CC BY
16
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 544.475 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-2-66-77
КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS В ПРИСУТСТВИИ
ТОКСИКАНТОВ
Д.А. Богачихин, М.М. Косаренина, Н.Ю. Юдина
С помощью различных методов линеаризации проведена оценка кинетических параметров биосенсоров, сформированных на основе лактобактерий Lactobacillus acidophilus и медиатора электронного транспорта - ферроцена. Показано, что данные бактерии чувствительны к некоторым органическим токсикантам, что позволяет использовать их в биосенсорных системах для оценки токсичности. Были определены значения полумаксимальных эффективных концентраций для двух модельных токси-кантов:1,2-дихлорэтана и трихлоруксусной кислоты. Проведена оценка влияния токсикантов на кинетические параметры сформированных биосенсоров. Продемонстрировано, что выбранные модельные токсиканты по отношению к бактериям L. acidophilus являются ингибиторами смешанного типа.
Ключевые слова: Lactobacillus acidophilus, биосенсоры, 1,2-дихлорэтан, три-хлоруксусная кислота, ингибирование.
Введение
Бактерии рода Lactobacillus acidophilus впервые описаны в 1900 году Моро [1] в качестве Bacillus acidophilus, которые были выделены из ротовых полостей и желудочно-кишечных трактов различных животных, а также людей. До 1970 года они носили данное название, пока не были классифицированы при помощи классических методов микробиологии двумя учеными - Хансеном и Мокко как Lactobacillus acidophilus [2]. Наибольшее распространение данные микроорганизмы получили в качестве различных заквасок для приготовления молочнокислых продуктов, при этом они могут быть использованы и как индивидуальные микроорганизмов, и как составляющие различных ассоциаций и консорциумов [3-4].
Применение данных микроорганизмов не заканчивается пищевой промышленностью. Их также добавляют в рацион питания в качестве различных пробиотических лекарственных препаратов или пробиотических добавок для улучшения или восстановления собственной микрофлоры кишечника человека после длительного приема лекарств-антибиотиков [5-6].
В последние годы большую популярность данные бактерии нашли в качестве ингибиторов различных патогенных микроорганизмов. В работе [7] уделено внимание тому, что данные микроорганизмы способны ингибировать как грамм-положительные, так и грамм-отрицательные
микроорганизмы, благодаря продуцируемым антимикробным пептидам. Еще одним направлением применения Lactobacillus acidophilus является разработка биосенсоров на их основе [8] для определения фенольных соединений в воде и молочных продуктах. В частности, смоделированные биосенсоры используются для определения содержания катехола.
Биосенсорами в настоящее время называют такие аналитические устройства, в структуру которых тем или иным образом были включены микроорганизмы, их мембранная фракция или ферменты, выделенные из микроорганизмов или клеток других живых организмов. Биосенсоры, реагируя на появление субстрата в измерительной ячейке, преобразуют сигнал (изменение рН, содержания растворенного кислорода, силы тока и т.д.) в удобно фиксируемый различными физико-химическими методами ответ. Главным преимуществом биосенсоров является доступность используемого биоматериала и использование простых культур микроорганизмов [9]. В данной работе были использованы биосенсоры медиаторного типа так как они по сравнению с системами на основе других преобразователей позволяют уменьшить время анализа и исключить влияние кислорода за счет работы с низкими потенциалами [1011]. Снижение рабочего потенциала связано с применением медиаторов электронного транспорта, которые являются искусственными акцепторами электронов.
Несмотря на то, что микроорганизмы Lactobacillus acidophilus получили широкое распространение в различных отраслях биотехнологических производств, до сих пор остается малоизученным фактор влияния на данные микроорганизмы индивидуальных токсикантов и возможность ингибирования их окислительной активности. В связи с этим целью данной работы является оценка кинетических параметров биосенсоров на основе микроорганизмов Lactobacillus acidophilus в присутствии токсикантов.
Материалы и оборудование
Формирование рабочего электрода. Для работы были использованы молочнокислые бактерий Lactobacillus acidophilus, представленный в виде молочнокислой закваски (ООО «В-МИН», Сергиев посад, Россия). Рабочий электрод формировался по следующей методике: пустую пластиковую трубку заполняли пастой, содержащей в своем составе графитовую пудру ("Fluka", Германия), медиатор электронного транспорта ферроцен ("Aldrich", Германия) и минеральное масло ("Fluka", Германия). Поверхность полученного электрода механически зачищалась, после чего на неё наносили 0,001 г сухого препарата микроорганизмов и закрепляли диализной мембраной D9777 (Sigma-Aldrich, США) с помощью пластикового кольца.
Электрохимические измерения окислительной активности.
Электрохимические измерения проводились при помощи потенциостата «CORRTEST» (Wuhan CorrTest Instruments Corp., Вухань, Китай) подключенного к персональному компьютеру. Ответы регистрировали по двухэлектродной схеме (рис. 1), состоящей из рабочего графитово-пастового электрода с иммобилизованными микроорганизмами и хлорсеребряного электрода сравнения. При формировании графитово-пастового электрода использовали медиатор электронного транспорта -ферроцен. Измерения проводились с использованием калий-натрий фосфатного буферного раствора (рН = 6,0) при непрерывном перемешивании (600 об/мин) в ячейке объемом 5 см3.
acidophilus
Рис. 1. Принципиальная схема установки на основе медиаторного биосенсора
Измеряемым параметром, принятым за ответ биосенсора, была амплитуда изменения силы тока (мкА), определявшаяся как разность между конечным и начальным значениями токов до и после добавления исследуемого раствора в измерительную кювету.
Обсуждение результатов
Кинетические параметры сформированных биосенсоров. Для
оценки работоспособности сформированных биосенсоров необходимо иметь значения ряда важных характеристик, таких как кинетические параметры: максимальная скорость реакции Vmax и константа Михаэлиса Км. Для их определения были построены зависимости ответа биосенсора от концентрации субстрата (рис. 2) для двух сформированных по одной методике электродов, которые далее были использованы для оценки изменения кинетических параметров в присутствии токсикантов - 1,2-
дихлорэтана (электрод №1) и трихлоруксусной кислоты (электрод №2). Использование двух идентичных электродов обусловлено необходимостью исключить в ходе дальнейшей работы возможность возникновения суммарного воздействия токсикантов на один биорецепторный элемент.
0,8
0,7 -
о,б-
& 0,5
О о К
<и 0,4 о о к ю
н <и и
О 0,2
0,3 -
0,1
0,0
электрод №1 электрод №2
0,00
0,01 0,02 0,03 0,04
Концентрация глюкозы, моль/л
0,05
Рис. 2. Зависимость ответа биосенсора от концентрации глюкозы
В биорецепторах каталитического типа формирование ответа биосенсора происходит за счет ферментативной реакции. В связи с этим зависимости, приведенные на рис. 2 хорошо апроксимируется уравнением ферментативной кинетики Михаэлиса-Ментен (1) [12].
V
V,
тах
м
(1)
км+ [л]'
где V - скорость ферментативной реакции, - концентрация субстрата,
Vmax - максимальная скорость реакции,
Км - константа Михаэлиса-Ментен, величина равная концентрации субстрата, при которой скорость реакции равняется половине максимальной (V = Vmax/2).
Для определения константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции проведена обработка данных программе SigmaPlot с использованием гиперболической функции. Для электрода № 1
максимальная скорость (Vmax) реакции составила 0,44 ± 0,02 мкА, а константа Михаэлиса (Км) 0,008 ± 0,001 моль/л, для электрода № 2 - Vmax = 0,94 ± 0,04 мкА; Км = 0,023 ± 0,002 моль/л.
Кроме этого для определения констант используют различные методы линеаризации зависимостей скоростей реакции от концентрации субстрата. Одним из таких методов вляется метод «двойных обратных величин» или метод Лайнуивера-Берка, с использованием координат и №.
Исходя из выражения (2) график зависимости в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид прямой, пересекающей ось абсцисс в точке
1/Км И ОСЬ ОрДИНаТ В ТОЧКе 1/Утах.
У Цпах + Цпах (2)
На рис. 3 представлены зависимости ответа биосенсора от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка.
ей И
£
20
40
60
80
100
120
140
1^, л/моль
Рис. 3. График в двойных обратных координатах по методу
Лайнуивера-Берка
Максимальная скорость реакции соответствует обратной величине свободного члена (Ь) линейного уравнения У0 = ax+b, а константа Михаэлиса-Ментен равна произведению тангенса угла наклона прямой (коэффициент «а» в уравнении) и максимальной скорости реакции. Таким образом для электрода №1 Vmax = 0,47 ± 0,03 мкА, ^ = 0,011 ± 0,002 моль/л; для электрода №2 Vmax = 0,94 ± 0,04 мкА, ^ = 0,023 ± 0,001 моль/л.
Так как метод Лайнуивера-Берка применим при малых значениях определяемых параметров (Км и Vmax), часто используется иной метод
6
5
4
3
2
1
0
линеаризации - метод Иди-Хофсти. Уравнение используемое в этом методе выводится из уравнения Михаэлиса-Ментен и имеет следующий вид (3).
При построении графика в координатах Иди-Хофсти (рис. 4) полученная прямая будет пересекаться с осью ординат в точке Vmax, а тангенс угла наклона будет равен -Км.
Рис. 4. График в обратных координатах по методу Иди-Хофсти
Согласно полученным зависимостям, значения Км и Vmax, определенные по методу Иди-Хофсти, составили 0,0051± 0,0007 моль/л и 0,35± 0,02 мкА для электрода №1 и 0,023± 0,002 моль/л и 0,94± 0,03 мкА для электрода №2, соответственно. В табл. 1 представлены кинетические характеристики, полученные тремя различными методами.
Таблица 1
Кинетические параметры сформированных биосенсоров
Метод Утах, 10-2 мкА Км, ммоль/л Я, коэффициент корреляции
Электрод № 1 Электрод №2 Электрод № 1 Электрод № 2 Электрод № 1 Электрод № 2
Обработка гиперболической функцией в программе SigmaPlot 44 ± 2 94 ± 4 8 ± 1 23 ± 2 0,9735 0,9866
Лайнуивер-Берка 47 ± 3 94 ± 4 11 ± 2 23 ± 1 0,9887 0,9937
Иди-Хофсти 35 ± 2 94 ± 3 5,1 ±0,7 23 ± 2 0,9020 0,9559
Исходя из полученных данных можно судить о том, что наиболее подходящим для обработки результатов методом является обработка данных по методу Лайнуивера-Берка, так как для этого метода наблюдаются наибольшие значения коэффициентов корреляции R и минимальные значения погрешности. Разница между результатами для двух идентичных электродов может быть объяснена тем, что используемый коммерческий препарат микроорганизмов представляет собой ацидофильную закваску, содержащую по мимо лиофилизированных микроорганизмов L. acidophilus лактозу, служащую субстратом при использовании данного товара по назначению, указанному производителем. В связи с этим представляется сложным проконтролировать количество нанесенных на поверхность электрода микроорганизмов, что как можно наблюдать может отразиться на ряде характеристик сформированного биорецепторного элемента.
Оценка токсического влияния. Для оценки токсическго влияния на клетки микроорганизмов Lactobacillus acidophilus были выбраны 2 модельных токсинката: 1,2-дихлорэтан и трихлоруксусная кислота. Данные вещества являются опасными для организма человека, так как при попадании внутрь способны нарушать работу различных внутренних органов, в частности печени и почек. Помимо этого 1,2-дихлорэтан является канцерогеном [13].
Для количественной оценки токсического эффекта использовали концентрацию токсиканта, при которой бы достигалось 50% ингибирование окислительной активности микроорганизмов. Данное значение является полумаксимальной эффективной концентрацией ЕС50
(4).
гдеT - индекс токсичности, %;
Rra - ответ биосенсора на добавление глюкозы, мкА;
Rгл+токс — ответ биосенсора на добавление глюкозы в присутствии токсиканта, мкА.
Для определения значения ЕС50 для исследуемых веществ были построены зависимости индекса токсичности Т (%) от концентрации токсиканта в кювете (мг/л). Вид полученных зависимостей представлен на рис. 5.
0 2 4 6
Концентрация токсиканта, мг/л Рис. 5. Графики зависимости индекса токсичности от концентрации
токсиканта
С помощью полученных зависимостей были определены значения полумаксимальной эффективной концентрации ЕС50. В табл. 2 приведены экспериментально определенные значения ЕС50 для 1,2-дихлорэтана и трихлоруксусной кислоты и их сравнение с литературными данными, полученными методами биотестирования на ряске [14] и спектрофотометрическим методом оценки токсичности на микроводорослях [15].
Таблица 2
Результаты определения ЕС50 для модельных токсикантов
Токсикант ЕС50 эксп, мг/л ЕС50 лит, мг/л
1,2-дихлорэтан 5 ± 1 276 / Phaeodactylum tricornutum; Platymonas subcordiformis [14]
ТХУ 4,3 ± 0,4 49,5 - 1702,6 / Lemna gibba; Myriophyllum spp [15]
Из данных, представленных в табл. 2, можно сделать вывод, что выбранные токсиканты обладают низким значением ЕС50, что позволяет использовать их в качестве модельных токсикантов для дальнейшей оценки токсического влияния на кинетические параметры, сформированных биосенсоров, так как полумаксимальная эффективная концентрация достигается при малых, относительно литературных данных,
значениях, что свидетельствует о чувствительности L. acidophilus к данным токсикантам.
Ингибирующее влияние токсикантов. Для выявления типа ингибирования 1,2-дихлорэтана и трихлоруксусной кислоты были построены зависимости ответа биосенсора от концентрации глюкозы в присутствии токсикантов в концентрации, соответствующей ранее определенным ЕС50 (рис. 6).
1«, л/моль 1/8 л/моль
(А) - электрод № 1 (Б) - электрод № 2
Рис. 6. Графики зависимости ответа биосенсора от концентрации глюкозы в присутствии 1,2-дихлорэтана и трихлоруксусной кислоты
Зависимости, представленные на рис. 6, были обработаны по методу Лайнуивера-Берка. Кинетические параметры представлены в табл. 3.
Таблица 3
Кинетические характеристики сформированных биосенсоров в
присутствии токсикантов
Кинетический параметры Vmax, 10-2 мкА Км, ммоль/л
Электрод №1
Без токсиканта 47 ± 3 8 ± 1
В присутствии 5 мг/л 1,2-дихлорэтана 32 ± 2 13,6 ± 0,7
Электрод №2
Без токсиканта 94 ± 4 23 ± 1
В присутствии 4,3 мг/л ТХУ 48 ± 4 26 ± 2
На основании полученных данных можно сделать вывод, что 1,2-дихлорэтан является ингибитором смешанного типа, так как в его присутствии снижается максимальная скорость реакции (Vmax = 0,32 ± 0,02 мкА) и растет константа Михаэлиса (Км = 0,0136 ± 0,0007 моль/л).
В присутствии трихлоруксусной кислоты снижается максимальная скорость реакции (Vmax = 0,48 ± 0,04 мкА), а константа Михаэлиса растет (Км = 0,0259 ± 0,002 моль/л), что свидетельствует о смешанном типе ингибирования.
Смешанное ингибирование сочетает в себе конкурентное и неконкурентное торможение. Ингибитор, присоединяется в активном центре фермента, изменяет сродство фермента к субстрату и, одновременно, каталитическую активность фермента. Важно отметить, что 1,2-дихлорэтан и трихлоруксусная кислота являются обратимыми ингибиторами, так как после их удаления из кюветы активность биоматериала восстанавливается.
Заключение
Тремя методами (метод Лайнуивера-Берка, метод Иди-Хофсти и обработка гиперболической функцией) были определены кинетические параметры биосенсоров на основе Lactobacillus acidophilus и медиатора ферроцена. Для модельных токсикантов 1,2-дихлорэтана и трихлоруксусной кислоты определены значения ЕС50. Полученные значения на порядок ниже, чем для систем описанных ранее. Проведена оценка кинетических параметров биосенсорных систем в присутствии токсикантов различной природы. Показано, что в системе Lactobacillus acidophilus-ферроцен 1,2-дихлорэтан и трихлоруксусная кислота являются ингибиторами смешанного типа и вызывают обратимое ингибирование при кратковременном воздействии. Полученные результаты позволяют применять молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus для формирования биосенсора медиаторного типа для оценки токсичности.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания № FEWG-2021-0013 (Биокаталитические платформы на основе клеток микроорганизмов, субклеточных структур и ферментов в сочетании с наноматериалами).
Список литературы
1. Identification and classification of Lactobacillus acidophilus, L. gasseri and L. johnsonii strains by SDS-PAGE and rRNA-targeted oligonucleotide probe hybridization / Pot B., Hertel C., Ludwig W. [et al]. // Microbiology. 1993. Т. 139. №. 3. P. 513-517.
2. Ozogul F., Yazgan H., Ozogul Y. Lactic Acid Bacteria: Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus. // Elseveir Science 2020. P. 91-95.
3. Vinderola C. G., Reinheimer J. A. Enumeration of Lactobacillus casei in the presence of L. acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria in
fermented dairy products // International dairy journal. 2000. Т. 10. №. 4. P. 271-275.
4. Darukaradhya J., Phillips M., Kailasapathy K. Selective enumeration of Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp., starter lactic acid bacteria and non-starter lactic acid bacteria from Cheddar cheese // International Dairy Journal. 2006. Т. 16. № 5. P. 439-445.
5. Detection and identification of Lactobacillus acidophilus species and its commercial probiotic strains using CRISPR loci-based amplicon analysis / Shin J. H., Chong W.H., Park Y.S. [et al]. // LWT. 2022. Т. 171. P. 114166.
6. Spreadable goat Ricotta cheese added with Lactobacillus acidophilus La-05: Can microencapsulation improve the probiotic survival and the quality parameters? / Lopes L. A. A., Pimentel T.C., Carvalho R. de S. F. [et al]. // Food Chemistry. 2021. Т. 346. P. 128769.
7. Characterization of antimicrobial peptides produced by Lactobacillus acidophilus LA-5 and Bifidobacterium lactis BB-12 and their inhibitory effect against foodborne pathogens / Amiri S., Mokarram R. R., Khiabani M. S. [et al]. // LWT. 2022. Т. 153. P. 112449.
8 A novel biosensor based on lactobacillus acidophilus for determination of phenolic compounds in milk products and wastewater / Sagiroglu A., Paluzar H., Ozcan H.M. [et al]. // Preparative Biochemistry and Biotechnology. 2011. Т. 41. №. 4. P. 321-336.
9. Biosensors / Pacheco J. G., Barosso M.F., Nouws H. P. A. [et al]. // Current developments in biotechnology and bioengineering. Elsevier. 2017. P. 627-648.
10. Дзядевич С. В. Амперометрические биосенсоры. Основные принципы работы и особенности датчиков разных генераций // Биополимеры и клетка. 2002. Т. 18. № 1. С. 19.
11. Azizullah A., Hader D. P. A comparison of commonly used and commercially available bioassays for aquatic ecosystems // Bioassays. Elsevier, 2018. С. 347-368.
12. Юдина Н. Ю., Абрамова Т. Н., Арляпов В. А. Создание биосенсора на основе бактерий, выделенных из активного ила, для экспресс-мониторинга водных сред Wei S. [et al]. // Environmental Toxicology and Pharmacology. 2021. Т. 85. С. 103649.
15. Hanson M. L., Solomon K. R. Haloacetic acids in the aquatic environment. Part I: macrophyte toxicity // Environmental pollution. 2004. Т. 130. № 3. С. 371-383.
Богачихин Даниил Александрович, мл. науч. сотр. лаборатории «Экологической и медицинской биотехнологии», [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Косаренина Мария Михайловна, студент, mari. kosarenina@mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Юдина Наталья Юрьевна, канд. хим. наук, доцент, ст. науч. сотр. лаборатории «Экологической и медицинской биотехнологии», TSUnewIT@gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
MEDIATOR BIOSENSOR FOR TOXICITY ASSESSMENT BASED ON LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS BACTERIA
D.A. Bogachikhin, M.M. Kosarenina, N.Yu. Yudina
Using various linearization methods, the kinetic parameters of biosensors formed on the basis of lactobacilli Lactobacillus acidophilus and ferrocene, an electron transport mediator, were estimated. It has been shown that these bacteria are sensitive to some organic toxicants, which makes it possible to use them in biosensor systems for assessing toxicity. Half maximum effective concentrations were determined for two model toxicants: 1,2-dichloroethane and trichloroacetic acid. The influence of toxicants on the kinetic parameters of the formed biosensors was assessed. It has been demonstrated that the selected model toxicants with respect to L. acidophilus bacteria are inhibitors of the mixed type.
Key words: Lactobacillus acidophilus, biosensors, 1,2-dichloroethane, trichloroace-
tic acid.
Bogachikhin Daniil Alexandrovich, junior research scientist laboratory of "Environmental and Medical Biotechnology", danbogach99@,gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,
Kosarenina Maria Mikhailovna, student, mari.kosarenina@,mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Yudina Natalya Yurievna, candidate of ^emistry science, docent,research associatelaboratory of "Environmental and Medical Biotechnology", TSUnewIT@,gmail.com, Russia, Tula, Tula State University
