Картирование в энхансере En1A Drosophila melanogaster модулей, обеспечивающих активацию транскрипции и дистанционное взаимодействие с промотором Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 575.22:595.773.4

Картирование в энхансере En1A Drosophila melanogaster модулей, обеспечивающих активацию транскрипции и дистанционное взаимодействие с промотором

Л. С. Мельникова*, Е. А. Померанцева, В. В. Молодина, П. Г. Георгиев

Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5

*E-mail: [email protected]

Поступило в редакцию 23.06.2016

Принято к печати 08.11.2016

РЕФЕРАТ Изучена структура нового энхансера En1A из района 1А Х-хромосомы Drosophila melanogaster. В составе En1A картированы элементы, один из которых отвечает за активацию транскрипции, а второй -за специфичное взаимодействие с промотором гена yellow. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения о модульном строении энхансеров, включающих отдельные последовательности, с которыми связываются активаторы транскрипции и особые коммуникаторные элементы, обеспечивающие дистанционные энхансер-промоторные взаимодействия.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Drosophila melanogaster, дистанционные взаимодействия, активация транскрипции, структура энхансеров, ген yellow.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ТФ - транскрипционные факторы; Еп1А (Enhancer 1А) - энхансер из района 1А хромосомы Х; Cm1A (Communicator 1А) - коммуникаторный элемент энхансера Еп1А; TE (tethering element) -регуляторный элемент в составе промотора, обеспечивающий дистанционное энхансер-промоторное взаимодействие.

ВВЕДЕНИЕ

Одна из ключевых особенностей энхансеров - способность специфично активировать транскрипцию гена-мишени, иногда удаленного на расстояния, достигающие десятков и даже сотен тысяч пар нукле-отидов [1]. Однако механизмы поддержания специфичных дистанционных взаимодействий между энхансерами и промоторами остаются почти неизученными. Известно, что в ряде случаев в обеспечении коммуникации между энхансером и промотором участвуют ^ис-регуляторные последовательности, найденные в промоторных областях эукариотических генов [2-4]. Полученные нами ранее данные [5] позволяют предположить, что специфичность некоторых энхансеров обеспечивается присутствием в них сайтов связывания факторов транскрипции (ТФ), отвечающих за активацию транскрипции, и сайтов связывания белков, обеспечивающих стабильное дистанционное взаимодействие между энхансером и промотором.

Цель представленной работы состояла в изучении нового энхансера Еп1А, обнаруженного в ин-

троне неизученного гена CG3777, расположенного на Х-хромосоме.

Показано, что энхансер Еп1А имеет модульное строение. В составе Еп1А мы обнаружили активатор-ный и коммуникаторный элементы. Активаторный элемент способен функционально заменять энхан-серы тела и крыльев гена yellow, т.е. стимулировать транскрипцию в соответствующих кутикулярных структурах. Коммуникаторный элемент необходим для взаимодействия Еп1А с промотором гена yellow и способен обеспечивать дистанционную GAL4-зависимую активацию транскрипции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Все конструкции созданы на основе вектора pCaSpeR3, содержащего ген mini-white. Производный от pCaSpeR3 плазмидный вектор рСД, содержащий делецию гена mini-white, описан ранее [6].

В конструкциях EcoRI-PstI-Y, PstI-PvuII-Y, HindIII-y+s-Y использованы соответствующие ре-стрикционные фрагменты химерного элемента из аллеля y+s. Эти фрагменты были встроены перед

промотором гена yellow в положение -343 п.н. (здесь и далее, в том числе на рисунках, нумерация в локусе yellow исчисляется по отношению к сайту инициации транскрипции гена) по сайту рестрикции KpnI.

При создании конструкции (а1-а2^ использована кДНК гена yellow, не содержащая интрон и энхансер щетинок (pCaSpeR3-Yil). Фрагмент размером 362 п.н. был амплифицирован с геномной ДНК мух линии y+s с помощью прайме-ров a1 (5'-CTTTTTGCATACACATCCAC-3') и a2 (5'-GCTGATGGAAGTTGCAGA-3') и клонирован в вектор на основе плазмиды pBlueScript между двумя loxP-сайтами по EcoRV-сайту (а1-а2/1ох). Затем фрагмент а1-а2/1ох клонировали в вектор pCaSpeR3-Yil по KpnI-сайту в положение -343 п.н. Во всех перечисленных конструкциях была делети-рована регуляторная последовательность гена yellow до -343 п.н. (фрагмент XbaI-Eco47III).

Для получения вектора, не содержащего энхан-серы тела и крыльев гена yellow, фрагмент XbaI-Eco47III, включающий энхансеры тела и крыльев, был удален из вектора рСД, содержащего полную последовательность гена yellow (СД-y (-890)). В конструкциях YG4(Cm1A), eveYG4(Cm1A) и AeveYG4(Cm1A) фрагмент ДНК, содержащий 10 сайтов связывания дрожжевого белка-активатора GAL4 (две копии по пять сайтов связывания из плазмидного вектора pUAST), был встроен в вектор СД-у (-890) на 3'-конец гена yellow по сайту рестрикции SmaI, а фрагмент а1-а2/1ох -по сайту рестрикции SacI. Замена последовательности -68... +130 п.н в промоторе гена yellow на последовательность промотора гена eve и получение предпромоторной делеции -69. -100 п.н. описаны ранее [2].

ДНК конструкций и Р-элемента с дефектными инвертированными повторами P25.7wc, использованного как источник транспозазы, инъецировали в линию yacw1118 на стадии пребластодермального эмбриона. Выживших мух скрещивали с линией yacw1118. Трансгенных мух отбирали на основе фенотипиче-ского проявления экспрессии генов white и yellow. Для дальнейшей работы выбрали линии с единственной копией конструкции в геноме, что было подтверждено с помощью Саузерн-блот-анализа. Детали клонирования последовательностей гена yellow в состав векторов, молекулярные методы исследования, трансформация эмбрионов и получение трансгенных линий дрозофил, фенотипический анализ экспрессии гена yellow в трансгенных линиях, индукция сайт-специфической рекомбинации между сайтами loxP и индукция GAL4-зависимой активации в трансгенных линиях подробно описаны в предыдущих работах [2, 5, 6].

Для индукции экспрессии дрожжевого белка GAL4 использовали линию yw1118; P[w+, tubGAL4]117/ TM3, Sb (Bloomington Center #5138). Для индукции рекомбинации между сайтами loxP использовали линию y ac w1118;Cyo, P[w+,cre]/Sco. Нуклеотидная последовательность гена CG3777, структура и профиль его экспрессии приведены в базе данных FlyBase (http://flybase.org/reports/FBgn0024989.html).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

У Drosophila melanogaster ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур - тела, крыльев и щетинок. Энхансеры, контролирующие экспрессию yellow в кутикуле тела и крыльях, расположены на 5'-конце гена, тогда как энхансер, контролирующий экспрессию в щетинках, находится в интроне [7]. У мух дикого типа тело, крылья и щетинки имеют темную окраску.

В работах по изучению регуляции транскрипции у D. melanogaster в качестве модельной системы часто используется аллель y2. В аллеле y2 между промотором и энхансерами тела и крыльев гена yellow встроился ретротранспозон МДГ4 (gypsy) [8]. В результате находящийся в составе МДГ4 инсулятор Su(Hw) блокирует активацию гена yellow энхансера-ми тела и крыльев. Таким образом, фенотип у2 характеризуется желтой окраской тела и крыльев и одновременно темной окраской щетинок.

Супернестабильный аллель y+s (рис. 1А) получен вследствие индукции Р-М гибридного дисгенеза в линии, содержащей мутацию y2 [9]. Также получены производные аллеля y+s - y2s1 и y2s2, содержащие в предпромоторной области гена yellow дупликации района 1А хромосомы Х [9, 10]. Изучение структуры аллелей y2s1 и y2s2 позволило идентифицировать в составе дуплицированного фрагмента из района 1А регуляторный элемент 1A-RE, который активирует экспрессию yellow на большом расстоянии и является инсулятором, специфичным для гена yellow [10]. В представленной работе мы продолжили детальное изучение структуры аллеля y+s.

Мутация y+s возникла в результате внедрения химерного элемента размером 5.4 т.п.н. в положение -69 п.н. и одновременной делеции последовательности yellow между -146 и -70 п.н. Химерный элемент состоял из Р-элементов размером 1.2 т.п.н., расположенных «хвост к хвосту», и заключенной между ними последовательности длиной 3030 п.н., представляющей собой дупликацию района 1А хромосомы Х, находящегося в геноме дистальнее локуса yellow (рис. 1А) [9]. Эта дупликация включала фрагмент неизученного гена CG3777, который экспрессируется на тех же стадиях развития, что и ген yellow.

Л

дкп

Su(Hw)

дкп

1 т.п.н.

X HR PHR EcoRI-PstI

V R Н X

1 PstI-PvuII

1

al-a2

HindIII-PvuII

EcoRI-PstI

-343 п.н. PstI-PvuII-Y

Щ

white

N/T A 1/20

-343 п.н. HindIII-PvuII-Y

white

A 23/31

-343 п.н.

(al-a2)Y

white

4 0/10

V -343 п.н. V

white

4 0/17

lox lox

Рис. 1. Картирование нового эн-хансера En1A из района 1А хромосомы Х. А - схематичное изображение локуса yellow и структуры аллеля y+s. В гене yellow черными прямоугольниками обозначены экзоны, белым - интрон, кружками - энхансеры крыльев (Кр), тела (Т) и щетинок (Щ). Треугольниками показаны инсерции ретро-транспозона gypsy и химерного элемента. Длинные концевые повторы на концах ретротран-спозона (ДКП) показаны серыми стрелками. Черными стрелками обозначены Р-элементы и направление транскрипции гена yellow. Внутренняя часть химерного элемента, соответствующая последовательности гена CG3777, показана серым прямоугольником. Рестрикционные сайты обозначены символами: R - EcoRI; X - XhoI; P - PstI; H - HindIII; V - PvuII. Белые треугольники - праймеры а1 и а2. Прямоугольники под схемой соответствуют фрагментам химерного элемента в составе трансгенных конструкций.

Б - схематическое изображение трансгенных конструкций, включающих фрагменты химерного элемента. Направление транскрипции генов yellow и white указано стрелками. Концы Р-элемента в составе вектора обозначены черными треугольниками. Белые вертикальные стрелки обозначают сайты связывания Cre-рекомбиназы loxP. N/T - отношение числа линий мух с темной окраской тела и крыльев к общему числу полученных трансгенных линий соответствующего генотипа

Б

Тело и крылья мух, несущих аллель y+s, имеют темную окраску, близкую по интенсивности к окраске мух дикого типа. Следовательно, при перемещении к гену yellow участка из района 1А хромосомы Х экспрессия гена в теле и крыльях активирована, несмотря на то, что соответствующие энхансеры заблокированы инсулятором Su(Hw). При помощи трансгенных конструкций (рис. 1Б) в перемещенной последовательности ДНК нам удалось локализовать энхансер размером 1748 п.н., названный энхансер 1А (Еп1А).

Сначала мы протестировали два рестрикцион-ных фрагмента, которые совместно перекрывают

большую часть дупликации из района 1А: EcoRI-PstI длиной 771 п.н. и PstI-PvuII длиной 1748 п.н. (рис. 1А). В трансгенных конструкциях EcoRI-PstI-Y и PstI-PvuII-Y эти фрагменты находились перед промотором гена yellow в позиции -343 п.н. (рис. 1Б). Обе конструкции не содержали энхансеров тела и крыльев. В линиях, несущих конструкцию EcoRI-PstI-Y, в 19 случаях из 20 мухи имели неокрашенные тело и крылья. В трансгенных линиях PstI-PvuII-Y фенотип мух был близок к фенотипу дикого типа в 23 из 31 полученной линии, что доказывает способность фрагмента размером 1748 п.н. функционально заменять энхансеры тела и крыльев гена yellow.

Трансгенная линия

Пигментация тела/крыльев

5 4 3 2

N/T

-890 п.н.

yellow

YG4(CmlA)

I

^+GAL4 YG4

U+GAL4 -890 п.н.

yellow

GAL4

eveYG4(CmlA) L-+GAL4 eveYG4 L>-+GAL4 -890 п.н.

lox lox

... J J

1 5 1 - 7/7

- - - 7 7

- - - 7 0/7

lox 1ÓX

- 5 5 1 - 5/5

- 5 5

- 5 0/5

GAL4

GAL4

lox lox

6 6

6 0/6

6 6

6 0/6

►(A)^^ yellow — Aeve YG4(Cm 1 A)

L^+GAL4

AeveYG4 ^►+GAL4

Рис. 2. Тестирование коммуникаторных свойств фрагмента Cm1A. Под схемами конструкций представлены результаты фенотипического анализа мух в трансгенных линиях. Обозначения; у - промотор гена yellow; eve - промотор гена even skipped; черный овал -коммуникатор Cm1A. Стрелка внутри овала указывает направление транскрипции. Символ А обозначает делецию последовательности гена yellow от -69 до -100 п.н. (ТЕ). Пигментация тела и крыльев обозначена цифрами от 5 - темная окраска, как в диком типе, до 2 - желтая окраска, соответствующая фенотипу аллеля у2. Количество трансгенных линий каждого фенотипа обозначено цифрами. С помощью стрелок и надписи «+GAL4» обозначены производные, полученные в результате активации GAL4 в трансгенных линиях соответствующего генотипа. N/T - отношение линий, в которых фенотип мух изменился после вырезания фрагмента Cm1A или в результате GAL4-активации, к общему числу полученных трансгенных линий. Прочие обозначения, как на рис. 1

Следовательно, энхансер Еп1А локализован в пределах участка PstI-PvuII.

Для точного картирования Еп1А созданы две генетические конструкции, содержащие отдельные фрагменты PstI-PvuII, встроенные в положение -343 п.н. - HindIII-PvuII-Y и (а1-а2^ (рис. 1Б). Фрагмент HindlII-PvuII длиной 1511 п.н. (рис. 1А) не обладал свойствами энхансера: во всех 10 трансгенных линиях HindIII-PvuII-Y тело и крылья мух имели желтую окраску (рис. 1Б). При биоинформатическом анализе структуры последовательности PstI-PvuII был выделен фрагмент размером 362 п.н., включающий повторяющиеся мотивы, которые, возможно, являются сайтами связывания регуляторных белков. Этот фрагмент ДНК был амплифицирован при помощи ПЦР с использованием праймеров а1 и а2, а затем в составе конструкции (а1-а2^ помещен перед промотором гена yellow (рис. 1Б) Фрагмент а1-а2 окружен сайтами узнавания рекомбиназой Cre (loxP-сайты), позволяющими вырезать исследуемый элемент in vivo [11]. Нужно отметить, что в конструкции (а1-а2^ кДНК гена yellow не содержала энхансер щетинок (рис. 1Б). Мы получили 17 трансгенных линий, несущих данную конструкцию. Несмотря на отсутствие энхансера щетинок, мухи всех линий имели фенотип y2. Вырезание последовательности а1-а2 приводило к исчезновению пигментации щетинок в 12 линиях из 15. Таким образом, в конструкции (а1-а2^ изучаемый фрагмент 362 п.н. взаимодействовал с промотором и стимулировал экспрессию yellow в щетинках, но не был способен функционально заменить энхансеры тела и крыльев.

Полученные результаты позволили предположить, что энхансер Еп1А имеет неоднородную структуру. Одна его часть размером 362 п.н. (а1-а2), получившая название «коммуникаторной» (далее Cm1A), самостоятельно стимулирует экспрессию гена yellow только в щетинках, однако она необходима для стимуляции полноразмерным Еп1А экспрессии yellow в теле и крыльях. Другая часть последовательности PstI-PvuII размером 1386 п.н. способна индуцировать высокий уровень экспрессии yellow в теле и крыльях лишь в комбинации с коммуникаторной частью (рис. 1А,Б). Полноразмерный Еп1А размером 1748 п.н. активирует транскрипцию гена yellow во всех кутикулярных структурах. Возможно, фрагмент 1386 п.н. содержит сайты связывания активаторов транскрипции yellow в теле и крыльях, но их взаимодействие с промотором обеспечивают белки, связывающие последовательность Cm1A.

Для дальнейшего изучения коммуникаторных свойств элемента Cm1A мы использовали модельную систему, основанную на свойствах дрожжевого активатора GAL4. Известно, что в геноме дрозофилы

(-ii8)ccgaatcactaaaacca

ccg aagttggcgcgcgccttcgttttcatttt

с a t /,ц,цс cigiciicgicii egg agaaaaaa

aacttcATATAAacgcggccgacata

ttatggccACcXGTcgttaccgcgcca

ggtccacagaagaggattaaaaaaatat

cacacagccgaaggctagagaagaacc

ccctatagctgaacatatataaacaaatat

a ttttttttta ttgcca a caca ctttgg ctta a g

tgttaagagtgattgtcagcttagagcta

agtgcaATG(+i73)

(-31)

yellow

TATAAA

(+1) CCAGTC

(+29)

GAGG

TATA

(-42) (-31)

GAGCGCA TATAAA

(+1)

CACTC

eve

BRE TATA

iéT

Рис. 3. Промоторные области генов yellow и eve. В верхней части рисунка показана последовательность промоторной области гена yellow. Промотор ТАТА, инициатор транскрипции и сайт начала трансляции обозначены заглавными буквами. 198 п.н., замененные в конструкциях eveYG4(Cm1A) и AeveYG4(Cm1A), обозначены курсивом. Сайт инициации транскрипции указан звездочкой. Возможные последовательности связывания коммуникаторных белков подчеркнуты. Последовательность от -69 до -100 п.н., включающая ТЕ гена yellow, заключена в рамку. Цифры в скобках указывают расстояния относительно сайта инициации транскрипции. Коровые элементы промоторов yellow и eve изображены схематично. Обозначения: стрелки указывают направление транскрипции. ТАТА - TATA-мотив; Inr - инициатор транскрипции; DPE (downstream promoter element) - нижележащий элемент промотора; BRE (TFIIB binding element) - элемент, связывающий транскрипционный фактор TFIIB. Последовательности коровых элементов промоторов обозначены заглавными буквами

этот активатор способен стимулировать промоторы различных генов [2]. Однако GAL4, расположенный на З'-конце изучаемого гена, не способен активировать транскрипцию [12]. В конструкции YG4(Сm1А) сайты связывания белка GAL4 и окруженный ЪтР-сайтами потенциальный коммуникатор Ст1А были встроены на З'-конец гена yellow. При этом 5'-после-довательность yellow, содержащая энхансеры тела и крыльев (до -890 п.н.), была делетирована (рис. 2). В семи трансгенных линиях, несущих конструкцию YG4(Сm1А), мухи имели фенотип у2. Таким образом, в отсутствие GAL4-активации фрагмент Ст1А не способен самостоятельно активировать

транскрипцию гена yellow в теле и крыльях. Затем мы скрестили трансгенные линии YG4(Сm1А) с линией, экспрессирующей белок GAL4. В результате GAL4-активации тело и крылья мух во всех линиях приобрели более темную окраску (рис. 2). Делеция Ст1А приводила к снижению экспрессии yellow до исходного уровня. Следовательно, элемент Ст1А действительно обладает свойствами коммуникатора. В составе конструкции YG4(Сm1А) он обеспечивает стабильное дистанционное взаимодействие между GAL4-активатором и промотором гена yellow.

Ранее в промоторной области гена yellow в положении -69... -100 п.н. нами был локализован TE, обеспечивающий дистанционные взаимодействия эн-хансеров тела и крыльев с промотором гена yellow, а также с гетерологичным промотором гена eve [2]. Мы предположили, что коммуникатор Ст1А функционально взаимодействует именно с TE гена yellow. Для проверки этого предположения были созданы конструкции eveYG4(Сm1А) и AeveYG4^m1 А) (рис. 2). В обеих конструкциях промотор гена yellow был заменен на гетерологичный промотор гена eve (-68. +130 п.н.) (рис. 3). Кроме того, в конструкции AeveYG4(Сm1А) последовательность ТЕ гена yellow была делетирована (рис. 2, 3). Результаты, полученные при фенотипическом анализе пяти трансгенных линий eveYG4(Сm1А), были аналогичны результатам анализа линий YG4(Сm1А). Как и в предыдущем случае, коммуникатор обеспечивал GAL4-зависимую активацию транскрипции гена yellow. Поскольку структура промоторов yellow и eve различна (рис. 3), можно утверждать, что коровые элементы промотора не участвуют в функциональном взаимодействии с Ст1А. В шести трансгенных линиях, несущих конструкцию AeveYG4(Сm1А), активация GAL4 не приводила к изменению исходного фенотипа у2 (рис. 2). Следовательно, в отсутствие TE гена yellow коммуникатор Ст1А не способен поддерживать дистанционное взаимодействие между активатором транскрипции и промотором гена. Вероятно, белки, связывающие коммуникаторный элемент Ст1А, способны взаимодействовать с белками, которые привлекаются на TE гена yellow. В описанной модельной системе такое взаимодействие пространственно сближает GAL4-активатор и промотор, что делает возможным контакт между активацион-ным комплексом, собирающимся на последовательностях GAL4, и транскрипционным комплексом промотора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные данные позволяют заключить, что новый энхансер Еп1А имеет модульное строение. В предыдущей работе мы доказали, что регулятор-

ная система гена white также включает элементы, не влияющие на транскрипцию, но обеспечивающие дистанционное энхансер-промоторное взаимодействие. В предпромоторной области и в составе энхан-сера глаз гена white присутствуют сайты связывания белка Zeste. Белок Zeste не участвует в активации транскрипции, но, связываясь со своими сайтами, позволяет энхансеру глаз активировать находящийся на значительном расстоянии промотор [5]. Результаты данной работы свидетельствуют в пользу предположения, что регуляторные области различных генов имеют модульное строение и включают в свой состав активаторные элементы, с которыми связываются транскрипционные факторы, инициирующие и поддерживающие эффективную транс-

крипцию, и элементы-коммуникаторы, с которыми связываются белки, обеспечивающие пространственное сближение энхансера и промотора. Описанные модельные системы могут использоваться для изучения структуры энхансеров и выявления последовательностей, участвующих в дистанционных взаимодействиях между регуляторными элементами генома.

Коллектив авторов благодарит Е.К. Корягину за техническое участие в работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 14-14-01067).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Erokhin M., Vassetzky Y., Georgiev P., Chetverina D. // Cell Mol. Life Sci. 2015. V. 72. № 12. P. 2361-2375.

2. Melnikova L., Kostuchenko M., Silicheva M., Georgiev P. // Chromosoma. 2008. V. 117. № 2. P. 137-145.

3. Calhoun V.C., Levine M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 17. P. 9878-9883.

4. Calhoun V.C., Stathopoulos A., Levine M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 26. P. 9243-9247.

5. Kostyuchenko M., Savitskaya E., Koryagina E., Melnikova L., Karakozova M., Georgiev P. // Chromosoma. 2009. V. 118. № 5. P. 665-674.

6. Savitskaya E., Melnikova L., Kostuchenko M., Kravchenko E., Pomerantseva E., Boikova T., Chetverina D., Parshikov A., Zobacheva P., Gracheva E., et al. // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 3. P. 754-761.

7. Geyer PK., Corces V.G. // Genes Dev. 1987. V. 1. № 9. P. 9961004.

8. Geyer P.K., Spana C., Corces V.G. // EMBO J. 1986. V. 5. № 10. P. 2657-2662.

9. Georgiev P., Tikhomirova T., Yelagin V., Belenkaya

T., Gracheva E., Parshikov A., Evgen'ev M.B., Samarina O.P., Corces V.G. // Genetics. 1997. V. 146. № 2. P. 583-594.

10. Pomerantseva E., Biryukova I., Silicheva R., Savitskaya E., Golovnin A., Georgiev P. // Genetics. 2006. V. 172. № 4. P. 2283-2291.

11. Siegal M.L., Hartl D.L. // Methods Mol. Biol. 2000. V. 136. P. 487-495.

12. Erokhin M., Davydova A., Kyrchanova O., Parshikov A., Georgiev P., Chetverina D. // Development. 2011. V. 138. № 18. P. 4097-4106.