CC BY
0
© Коллектив авторов, 2024
Львов В.Л.1, Вернер И.К.1, Гущин В.А.2, Васина Д.В.2, Антонова Н.П.2, Григорьев И.В.2
Капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae, свободные от примеси С-полисахарида
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Для создания новых конъюгированных вакцин против Streptococcus pneumoniae необходимы капсульные полисахариды (КПС), свободные от примеси общего полисахаридного антигена пневмококков (ОПАП), поэтому изучение особенностей структуры КПС и разработка новых методов их выделения и очистки представляется важной проблемой.
Цель исследования - разработка нового метода выделения и очистки модифицированных КПС S. pneumoniae с остатком 2,5-ангидроманнозы на восстанавливающем конце (м-КПС), а также сравнительный анализ КПС и м-КПС с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и спектральных методов, изучение иммуногенности м-КПС в модели на животных и сопоставление кросс-реактивности сывороток к КПС и м-КПС.
Материал и методы. КПС S. pneumoniae выделяли из надклеточной жидкости с помощью ультрафильтрации и очищали обработкой нуклеазами и протеиназой К; м-КПС получали в результате реакции дезаминирования КПС. Строение полученных субстанций изучали с помощью ВЭЖХ и спектроскопии 1Н-ядерного магнитного резонанса. Иммуногенность полученных препаратов оценивали по продукции специфических IgM- и IgG-антител у мышей в ответ на иммунизацию м-КПС.
Результаты. Получены очищенные от примеси ОПАП иммунологически активные препараты м-КПС S. pneumoniae с альдегидной группой на восстанавливающем конце, что позволяет использовать м-КПС для синтеза вакцинных м-КПС-содержащих конъюгатов.
Заключение. Разработанный метод получения очищенных от примеси ОПАП м-КПС S. pneumoniae позволяет получить физико-химически охарактеризованные и иммуноло-гически активные препараты, что может привести к созданию новых пневмококковых вакцин, обладающих высокими иммунологическими характеристиками.
Ключевые слова: Streptococcus pneumoniae; капсульные полисахариды; общий полисахаридный антиген пневмококков; пептидогликан клеточной стенки бактерий; конъюгат; вакцина
Статья получена 09.09.2024. Принята в печать 23.10.2024.
Для цитирования: Львов В.Л., Вернер И.К., Гущин В.А., Васина Д.В., Антонова Н.П., Григорьев И.В. Способ получения капсульных полисахаридов Streptococcus pneumoniae вакцинного качества, свободных от примеси С-полисахарида. Иммунология. 2024; 45 (6): 766-776. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-766-776
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Львов В. Л.; выделение, очистка, дезаминирование, получение и интерпретация данных ВЭЖХ и анализ спектров ЯМР - Львов В.Л., Вернер И.К.; изучение иммуногенности полученных препаратов - Васина Д.В., Антонова Н.П., Григорьев И.В.; написание статьи - Львов В.Л. Все авторы участвовали в редактировании статьи и одобрили ее окончательный вариант.
Для корреспонденции
Львов Вячеслав Леонидович -кандидат химических наук, заведующий лабораторией препаративной биохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0609-8331
Lvov V.L.1, Verner I.K.1, Gushchin V.A.2, Vasina D.V.2, Antonova N.P.2 Grigorev I.V.2
Method for obtaining Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides of vaccine quality, free from C-polysaccharide impurities
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. To develop new conjugate vaccines against Streptococcus pneumoniae, capsular polysaccharides (CPS) free from the impurity of common pneumococcal polysaccharide antigen (CPPA) are required, so studying of structural features of CPS and design of new methods for their isolation and purification seems to be an important problem.
Aim - development of a new method for the isolation and purification of modified S. pneumoniae CPSs with a 2.5-anhydromannose residue at the reducing end (m-CPSs), as well as a comparative analysis of CPS and m-CPS using HPLC and spectral methods, a study of the immunogenicity of m-CPS in an animal model and a comparison of the cross-reactivity of sera to CPS and m-CPS.
Material and methods. S. pneumoniae CPSs were isolated from the supracellular fluid (SC) using ultrafiltration and purified by treatment with nucleases and proteinase K. m-CPSs were obtained as a result of the CPS deamination reaction. The structure of the obtained substances was studied using high performance chromatography (HPLC) and 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). The immunogenicity of the resulting preparations was assessed by the production of specific antibodies of the IgM and IgG classes in mice as a response to immunization with m-CPS.
Results. Immunologically active, purified from OPAP impurities S. pneumoniae m-CPS with an aldehyde group at the reducing end were obtained. This allows to use m-CPS for the synthesis of m-CPS-containing vaccine conjugates.
Conclusion. The developed method for obtaining S. pneumoniae m-CPS purified from OPAP impurities makes it possible to obtain physico-chemically characterized and immunologically active preparations, which can lead to the creation of new pneumococcal vaccines with high immunological characteristics.
Keywords: Streptococcus pneumonia; capsular polysaccharides; common pneumococcal polysaccharide antigen; bacterial cell wall peptidoglycan; conjugate; vaccine
Received 09.09.2024. Accepted 23.10.2024.
For citation: Lvov V.L., Verner I.K., Gushchin V.A., Vasina D.V., Antonova N.P., Grigorev I.V. Method for obtaining Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides of vaccine quality, free from C-polysaccharide impurities. Immunologiya. 2024; 45 (6): 766-76. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-766-776 (in Russian)
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Concept and design of the study - Lvov V.L.; isolation, purification, deamination, obtaining and interpreting HPLC data and analysis of NMR spectra - Lvov V.L., Verner I.K.; immunogenicity study of resulting substances - Vasina D.V., Antonova N.P., Grigoriev I.V.; writing the article - Lvov V.L. All authors contributed to the editing of the article and approved the final version.
For correspondence
Viacheslav L. Lvov - PhD, Head of Preparative Biochemistry Laboratory, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0609-8331
Введение
Одним из главных возбудителей инфекционных вспышек пневмонии, менингита и безочаговой бактериемии является грам-положительный микроорганизм Streptococcus pneumoniae. Для него характерны высокая контагиозность и бессимптомное носительство, причем нескольких серотипов одновременно [1, 2]. В настоящее время в целях вакцинопрофилактики и иммунотерапии большое внимание уделяется разработке и использованию различных иммунотропных препаратов [3-5]. Так, наиболее эффективным средством для противодействия распространению S. pneumoniae является вакцинопрофилактика, так как многие циркулирующие и вновь появляющиеся штаммы обладают устойчивостью к антибиотикам.
В качестве непременных компонентов антипневмококковых вакцин используются чрезвычайно различающиеся по химической структуре капсульные полисахариды (КПС) S. pneumoniae [6]. Вакцинопрофилактику взрослого контингента обычно проводят с использованием поливалентных препаратов, в частности PNEUMOVAX 23 (Merck Sharp & Dohme, США), но для детей и пожилых людей вакцины такого типа малоэффективны.
Для применения в клинической практике (все возрастные когорты) разрешены поливалентные конъю-гированные полисахарид-белковые поливалентные вакцины PCV13, PCV15, PCV20. Несмотря на ряд несомненных достоинств, эти препараты не лишены
768
Методы
некоторых существенных недостатков. Так, в силу невысокой иммуногенности конъюгированных полисахарид-белковых вакцин в препарате необходимо присутствие адъювантов, чаще всего производных гидроокиси алюминия, которые, по данным последних исследований, обладают рядом нежелательных характеристик [7].
Наряду с КПС на внешней поверхности бактерий S. pneumoniae локализованы полимерные молекулы углеводной природы общего полисахаридного антигена пневмококков (ОПАП), структура которых одинакова для S. pneumoniae всех серотипов [8]. До последнего времени, несмотря на использования различных методов очистки, добиться полного удаления ОПАП не удается [8]. В этой связи разработка методов выделения и очистки КПС S. pneumoniae от примеси ОПАП является важной задачей при создании полисахарид-содер-жащих вакцинных препаратов на их основе.
Материал и методы
Культивирование S. pneumoniae. Клинические изо-ляты бактериальных штаммов S. pneumoniae 23 различных эпидемически значимых серотипов (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15F, 18C, 19F, 19A, 22F, 23A, 23F, 33F) были получены из коллекции ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России.
Культивирование штаммов проводили методом глубинного культивирования по известной методике [9] в 10-литровом ферментере при температуре 37 °С с использованием питательной среды, содержащей дрожжевой экстракт (ультрафильтрат) (HiMedia Laboratories, Индия) и декстрозу (25 г/л) (HiMedia Laboratories, Индия).
Культивирование продолжалось 8-26 ч в зависимости от серотипа S. pneumoniae при контроле рН 6,0-7,2 добавлением 1 N раствора NaOH. Процесс завершался при оптической плотности 2,5-3,5 (измерение при 660 нм) и прекращении поглощения декстрозы, о чем свидетельствовала неизменность величины рН в течение 20-30 мин. Немедленно в ферментер прибавляли 90 % водный раствор фенола до концентрации 1 % и перемешивание продолжали 12-14 ч при комнатной температуре.
Выделение неочищенных КПС S. pneumoniae.
Суспензию бактериальных клеток подвергали тангенциальной микрофильтрации с использованием мембраны 0,22 мкм («Владисарт», Россия). Фильтрат для удаления компонентов питательной среды и низкомолекулярных продуктов, образующихся в процессе культивирования, подвергали концентрированию и далее диа-фильтрации [0,2 М раствор NaCl (HiMedia Laboratories, Индия), затем (здесь и далее) деионизованная вода] с использованием мембраны с пределом отсечения 100 кДа. После концентрирования и лиофилизации получали неочищенный КПС с выходом 20-110 мг/л в зависимости от серотипа S. pneumoniae.
Получение очищенного КПС S. pneumoniae. К раствору неочищенного КПС в 0,2 М растворе NaCl (10 мг/мл, рН 7,2-7,4) добавляли рибонуклеазу
(30-100 мкг/мл) (HiMedia Laboratories, Индия) и дезок-сирибонуклеазу (10-50 мкг/мл) (HiMedia Laboratories, Индия), через 1-2 ч перемешивания при температуре 37 °С рН смеси доводили до 8,0, добавляли протеи-назу К (10-50 мкг/мл) (HiMedia Laboratories, Индия) и продолжали перемешивание 16-18 ч при температуре 56 °С. Реакционную смесь подвергали диафиль-трации (вода) с использованием мембраны с пределом отсечения 100 кДа. После концентрирования и лиофи-лизации получали КПС S. pneumoniae, содержащий не более 1-2 % примеси нуклеиновых кислот и белков. Содержание ОПАП в каждом выделенном КПС (от 5 до 15 %) было определено на основании сопоставления интегральных интенсивностей в спектре 1Н-ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 'Н-ЯМР сигнала холина, принадлежащего ОПАП, и сигнала одной из групп, характерных для КПС каждого серотипа (О- или N-аце-тат, пируват). 'Н-ЯМР спектроскопия была проведена в растворе 99,9 % D2O (Solvex-D, Россия) при 323 К на спектрометре Bruker DRX-500 (Brucker, США).
Дезаминирование очищенного КПС S. pneumoniae (получение м-КПС). К раствору 20 мг КПС в 1 мл воды добавляли 1,5 мл 33,3 % водного раствора уксусной кислоты (Aldosa, Россия) и 1,5 мл 5 % водного раствора нитрита натрия (Chemtrade Chemicals US, США), через 60 мин перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли 10 мл воды, нейтрализовали NaHCO3 (HiMedia Laboratories, Индия), диа-лизовали против воды, диализат лиофилизовали, раствор сухого остатка в воде центрифугировали 60 мин при 20 000 об/мин, супернатант лиофилизовали. Выход м-КПС составлял 11-17 мг в зависимости от серотипа S. pneumoniae.
Получение м-КПС с помощью дезаминирования клеток S. pneumoniae. Клеточную массу, полученную в результате отделения надклеточной жидкости (НЖ), трижды промывали 0,2 M раствором NaCl и далее водой. 10 г влажной бактериальной массы суспендировали в 50 мл воды, к перемешиваемой суспензии добавляли 75 мл разбавленной уксусной кислоты (в соотношении СН3СООН : Н2О 1 : 3) и 75 мл 5 % водного раствора нитрита натрия (NaNO2) (HiMedia Laboratories, Индия). Через 1 ч перемешивания суспензию центрифугировали, супернатант нейтрализовали бикарбонатом натрия и после диафильтрации против воды и лиофилизации получили очищенный м-КПС. Выход м-КПС составлял 40-90 мг в зависимости от серотипа S. pneumoniae.
Методы химического и физического анализа. Содержание белков и нуклеиновых кислот в образцах КПС и м-КПС определяли по методам Бредфорд [10] и Спирина [11] соответственно.
ВЭЖХ проводили c использованием хроматографа «Agilent Technology 1260 Infinity» (Agilent, США) с рефрактометрическим детектором на колонках «TSK-gel G3000PWxl» (7,8 мм I.D. х 30 см) (Tosoh Bioscience, Япония), и G5000PWxl (7,8 мм I.D. х 30 см) (Tosoh Bioscience, Япония), элюирование 0,2 М NaCl со скоростью 0,5 мл/мин.
Схема иммунизации лабораторных животных
№ Группы Препарат Доза Количество мышей Кратность введения Забор образцов
1 Фосфатно-солевой буфер (PBS) (контроль) - 6 0, 14, 28-й день До вакцинации, 14-й и 35-й день
2 Исследуемый препарат м-КПС серотипа 6B 0,5 мкг/жив 7
3 Исследуемый препарат м-КПС серотипа 6B 5 мкг/жив 7
Съемку спектров 'Н-ЯМР проводили на спектрометре Bruker DRX-500 при 323 К. Образцы КПС и м-КПС растворяли в D2O (99,95 %)
Иммунизация животных м-КПС S. pneumoniae, серотип 6B. Мышей линии C57BL/6 (5-6 нед, поставщик ФГБУН «НЦ биомедицинских технологий ФМБА России», филиал «Столбовая»), подкожно 3-кратно иммунизировали с 2-недельным перерывом между введениями (дни 0, 14, 28). Масса животных к началу введения составляла 18-20 г. Препарат м-КПС серотипа 6B вводили в двух дозах - 0,5 и 5 мкг/животное.
В исследование были отобраны животные без признаков отклонений в состоянии здоровья (после клинического осмотра и карантина) с учетом массы тела: разброс массы тела между животными, отобранными в группы, не превышал 10 %, среднее значение массы тела статистически не различалось между группами. Животных распределяли по группам случайным образом. Дизайн эксперимента приведен в таблице.
Перед первой иммунизацией (0-й день), перед второй иммунизацией (14-й день) и через неделю после третьей иммунизации (35-й день) проводили забор образцов крови с последующим получением сывороток.
Этические нормы при работе с животными. Все протоколы исследований с использованием животных и процедуры при исследованиях проводили в соответствии с действующими правилами содержания и использования лабораторных животных, они одобрены этическим комитетом ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (заключение ЛЭК № 50 от 23 июня 2023 г.).
Оценка уровня продукции специфических IgG и IgM методом непрямого неконкурентного имму-ноферментного анализа (ИФА). Предварительно проводили сорбцию антигена м-КПС серотипа 6B (100 мкл/лунку, 4 мкг/мл) на планшет «Medium binding Ref 655001» (Greiner, Германия) в течение ночи при 4 °С. Сыворотку крови мышей разводили ИФА-буфером S011 («Хема», Россия) в соотношении 1 : 100, добавляли в лунки, инкубировали и отмывали. Для детекции специфических IgG и IgM использовали соответственно конъюгат с пероксидазой хрена поликлональных антител козы к IgG мыши (HyTest, Финляндия) в разведении 1 : 25 000 и конъюгат с пероксидазой хрена поликлональ-ных антител козы к IgM мыши 100X (Alpha Diagnostic H-MsM.211(Alpha Diagnostic International, США). Определение проводили в соответствии с инструкцией производителя.
Анализ кросс-реактивности сывороток к КПС и м-КПС S. pneumoniae. Образцы сыворотки крови
животных, полученные на 35-ый день после первой иммунизации, исследовали методом непрямого неконкурентного ИФА по протоколу ВОЗ (http://www. vaccine.uab.edu/). В лунки ИФА-планшетов (Greiner MED BINDING, Ref 655001) вносили по 5 мкг КПС или 0,5 мкг м-КПС и сорбировали планшеты 5 ч при 37 °С, а затем ночь в холодильнике. Перед использованием планшеты трижды отмывали PBS c 0,1 % Твин-20 (Agdia, США).
Сыворотку крови мышей, иммунизированных м-КПС в дозах 0,5 и 5 мкг/животное, разводили 1 : 100 в ИФА-буфере S011 и вносили в лунки по 100 мкл. Планшеты с образцами инкубировали в термошейкере в течение 1 ч при 37 °С и перемешивании со скоростью 600 об/мин. После окончания инкубации лунки трижды отмывали от несвязавшихся антител, внося в них по 300 мкл PBS с 0,1 % Твин-20, после чего инкубировали с поликлональными антивидовыми антителами козы к IgG мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена, в разведении 1 : 25 000. Затем планшеты отмывали 6 раз и визуализировали реакцию, внося в лунки по 100 мкл субстратного буфера с тетраметилбензидином (Имтек, Россия). Через 15 мин реакцию останавливали 10 % раствором HCl (Aldosa, Россия) и на планшетном спектрофотометре «SpectrostarNano» (BMG Labtech, США) измеряли в лунках оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм.
Оценка бактериостатической активности сыворотки крови животных после иммунизации. Бак-териостатический эффект оценивали по способности сыворотки крови животных ингибировать рост бактериальной культуры исследуемого штамма (S. pneumoniae серотипа 6В) при инкубации в течение 20 ч. Для этого штамм выращивали на питательной среде [триптон-соевый бульон (TSB) (HiMedia Laboratories, Индия)] с добавлением 5 % крови крупного рогатого скота (КРС) (Дезнет, Россия) в течение 18-24 ч при 37 °С.
Колонии ресуспендировали в стерильном фос-фатно-солевом буфере до достижения мутности 0,5 по стандарту МакФарланда. Далее культуру разбавляли в 100 раз средой TSB + 5 % кровь КРС и вносили (50 мкл) в лунки 96-луночного планшета, содержащие 50 мкл исследуемой сыворотки. В качестве контролей использовали смесь бактериальной суспензии и среды (контроль роста) и питательную среду (контроль стерильности). После инкубации полученных смесей при 37 °С в течение 20 ч содержимое лунок хорошо перемешивали и измеряли ОП при длине волны 600 нм (ОП600).
OR
LacO
OH
OR
O LacO
NHAc
NH
MurHAc GlcN
Повторяющееся звено полимерной цепи ПГ
HNO,
OH
HO LacO
NHAc
MurHAc
oh;
OH
2,5-anhydro-Man
Рис. 1. Схема расщепления полимерной цепи пептидогликана (ПГ) с образованием м-КПС
R - остаток КПС; Ас - ацетил; MurNAc - остаток N-ацетил-В-мурамовой кислоты; GlcN - остаток D-глюкозамина; 2,5-anhydro-Man - остаток 2,5-ангидро^-маннозы; Lac - остаток молочной кислоты (лактил, -CH(CH3)COOH); n - количество повторяющихся звеньев в ПГ.
Статистический анализ и визуализация данных.
Данные обрабатывали в программе GraphPad Prism 9.5.0 (GraphPad, США). Количество животных в группах приведено в разделе, посвященном иммунизации животных. При постановке ИФА и оценке бактерио-статической активности использовали по 2 технических повтора для каждого образца сыворотки. На графиках результаты представлены диаграммами размаха: линии - медианы; ящики - интерквартильный диапазон; усы - min-max. Статистическая значимость изменений величины оптической плотности рассчитана с использованием дисперсионного анализа (значимыми считались p < 0,05).
Результаты
В ходе работы были получены КПС 23 различных эпидемически значимых серотипов (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15F, 18C, 19F, 19A, 22F, 23A, 23F, 33F), содержащие от 5 до 15 % ОПАП. Очистка от примеси ОПАП была проведена по методике, предложенной в недавнем исследовании [12]. Остаток 4-амино-2,4,6-тридезоксигалактозы, входящий в состав ОПАП, как показано авторами исследования,
разрушается в результате действия азотистои кислоты (NaNO2 + CH3COOH), что приводит к деполимеризации ОПАП. Нами было предположено, что наряду с этим процессом в результате дезаминирования должно протекать разрушение связи полимерной цепи КПС и остатка N-дезацетилированного D-глюкозамина, который, как было недавно показано [13], входит в состав пептидогликана клеточной стенки (ПГ) S. pneumoniae. Известно, что дезаминирование D-глюкозамина приводит к перегруппировке шестичленного цикла моносахарида с образованием 2,5-ангидроманнозы [14]. Если остаток D-глюкозамина находится внутри поли-сахаридной цепи, перегруппировка с сужением цикла сопровождается разрывом этой полисахаридной цепи с образованием олигосахаридов с остатком 2,5-ангид-ропроизводного на восстанавливающем конце. Так как полимерная цепь КПС присоединяется к D-глюкозамину из ПГ, в результате его дезаминирования должен образовываться м-КПС, на восстанавливающем конце которого локализован остаток 2,5-ангидро-Э-маннозы, несущий в положении 4 остаток N-ацетил-Э-мурамовой кислоты, а в положении 6 - остаток КПС (рис.1).
Полученные в результате дезаминирования м-КПС, по данным 'Н-ЯМР-спектроскопии, содержали не более
OR
HO LacO
NHAc
CH2NHNHCO(CH2)4CONHNH2
э
1H
4H
4H
5 5 5 0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 мм
Рис. 2. Структура (А) и спектр 1Н-ЯМР (Б) производного м-КПС S. pneumoniae серотипа 6А с Н2МЫНСО(СН2)4СО!ЫНЫН-группой на восстанавливающем конце
O
O
n
0,8 -,
0,6 -
д' 0,4
О
0,2 -
0,0
IgG
э
□ PBS
□ м-КПС, 0,5 мкг I м-КПС, 5 мкг
p = 0,0230
0 день 14 день 35 день
Время наблюдения, дни после первой иммунизации
0,8 -|
0,6 -
П40,4 О
0,2 -
IgM
□ PBS
□ м-КПС, 0,5 мкг I м-КПС, 5 мкг
p = 0,0012
p = 0,0207
5
p < 0,0001
p < 0,0001
0,0
14 день 35 день
Время наблюдения, дни после первой иммунизации
Рис. 3. Изменение уровней специфических и к м-КПС в сыворотке крови мышей в результате иммунизации (анализ достоверности различий методом многофакторного дисперсионного анализа)
1-2 % ОПАП. Учитывая, что значительная часть КПС остается связанной с ПГ на поверхности бактериальных клеток, дополнительное количество м-КПС, свободного от примеси ОПАП, было получено из бактериальных клеток также с помощью реакции дезаминирования. Молекулярные массы м-КПС, полученные обоими способами, совпадали по данным ВЭЖХ. Подтверждение подлинности всех полученных м-КПС (как из надкле-точной жидкости, так и из соответствующих бактериальных клеток) следовало из данных 'Н-ЯМР-спектро-скопии.
Идентифицировать в м-КПС терминальный ди-сахаридный фрагмент с 2,5-ангидро-Э-маннозой с помощью физико-химических методов не представлялось возможным в силу их высокой молекулярной массы. Лишь в случае низкомолекулярного (по данным ВЭЖХ) м-КПС S. pneumoniae серотипа 6А удалось идентифицировать альдегидную группу остатка 2,5-ангидро-Э-маннозы и определить ее количественное содержание.
Прямое доказательство наличия на восстанавливающем конце м-КПС серотипа 6А альдегидной группы было получено с помощью анализа 'Н-ЯМР-спектра гидразидного производного, полученного взаимодействием м-КПС серотипа 6А с избытком адипинди-гидразида, в условиях реакции восстановительного аминирования. После очистки с помощью гель-хроматографии на колонке TSK40 (TOYOSODA) в 0,05 N уксусной кислоте по данным 'Н-ЯМР-спектроско-пии было получено производное м-КПС серотипа 6А с H2NHNHCO(CH2)4CONHNH-группой на восстанавливающем конце, где R - остаток КПС S. pneumoniae серотипа 6А, повторяющееся звено которого имеет следующую формулу: [^2)-a-D-GaIp-(1^3)-a-D-Glcp-(1^3)-a-L-Rhap-(1^3)-D-Ribitol-(5^P^| (рис. 2А).
Из сравнения величин интегральных интенсивностей сигналов аномерного протона остатка рамнозы (1Н) и сигнала 2,5(4Н)- или 3,4(4Н)-метиленовых групп остатка ади-пиндигидразида (рис. 2Б) следовало, что на один терминальный гидразидный остаток приходится около 30 повторяющихся олигосахаридных звеньев м-КПС.
На примере м-КПС S. pneumoniae серотипа 6В, КПС которого входит в состав всех полисахаридных и конъ-югированных полисахарид-белковых вакцин, были изучены некоторые иммунологические характеристики
0,8 -,
0,6 -
с' 0,4 -О
0,2 -
0,0
□ п-КПС ■ м-КПС
p = 0,0112
О
х
PBS
м-КПС, 0,5 мкг м-КПС, 5,0 мкг
Рис. 4. Анализ кросс-реактивности сывороток к КПС и м-КПС S. pneumoniae на 35-й день после иммунизации м-КПС (анализ достоверности различий методом многофакторного дисперсионного анализа)
ns
ns
PBS м-КПС, 0,5 мкг м-КПС, 5 мкг
Рис. 5. Результаты оценки бактериостатической активности иммунных сывороток
КР - контроль роста культуры без сывороток (анализ достоверности различий методом многофакторного дисперсионного анализа).
м-КПС. Иммунные сыворотки, полученные в результате иммунизации мышей м-КПС S. pneumoniae серотипа 6В, были проанализированы методом ИФА на содержание специфических IgG- и IgM-антител, а также на их способность распознавать как дезаминированный, так и стандартный КПС 6B (кросс-реактивность). Результаты изменения уровней специфических IgG и IgM к м-КПС в сыворотке крови мышей и анализа кросс-реактивности сывороток к КПС и м-КПС S. ртитотае представлены на рис. 3 и 4.
Для образцов сывороток, собранных на 35-ый день после первой иммунизации, дополнительно проводили анализ бактериостатической активности с использованием бактериального штамма S. pneumoniae серотипа 6B. Спустя 20 часов инкубации образцов с S. pneumoniae 6B отмечалось снижение роста бактерий в присутствии иммунных сывороток, по сравнению с сыворотками, полученными от животных, которым вводили контрольный препарат (PBS). Наблюдаемый бактериостатический эффект носил дозо-зависимый характер и возрастал при увеличении дозы, используемой при иммунизации мышей (рис. 5).
Обсуждение
Многочисленные исследования последних лет показали, что современные ПС и ПС-белковые конъюгирован-ные вакцины не полностью отвечают требованиям эффективности [15, 16]. В этой связи встает вопрос о разработке новых подходов к решению этой проблемы [17-19].
КПС S. pneumoniae, образуя плотную оболочку вокруг бактериальной клетки, играют защитную роль,
являясь основным фактором вирулентности. Они определяют серологическую специфичность каждого из более чем 100 известных к настоящему времени серо-типов S. pneumoniae и при введении в макроорганизм индуцируют образование специфических протективных антител. Циркуляция в человеческой популяции значительного числа серотипов S. pneumoniae заставляет при разработке вакцин не только анализировать и учитывать вклад каждого серотипа в эпидемиологическую ситуацию в географическом регионе в данное время, но и принимать во внимание динамику изменений этой ситуации, связанную с проведением массовой вакцино-профилактики. Таким образом, чем больше КПС эпидемически важных (для данной территории в данное время) серотипов входит в вакцинную композицию, тем эффективнее ее протективное действие.
КПС всех серотипов S. pneumoniae построены из различающихся по структуре повторяющихся олигоса-харидных звеньев, в состав которых входит от 2 до 7 моносахаридных остатков. Моносахарид, расположенный на восстанавливающем конце этого биополимера, присоединен гликозидной связью непосредственно к ПГ клеточной стенки [13], в то время как в большинстве изученных грам-положительных микроорганизмов КПС присоединяется к ПГ посредством кислотолабиль-ной фосфодиэфирной связи.
S. pneumoniae наряду с КПС продуцирует ОПАП, который, обладая высокой иммуногенностью, не проявляет протективных свойств по отношению к S. pneumoniae [20]. Часть молекул ОПАП содержит от 2 до 8 повторяющихся олигосахаридных звеньев и липидный фрагмент на восстанавливающем конце. Они «заякорены» во внешней мембране бактериальной клетки (F-антиген). Другая часть ОПАП присоединена к ПГ ковалентной связью (С-полисахарид, С-ПС) [21]. Удаление примеси ОПАП являлось до последнего времени нерешенной проблемой при производстве антипневмококковых вакцин.
В рамках традиционного подхода к выделению и очистке КПС из НЖ, полученной в результате глубинного культивирования, нами были получены КПС более 20 эпидемически значимых серотипов S. pneumoniae. Данные спектроскопии Щ-ЯМР полученных КПС полностью совпадали с данными литературы. Каждый выделенный КПС содержал от 5 до 17 % ОПАП, что было определено на основании сопоставления в 'Н-ЯМР-спек-тре интегральных интенсивностей сигнала холина, принадлежащего ОПАП, и сигнала одной из групп, характерных для КПС каждого серотипа (О- или N-ацетат, пируват). Уменьшить содержание этой примеси в КПС без существенных потерь до последнего времени не удавалось. Недавно было установлено [12], что в условиях реакции дезаминирования КПС азотистой кислотой происходит распад одного моносахаридного остатка в цепи ОПАП, что сопровождается дезинтеграцией последнего и исчезновением характерного сигнала холина из 'Н-ЯМР-спектра КПС. Из анализа данных литературы, касающихся уникального характера строения узла связи
между КПС S. pneumoniae и ПГ, следовало, что реакция дезаминирования может быть использована не только для удаления ОПАП, но и для более глубокой очистки КПС. В отличие от других грам-положительных бактерий, у которых КПС присоединены к ПГ в положение С-6 остатка N-ацетил-D-мурамовой кислоты через фос-фодиэфирный мостик, в случае S. pneumoniae местом присоединения КПС является С-6 остатка N-ацетил-D-глюкозамина, причем 80 % остатков этого моносахарида и 10 % остатков N-ацетил-Э-мурамовой кислоты лишены N-ацетильной группы [21, 22]. Из вышеизложенного можно предположить следующее: так как часть ОПАП в виде С-ПС также присоединена к ПГ, «традиционные» КПС S. pneumoniae, используемые для получения вакцин, представляют собой трехкомпонентные «биоконъю-гаты», в которых несколько остатков КПС и С-ПС присоединены к фрагменту ПГ, образующемуся в результате аутолизиса бактериальных клеток. Именно этим объясняются неудачные попытки удалить примесь ОПАП из КПС с помощью физико-химических подходов (рис. 6).
В рамках этого предположения способность КПС продуцировать протективные антитела может быть обусловлена его высокой молекулярной массой и наличием в составе трехкомпонентного «биоконъюгата» фрагмента ПГ, возможно, играющего роль встроенного адъюванта. Таким образом, можно предположить, что лицензированные полисахаридные пневмококковые вакцины представляют собой комбинацию вышеописанных «биоконъюгатов», выделенных из клеток клинически важных серотипов S. pneumoniae.
Для очистки КПС 20 штаммов S. pneumoniae от примеси ОПАП был использован описанный ранее способ [12] c несколько измененными условиями проведения реакции дезаминирования: вместо 5 % уксусной кислоты, которую вводили в реакцию авторы статьи [12], был использован более концентрированный водный раствор уксусной кислоты (соотношение CH3COOН : Н2О 1 : 3). В результате были получены м-КПС практически без примеси ОПАП и ПГ, спектры 'Н-ЯМР которых, как и следовало ожидать, не отличались от спектров исходных КПС, за исключением отсутствия в спектрах м-КПС сигнала при 3,2 м.д., характерного для (СН3)^-группы остатка холина - непременного компонента ОПАП [21].
Сравнительный анализ КПС и м-КПС с помощью ВЭЖХ показал, что у большинства м-КПС время удерживания заметно меньше, чем у исходных КПС. Это должно было бы означать, что в результате распада трехкомпонентного «биоконъюгата» образуется продукт с большей молекулярной массой. Обнаруженный хроматографический эффект может быть объяснен неспецифической сорбцией на ВЭЖХ-фазе необычных по архитектонике разветвленных молекул КПС S. pneumoniae и отсутствием сорбции в случае м-КПС. Только в случае серотипа 6А наблюдалась обратная ситуация. Время удерживания м-КПС серотипа 6А при ВЭЖХ значительно больше, чем у исходного КПС серотипа 6А, т. е. его молекулярная масса значительно
Рис. 6. Схематическое изображение трехкомпонентного «биоконъюгата»
ниже, чем у исходного КПС и м-КПС других серотипов. Несмотря на высокую распространенность этого патогенного серотипа КПС серотипа 6А не включен в состав 23-валентной вакцины из-за своей низкой иммуноген-ности [23]. Лишь конъюгат с белком на основе КПС серотипа 6А приобретает способность к индукции про-тективных антител (входит в состав всех конъюгиро-ванных пневмококковых вакцин). Наличие в составе КПС серотипа 6А КПС-фрагмента с низкой молекулярной массой, с одной стороны, может объяснить его низкую иммуногенность, а с другой - отсутствие неспецифической сорбции при ВЭЖХ.
Изучение иммуногенных характеристик было проведено нами на примере КПС S. pneumoniae 6В. Исследование специфических IgG и IgM к КПС в сыворотке крови мышей, иммунизированных м-КПС серотипа 6B, подтвердило формирование иммунного ответа и его достоверное увеличение по сравнению с контрольной группой начиная с момента введения первой дозы (см. рис. 3А, Б). При этом уровень продукции антител носит дозозависимый характер и повышается при увеличении дозы иммунизации.
При изучении бактериостатических свойств иммунных сывороток, полученных при иммунизации животных м-КПС в дозе 5 мкг/животное, было показано, что через 20 ч инкубации сывороток с бактериальным штаммом наблюдалось снижение роста культуры по сравнению с контрольной группой. Для сыворотки крови животных опытной группы, иммунизированной м-КПС в дозе 0,5 мкг/животное, статистически значимых эффектов не наблюдалось (см. рис. 4). Таким образом, в результате проведенного эксперимента было показано, что введение м-КПС вызывает формирование специфических IgM и IgG и приводит к повышению бакте-риостатической активности сыворотки крови животных в отношении соответствующего штамма S. pneumoniae.
Поскольку способ получения КПС может влиять на его антигенные свойства как антигена и, как следствие, на иммуногенные свойства, была проведена оценка возможных различий антигенной структуры КПС и м-КПС, полученных из бактериальных штаммов S. pneumoniae серотипа 6В. Для этого методом твердофазного ИФА была исследована способность антител, полученных к м-КПС, связываться с КПС.
Анализ кросс-реактивности сывороток к КПС и м-КПС S. pneumoniae показал, что в условиях сорб-
ции, оптимальных для КПС и м-КПС, статистически значимых различий уровней IgG в группах мышей, иммунизированных м-КПС в дозах 0,5 и 5 мкг/живот-ное, не выявлено. Таким образом, антитела, полученные к м-КПС, способны распознавать КПС, что может свидетельствовать о наличии у этих препаратов общих эпитопов. Различие уровней IgG, связавшихся с антигеном, в контрольной группе мышей (PBS) может быть обусловлено наличием фрагментов ПГ в составе исходного КПС. Результаты измерения уровня IgG-антител к КПС и м-КПС представлены на рис. 5.
Из полученных данных следует, что м-КПС, полученные в результате дезаминирования КПС S. рпвышотае, сохраняют свою антигенную специфичность, при иммунизации животных индуцируют продукцию специфических IgG- и IgM-антител, а сыворотки иммунизированных мышей проявляют бактериостатические свойства.
■ Литература
1. Ghaffar F., Friedland I.R., McCracken G.H. Dynamics of nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae. Pediatr. Infect. Dis. J. 1999; 18 (7): 638-46. DOI: https://doi.org/10.1097/00006454-199907000-00016
2. Alqahtani A.S., Tashani M., Ridda I., Gamil A., Booy R., Rashid H. Burden of clinical infections due to S. pneumoniae during Hajj: A systematic review. Vaccine. 2018; 36 (30): 4440-6. DOI: https://doi. org/10.1016/j. vaccine.2018.04.031
3. Новикова Е.М., Чухина Е.С., Разваляева Н.А., Козырева О.В., Головина М.Э., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степаненко Р.Н. Влияние детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei на экспрессию клетками меланомы В16 опухоль-ассоциированного антигена gp100 и антигенов MHC I. Иммунология. 2024; 45 (1): 68-81. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-68-81
4. Новикова Е.М., Козырева О.В., Разваляева Н.А., Чухина Е.С., Головина М.Э., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степаненко Р.Н. Противоопухолевая активность лигандов Toll-подобных рецепторов бактерий Shigella sonnei. Иммунология. 2023; 44 (2): 167-80. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-167-80
5. Степаненко Р.Н., Львов В.Л., Андреев И.В., Новикова Е.М., Козырева О.В., Разваляева Н.А., Мартынов А.И. р (1^6)^-глюкан из плодового тела гриба Lentinus edodes: структура и иммунобиологические свойства. Иммунология. Иммунология. 2019; 40 (4): 13-22. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14002
6. Antony R.P., Miguel A.P., Harding S., Roshini S.A. The total IgM, IgA and IgG antibody responses to pneumococcal polysaccharide vaccination (Pneumovax®23) in a healthy adult population and patients diagnosed with primary immunodeficiencies. Vaccine. 2019; 37 (10): 1350-5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.01.035
7. O'Hagan D.T., Gregorio E.D. The path to a successful vaccine adjuvant - «the long and winding road». Drug Discov. Today. 2009; (14): 541-51. DOI: https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.02.009
8. Xu Q., Ng C.A.A.S, Sturgess A.W., Harmon B.J., Hennessey J.P. Jr. Characterization and quantification of C-polysaccharide in Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide preparations. Anal. Biochem. 2005; 336 (2): 262-72. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ab.2004.10.019
9. Chase M.W. Methods of Immunology and Immunochemistry. 1968.
10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantita-tion of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 7 (72): 248-54. DOI: https://doi. org/10.1006/abio.1976.9999
11. Spirin A.S. Spectrophotometric determination of total nucleic acids. Biokhimiia. 1958; 23 (5): 656-62.
12. Zou W., Li J., Vinogradov E., Cox A. Removal of cell wall poly-saccharide in pneumococcal capsular polysaccharides by selective degradation via deamination. Carbohydrate Polym. 2019; (218): 199-207. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.carbpol.2019.03.070
Заключение
В рамках проведенного исследования получены модифицированные КПС, не обладающие недостатками, присущими природным КПС, а именно не содержащие примеси балластного общего полисахаридного антигена S. pneumoniae. Полученные иммуногенные м-КПС содержат остаток 2,5-ангидро^-маннозы на восстанавливающем конце, альдегидная группа которой может быть использована для конъюгации с ами-носодержащей матрицей белковой или иной природы без необходимости дополнительной активации м-КПС при конъюгации. Полученные м-КПС обладают высокой растворимостью в водных буферах, что позволяет повысить технологичность процессов конъюгации при получении пневмококковых гликоконъюгированных вакцин.
13. Serensen U.B., Henrichsen J., Chen H.C., Szu S.C. Covalent linkage between the capsular polysaccharide and the cell wall peptidoglycan of Streptococcus pneumoniae revealed by immunochemical methods. Microb. Pathog. 1990; 8 (5): 325-34. DOI: https://doi.org/10.1016/0882-4010(90)90091-4
14. Williams J.M. Deamination of Carbohydrate Amines and Related Compounds. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1975; 31: 9-79. DOI: https://doi.org/10.1016/S0065-2318(08)60294-2
15. Croucher N.J., Lechen A., Bentley S.D. Pneumococcal Vaccines: Host Interactions, Population Dynamics, and Design Principles. Annu. Rev. Microbiol. 2018; (72): 521-49. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-micro-090817-062338
16. Shirley M. 20-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine: A Review of Its Use in Adults. Drugs. 2022; 82 (9): 989-99. DOI: https:// doi.org/10.1007/s40265-022-01733-z
17. Костюкова Н.Н., Бехало В.А. Пневмококковые полисахарид-ные конъюгированные вакцины и проблема смены циркулирующих серотипов пневмококка. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2023; 22 (5): 110-20. DOI: https://doi.org/10.31631/2073-3046-2023-22-5-110120
18. Нуриев Р.И., Гальвидис И.А., Ястребова Н.Е., Буркин М.А. Разработка и оценка гликоконъюгатного препарата на основе полисахаридного антигена S. pneumonia и столбнячного анатоксина. Медицинский академический журнал. 2016; 16 (4): 162-3. DOI: https://doi. org/10.17816/MAJ164162-163
19. Цветков Ю.Е., Яшунский Д.В., Сухова Е.В., Курбатова Е.А., Нифантьев Н.Э. Синтез олигосахаридов, структурно родственных фрагментам капсульного полисахарида Streptococcus pneumonia типа 3. Известия Академии наук. Серия химическая. 2017; 1: 111-22. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-6-54-60
20. Nielsen S.V., Serensen U.B., Henrichsen J. Antibodies against pneumococcal C-polysaccharide are not protective. Microb. Pathog. 1993; 14 (4): 299-305. DOI: https://doi.org/10.1006/mpat.1993.1029
21. Fischer W., Behr T., Hartmann R., Peter-Katalinic J., Egge H. Teichoic acid and lipoteichoic acid of Streptococcus pneumoniae possess identical chain structures. A reinvestigation of teichoid acid (C poly-saccharide). Eur. J. Biochem. 1993; 215 (3): 851-7. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1432-1033.1993.tb18102.x
22. Vollmer W., Tomasz A. The pgdA gene encodes for a peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase in Streptococcus pneumoniae. J. Biol. Chem. 2000; 275 (27): 20496-501. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc. m910189199
23. Geno K.A., Gilbert G.L., Song J.Y, Skovsted I.C., Klugman K.P., Jones C., Konradsen H.B., Nahm M.H. Pneumococcal Capsules and Their Types: Past, Present, and Future. Clin. Microbiol. Rev. 2015; 28 (3): 87199. DOI: https://doi.org/10.1128/cmr.00024-15
■ References
1. Ghaffar F., Friedland I.R., McCracken G.H. Dynamics of nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae. Pediatr Infect Dis J. 1999; 18 (7): 638-46. DOI: https://doi.org/10.1097/00006454-199907000-00016
2. Alqahtani A.S., Tashani M., Ridda I., Gamil A., Booy R., Rashid H. Burden of clinical infections due to S. pneumoniae during Hajj: A systematic review. Vaccine. 2018; 36 (30): 4440-6. DOI: https://doi. org/10.1016/j.vaccine.2018.04.031
3. Novikova E.M., Chukhina E.S., Razvalyayeva N.A., Kozyreva O.V., Golovina M.E., L'vov V.L., Aparin P.G., Stepanenko R.N. Effect of detoxified Shigella sonnei lipopolysaccharide on the expression of tumor-associated antigen gp100 and MHC I antigens by B16 melanoma cells. Immunologiya. 2024; 45 (1): 68-81. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-68-81 (in Russian)
4. Novikova E.M., Kozyreva O.V., Razvalyayeva N.A., Chukhina E.S., Golovina M.E., L'vov V.L., Aparin P.G., Stepanenko R.N. Antitumor activity of ligands of Toll-like receptors of bacteria Shigella sonnei. Immunologiya. 2023; 44 (2): 167-80. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-167-180 (in Russian)
5. Stepanenko R.N., Lvov V.L., Andreev I.V., Novikova E.M., Kozyreva O.V., Razvalyaeva N.A., Martynov A.I. p (1^6)-D-glucan from the fruit body of mushroom lentinus edodes: structure and immunobiological properties. Immunologiya. 2019; 40 (4): 13-22. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14002 (in Russian)
6. Antony R.P., Miguel A.P., Harding S., Roshini S.A. The total IgM, IgA and IgG antibody responses to pneumococcal polysaccharide vaccination (Pneumovax®23) in a healthy adult population and patients diagnosed with primary immunodeficiencies. Vaccine. 2019; 37 (10): 1350-5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.01.035
7. O'Hagan D.T., Gregorio E.D. The path to a successful vaccine adjuvant - «the long and winding road». Drug Discov Today. 2009; (14): 541-51. DOI: https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.02.009
8. Xu Q., Ng C.A.A.S, Sturgess A.W., Harmon B.J., Hennessey J.P. Jr. Characterization and quantification of C-polysaccharide in Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide preparations. Anal Biochem. 2005; 336 (2): 262-72. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.ab.2004.10.019
9. Chase M.W. Methods of Immunology and Immunochemistry. 1968.
10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantita-tion of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976; 7 (72): 248-54. DOI: https://doi. org/10.1006/abio.1976.9999
11. Spirin A.S. Spectrophotometric determination of total nucleic acids. Biokhimiia. 1958; 23 (5): 656-62.
12. Zou W., Li J., Vinogradov E., Cox A. Removal of cell wall poly-saccharide in pneumococcal capsular polysaccharides by selective de-
■ Сведения об авторах
Львов Вячеслав Леонидович - канд. хим. наук, зав. лаб. препаративной биохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0609-8331
Вернер Ирина Карловна - канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. препаративной биохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2043-4263
gradation via deamination. Carbohydrate Polym. 2019; (218): 199-207. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.carbpol.2019.03.070
13. Serensen U.B., Henrichsen J., Chen H.C., Szu S.C. Covalent linkage between the capsular polysaccharide and the cell wall peptidogly-can of Streptococcus pneumoniae revealed by immunochemical methods. Microb Pathog. 1990; 8 (5): 325-34. DOI: https://doi.org/10.1016/0882-4010(90)90091-4
14. Williams J.M. Deamination of Carbohydrate Amines and Related Compounds. Adv Carbohydr Chem Biochem. 1975; 31: 9-79. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0065-2318(08)60294-2
15. Croucher N.J., Lechen A., Bentley S.D. Pneumococcal Vaccines: Host Interactions, Population Dynamics, and Design Principles. Annu Rev Microbiol. 2018; (72): 521-49. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-micro-090817-062338
16. Shirley M. 20-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine: A Review of Its Use in Adults. Drugs. 2022; 82 (9): 989-99. DOI: https:// doi.org/10.1007/s40265-022-01733-z
17. Kostyukova N.N., Bekhalo V.A. Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccines and the problem of changing circulating pneumococ-cal serotypes. Epidemiology and vaccine prevention. 2023; 22 (5): 110-20. DOI: https://doi.org/10.31631/2073-3046-2023-22-5-110120
18. Nuriev R.I., Galvidis I.A., Yastrebova N.E., Burkin M.A. Development and evaluation of a glycoconjugate drug based on the polysaccha-ride antigen of S. pneumonia and tetanus toxoid. Medical academic journal. 2016; 16 (4): 162-3. DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ164162-163
19. Tsvetkov Yu.E., Yashunsky D.V., Sukhova E.V., Kurbatova E.A., Nifantiev N.E. Synthesis of oligosaccharides structurally related to fragments of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumonia type 3. Proceedings of the Academy of Sciences. Chemical series. 2017; 1: 11122. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-6-54-60
20. Nielsen S.V., Serensen U.B., Henrichsen J. Antibodies against pneumococcal C-polysaccharide are not protective. Microb Pathog. 1993; 14 (4): 299-305. DOI: https://doi.org/10.1006/mpat.1993.1029
21. Fischer W., Behr T., Hartmann R., Peter-Katalinic J., Egge H. Teichoic acid and lipoteichoic acid of Streptococcus pneumoniae possess identical chain structures. A reinvestigation of teichoid acid (C polysaccharide). Eur J Biochem. 1993; 215 (3): 851-7. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1432-1033.1993.tb18102.x
22. Vollmer W., Tomasz A. The pgdA gene encodes for a peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase in Streptococcus pneumoniae. J Biol Chem. 2000; 275 (27): 20496-501. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc. m910189199
23. Geno K.A., Gilbert G.L., Song J.Y, Skovsted I.C., Klugman K.P., Jones C., Konradsen H.B., Nahm M.H. Pneumococcal Capsules and Their Types: Past, Present, and Future. Clin Microbiol Rev. 2015; 28 (3): 871-99. DOI: https://doi.org/10.1128/cmr.00024-15
■ Authors' information
Viacheslav L. Lvov - PhD, Head of Preparative Biochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0609-8331
Irina K. Verner - PhD, Researcher of Preparative Biochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2043-4263
Гущин Владимир Алексеевич - д-р биол. наук, вед. науч. сотр., руководитель отд. эпидемиологии и рефе-ренс-центра по коронавирусной инфекции, зав. лаб. механизмов популяционной изменчивости патогенных микроорганизмов ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Российская Федерация Email: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9397-3762
Васина Дарья Владимировна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. механизмов популяционной изменчивости патогенных микроорганизмов ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Российская Федерация
Email: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1965-0700
Антонова Наталия Петровна - канд. фарм. наук, науч. сотр. лаб. механизмов популяционной изменчивости патогенных микроорганизмов ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Российская Федерация
Email: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7025-8056
Григорьев Игорь Васильевич - науч. сотр. лаб. трансляционной биомедицины ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Российская Федерация Email: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6946-2156
Vladimir A. Gushchin - Dr.Sci., PhD, Leader Researcher, Head of the Epidemiology Dept. and Reference Center for Coronavirus Infection, Head of the Lab. of Mechanisms of Population Variability of Pathogenic Microorganisms, N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation Email: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9397-3762
Darja V. Vasina - PhD, Senior Researcher of Lab. of Mechanisms of Population Variability of Pathogenic Microorganisms, N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation Email: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1965-0700
Natalija P. Antonova - PhD, Researcher of Lab. of Mechanisms of Population Variability of Pathogenic Microorganisms, N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation Email: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7025-8056
Igor V. Grigorev - Researcher of Lab. of Translational Bio-medicine, N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation Email: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6946-2156
