULAR THERAPY IN SEVERE PERIODONTITIS
The purpose of this study was to evaluate of clinical results for the autotransplantation of multipotent mesenchymal stromal cells, derived from adipose tissue, and histological data verification. The enhancement of the rate periodontal regeneration was documented. This study indicates that the early neovasculogenesis promotes the optimal gain of the mean values clinical attachment level that in control group. The histological findings were demonstrated the active process of the periodontal regeneration without tissue inflammation sings.
Key words: cellular therapy, multipotent
mesenchymal stromal cells, severe periodontitis, clinical attachment level, periodontal regeneration.
Т. Г. ПОКРОВСКАЯ, В. И. КОЧКАРОВ, М. В. ПОКРОВСКИЙ, Е. Б. АРТЮШКОВА, Е. Н. ПАШИН, М. В. КОРОКИН, Л. В. КОРОКИНА, Я. И. ЗАЛОЗНЫХ, Ю. П. КЛЯВС, М. В. БРУСНИК, М. М. КОРНЕЕВ, Е. С. ЧЕРНОМОРЦЕВА, Т. А. ЧУЛЮКОВА, Т. И. ЗЕЛЕНКОВА, И. Н. АХМЕТЗЯНОВА, Н. В. СМЕШКО, В. А. МАЛЫХИН
_ _______
ПРИНЦИПЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ
Кафедра фармакологии, НИИ ЭМ ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава»
Традиционные факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний (артериальная гипертензия, гиперлипиде-мия, инсулинорезистентность, сахарный диабет, курение) сопровождаются нарушением нормальной функции эндотелиальных клеток [3]. Основным механизмом, лежащим в основе эндотелиальной дисфункции (ЭД), является снижение образования и биодоступности N0 при одновременном повышении уровня супероксид аниона и продукции мощных вазоконстрикторов [7]. Таким образом, под эндотелиальной дисфункцией понимают дисбаланс между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелий-зависимых процессов, и в первую очередь нарушение вазорелаксационных свойств эндотелия [9, 22].
Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД являются важной клинико-экспериментальной задачей. Одним из основных факторов, ведущих к ЭД, является снижение стабильности эндотелиальной N0-синтазы (eN0S). Одной из важных точек приложения терапевтического воздействия при ЭД является восстановление дефицита оксида азота (N0) [1]. Однако в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции ЭД. Целью настоящего исследования явился анализ литературных данных о влиянии разных лекарствен-
ных средств на функциональное состояние эндотелия, собственных данных об эндотелиопротективных эффектах нового класса лекарственных средств, позиционируемого как класс эндотелиотропных аддити-вов с рекомендациями к обязательному назначению больным с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Оценка изменений функционального состояния сосудистого русла при моделировании ЭД и артериальной гипертензии проводилась как под влиянием представителей традиционных гипотензивных лекарственных средств (ингибиторов АПФ, блокаторов ангиотензино-вых рецепторов, диуретиков, антагонистов кальция, бета-адреноблокаторов), так и препаратов, влияющих на метаболические процессы (мексикором), антиоксидантами (аскорбиновой кислотой, металлокомплексными соединениями). В основном вышеперечисленные препараты свой позитивный эффект на функцию эндотелия опосредуют через ингибирование деградации N0. Следует отметить, что специфическая прямая стимуляция продукции N0 доказана лишь для аргинина - непосредственного природного субстрата синтеза N0 и бета-блокатора небиволола. Существуют потенциальные корректоры эндотелиальной дисфункции (синтетические донаторы оксида азота - производные ^нитропиразолов, оксимов, диазетидины, гуанидино-
