CC BY
8УДК 636.52/.58:575.113/.118
Р.А. Кулибаба, Ю.В. Ляшенко
К ВОПРОСУ ОБ ОБРАЗОВАНИИ КОНФОРМАЦИОННЫХ ХИМЕРНЫХ МОЛЕКУЛ В ПРОЦЕССЕ АМПЛИФИКАЦИИ ДИНУКЛЕОТИДНЫХ
ТАНДЕМНЫХ ПОВТОРОВ
Институт животноводства Национальной академии аграрных наук Украины 62404, Украина, Харьковская обл., Харьковский р-н, пгт. Кулиничи, ул. 7-ой Гвардейской армии, 3
e-mail: [email protected]
Изучен вопрос образования особого класса конформационных артефактов в процессе амплификации дину-клеотидных микросателлитных локусов. Показано, что возникновение нелинейной гомодуплексной ДНК характерно для большого количества динуклеотидных микросателлитных локусов разных видов животных: как для Gallus gallus (MCW0104, LEI0094, MCW0123, MCW0245, MCW0034), так и для Bos taurus (RM185, BM027). Доказано, что причиной образования данного типа артефактов ПЦР при амплификации таргетных фрагментов генома является непосредственное взаимодействие антипараллельных цепей молекулы ДНК, а не ошибки ДНК-полимеразы. Выявлена зависимость образования нелинейной гомодуплексной ДНК от концентрации ам-плифицированных фрагментов. Показано, что образование нелинейной гомодуплексной ДНК в концентрации, достаточной для детекции при проведении электрофореза, происходит, ориентировочно, с 20-25-го цикла ПЦР.
Ключевые слова: генотипирование, микросателлиты, полиморфизм, электрофорез, артефакты.
Введение
Благодаря особенностям своей структуры (в первую очередь высокой полиморфности локусов) микросателлиты нашли применение для решения самых различных задач современной генетики [1-3]. К первоочередным задачам относятся идентификация особей, контроль происхождения, генетико-популяционный анализ, контроль за проведением селекционной работы и т.д. [4, 5]. При проведении достаточно масштабных работ по типированию особей, как по отдельным микросателлитным маркерам, так и по их совокупности, основное внимание следует уделять точности генотипирования, т.е. необходимости избегать путаницы при идентификации аллелей и генотипов. В связи с этим актуальным является вопрос о влиянии целого ряда факторов на эффективность гено-типирования. Следует отметить, что для микросателлитов характерно наличие артефактов, возникновение которых связано с особенностями данного типа молекулярно-генетических маркеров [6]. Артефакты проявляются в виде образования дополнительных, т.е. не соответствующих целевым, фрагментов ДНК, наличие которых может приводить к ошибкам при генотипировании особей (как пример, увели-
чивается риск путаницы гомозиготных особей с гетерозиготными, со всеми вытекающими отсюда последствиями). К большинству достаточно хорошо изученных артефактов относятся статтеры, нуль-аллели, гетеродуплексная ДНК и т.д. [7-9]. Многие из перечисленных артефактов возникают и при генотипировании по другим типам молекулярно-генетических маркеров (PCR-RFLP, Ме1 и т.д.). Однако, несмотря на изученность данных феноменов, все равно отмечены случаи неверных интерпретаций наблюдаемых явлений (хорошим примером может служить ошибка в принятии наличия гетеродуплексной ДНК за факт дупликации гена при амплификации фрагмента четвертого интрона гена гормона роста кур) [10]. Подобное явление особенно широко распространено при проведении микросателлитного анализа, о чем свидетельствует детальный анализ фотографий электрофореграмм, представленных в различных публикациях. В предыдущей работе авторами было постулировано наличие особого класса артефактов ПЦР, присущих только микросателлитным локусам, - нелинейной гомодуплексной ДНК [11]. Нелинейная гомо-дуплексная ДНК относится к классу конфор-мационных химерных молекул и представляет
собой антипараллельные цепи целевых фрагментов, которые комплементарны друг другу не на всем протяжении цепи. Некомплементарный участок (петлевой домен) стабилизируется взаимодействиями внутри одиночной цепи. Образование нелинейной гомодуплексной ДНК в процессе ПЦР приводит к появлению на электрофореграмме дополнительных фрагментов (полос), которые значительно затрудняют генотипирование (в первую очередь, приводя к появлению ложных аллелей и к мнимому увеличению гетерозиготности в изучаемой популяции). Предлагаемая статья служит своеобразным продолжением данных исследований. Цель работы - детальное изучение динамики образования нелинейной гомодуплексной ДНК в процессе амплификации целевых фрагментов динуклеотидных микросателлитных локусов, а также подтверждение природы образования артефактов ПЦР посредством конформационных взаимодействий между цепями ДНК.
Материалы и методы
Исследования проводили в лаборатории профилактики заболеваний птицы и молекулярной диагностики Государственной опытной станции птицеводства, а также в лаборатории молекулярно-генетических и физиолого-биохимических исследований в животноводстве Института животноводства Национальной академии аграрных наук Украины.
В качестве источника биологического материала использовали кровь животных (крупный рогатый скот украинской черно-пестрой породы) и птицы (куры пород украинской селекции). ДНК выделяли с использованием коммерческого набора реагентов «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», Россия).
Для проведения амплификации в серии опытов по изучению конформационного полиморфизма ДНК использовали следующие праймеры:
MCW0104 - 5'-TAGCACAACTCAAGC TGTGAG-3' и 5'-AGACTTGCACAGCTGT GTACC-3' [12].
MCW0034 - 5'-TGCACGCACTTACATA CTTAGAGA-3' и 5'-TGTCCTTCCAATTACAT TCATGGG-3' [12].
Амплификацию проводили с использованием реагентов DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific) с использованием программируемого
термоциклера «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по соответствующим программам: 1 цикл - денатурация: 94 °C, 3 мин; 35 циклов - денатурация: 94 °C, 1 мин, отжиг: 1 мин (67 °C), элонгация: 72 °C, 1 мин; 1 цикл - финальная элонгация: 72 °C, 10 мин. Объем конечной смеси составлял 20 |iL, концентрация праймеров - 0,2 цМ в каждом случае.
Электрофорез проводили в полиакриламид-ных гелях различных концентраций (4-8%) как нативных, так и денатурирующих. Окрашивание гелей проводили с использованием бромистого этидия или нитрата серебра [13].
Исследования проводились как на целевых фрагментах, так и на выделенной из геля ДНК. Выделение фрагментов ДНК из ПААГ проводили посредством инкубирования вырезанных из геля фрагментов в присутствии TE-буфера в течение 16 часов при 37 °C [14]. Секвениро-вание осуществляли на автоматическом анализаторе ABI Prism 3130.
Результаты и обсуждение
Для достижения поставленных задач исследования в целом были разделены на несколько последовательных этапов. На первом этапе мы повторили опыты, проведенные нами в предыдущие годы, на большем количестве различных микросателлитных маркеров. Нами было показано образование артефактов (нелинейной гомодуплексной ДНК) в процессе ПЦР по локусам MCW0104, LEI0094, MCW0123, MCW0245, MCW0034. Также данное явление было подтверждено исследованиями не только на птице, но и на крупном рогатом скоте -маркеры RM185 и ВМ027 (рис. 1).
В каждом случае при амплификации как на-тивных ДНК-мишеней, так и выделенных из геля одиночных целевых фрагментов, после проведения электрофореза в нативных гелях мы наблюдали образование дополнительных фрагментов, что существенным образом затрудняло генотипирование особей. Игнорирование вопроса об образовании артефактов в процессе ПЦР могло привести к неверным выводам и искажениям в генетико-популяционном анализе опытных групп животных. Факт широко распространенного образования артефактов при типировании по большому количеству микросателлитных локусов приводит нас ко второй задаче исследований - показать, что
Рис. 1. Электрофореграммы продуктов амплификации различных микросателлитных локусов: а - LEI0094; б -ВМ027; в - MCW0123; г - MCW0104. А, в, г - окрашивание нитратом серебра; б - окрашивание бромидом этидия
непосредственным источником образования артефактов являются конформационные взаимодействия цепей ДНК.
Как известно, использование нативных по-лиакриламидных гелей позволяет разделять молекулы по размеру, однако на электрофоре-тическую подвижность разделяемых фрагментов также влияет и конформационная структура. Для предотвращения данного эффекта широко применяют денатурирующие условия электрофореза в геле. При использовании денатурирующего ПААГ молекулы ДНК разделяются только в зависимости от их размера (количества пар нуклеотидов), конформаци-онные эффекты сведены к минимуму. Исходя из вышеизложенного, был поставлен опыт с целью проверки разделяющей способности денатурирующего ПААГ на примере ампли-фицированных фрагментов с ярко выраженным конформационным полиморфизмом в нативных условиях. На рис. 2 представлены фотографии электрофореграмм нативного (за основу взята фотография из нашей предыдущей работы [11]) и полностью продублированного по пробам денатурирующего геля.
Анализ приведенных электрофореграмм свидетельствует об исчезновении дополнительных фрагментов в случае с денатурирую-
щим ПААГ. Это доказывает, что природа этих фрагментов связана с конформационными взаимодействиями.
Убедительные выводы, полученные в результате описанных экспериментов, могут натолкнуть на мысль, что повсеместное использование денатурирующих гелей вместо нативных может полностью решить проблему с эффективностью генотипирований по микросателлитным маркерам. Такой вывод вполне логичен, однако данный метод также имеет ряд недостатков. Так, например, к недостаткам использования денатурирующих гелей относится необходимость (о которой, впрочем, весьма часто забывают) поддержания постоянной температуры (как правило, 50-60 °C) в течение всего электрофореза. Для этого следует использовать электрофоретиче-ские камеры с возможностью рециркуляции буфера, которыми оснащена далеко не каждая лаборатория. При игнорировании данного условия не будут достигнуты необходимые параметры геля, способствующие полному обеспечению денатурирующих условий проведения электрофореза, что, в свою очередь, приведет к появлению конформационных химерных молекул (нелинейной гомодуплексной ДНК) и, соответственно, к ошибкам геноти-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Рис. 2. Сравнение нативного (а) и денатурирующего (б) ПААГ. 1-20 - номера проб (пояснения в тексте). Электрофореграмма, представленная на рис. 1а, взята из статьи [11]. 1-4, 6, 10, 15, 18 - нативные пробы; 7-9, 11-14, 16, 17, 19, 20 - амплификат от выделенных целевых фрагментов соответствующих нативных проб; 5 - маркер молекулярных масс М-200 (фрагмент 200 п.н.). Гель а окрашен
бромидом этидия, гель б - нитратом серебра
пирования. Необходимо также отметить, что комбинация таких факторов, как высокая температура, высокая концентрация мочевины в геле (7-8 М) усложняет процедуру внесения проб в гель, а также увеличивает диффузию амплифицированных фрагментов. Это является существенным недостатком при идентификации аллелей, отличающихся на несколько пар оснований. Применение более концентрированных гелей для усиления разрешающей способности также малоэффективно в связи с увеличением времени фореза (усиление диффузии с увеличением времени прогонки и необходимостью использования повышенных параметров электрического поля). В связи с этим, повсеместное использование электрофореза в денатурирующем ПААГ не является панацеей, а наоборот, зачастую служит источником большого количества ошибок.
На следующем этапе исследований была поставлена задача продемонстрировать тот факт, что источник образования нелинейной гомо-дуплексной ДНК - непосредственное взаимодействие цепей в двухцепочечной молекуле, а
не результат ошибок ДНК-полимеразы в процессе амплификации при проведении ПЦР. С этой целью были проведены эксперименты по воспроизведению артефактов без проведения ПЦР с использованием в качестве модельного объекта локуса MCW0034. Для этого, после проведения амплификации, из геля были вырезаны фрагменты А и В (рис. 3) для последующего выделения ДНК.
Одна часть (фрагменты А и В) была подготовлена для проведения электрофореза без изменений (пробы 2 и 3), вторую подвергли денатурации при 94 °С в течение 5 мин с дальнейшим термостатированием при комнатной температуре в течение 20 мин (пробы 4 и 5). Данной процедуры достаточно для обеспечения обратимой денатурации выделенной из геля ДНК и последующей гибридизации комплементарных цепей друг с другом. Далее все пробы переносили на электрофорез (нативный).
Как видно на электрофореграмме, пробы 2 и 3 представлены в виде лишь одного целевого фрагмента (А или В). Проведение цикла денату-
рации/ренатурации привело к появлению двух фрагментов (A и B) в пробах 4 и 5. Тот факт, что в пробах 4 и 5 присутствуют два фрагмента (целевой и дополнительный), убедительно указывает на специфическое взаимодействие комплементарных цепей как непосредственную причину образования артефактов (нелинейной гомодуплексной ДНК). Так как вышеприведенная процедура представляет собой, по сути, один из этапов ПЦР (с измененными характеристиками длительности каждого из процессов), то становится понятным, что практически в каждом цикле амплификации могут образовываться, наряду с целевыми фрагментами, нелинейные гомодуплексные молекулы.
Также параллельно провели секвенирова-ние вырезанных из геля амплифицированных фрагментов. На рис. 4 представлены нуклео-тидные последовательности двух вырезанных фрагментов ДНК локуса MCW0034 (фрагменты A и B рис. 3).
На приведенном рисунке показаны фрагменты локуса MCW0034, непосредственно содержащие микросателлитный мотив, т.к. именно вариации в количестве элементов мотива и определяют различия в аллелях. В данном случае это динуклеотидный мотив CA. Проведение процедуры выравнивания нуклеотидных фрагментов позволяет сделать вывод об идентичности двух исследованных последовательностей (количество элементов мотива совпадает) (рис. 4). Тот факт, что идентичные аллели MCW0034 дают разные фрагменты на электрофореграмме, убедительно доказывает правильность предположения о возникновении в процессе амплификации микросателлитных локусов нелинейной гомодуплексной ДНК как своего рода конфор-мационной химерной молекулы.
Полученные результаты коррелируют с данными других авторов, изучавших различные конформационные состояния ДНК, содержа-
щие тринуклеотидные повторы [15]. Речь идет о так называемой Slipped-stranded DNA. По мнению авторов, данные образования возникают в результате своего рода «проскальзывания» (slippage) цепей ДНК друг относительно друга, что и приводит к образованию конформационных химерных молекул [16]. Описываемый феномен достаточно широко распространен и, по сути, является основой так называемой
1
4
в-
1ft шш
А-
Рис. 3. Электрофореграмма целевых продуктов амплификации и нелинейной гомодуплексной ДНК: 1 - исходная амплифицированная последовательность; 2 - выделенный из геля фрагмент A (нативный); 3 - выделенный из геля фрагмент B (нативный); 4 -фрагмент A, подвергнутый циклу денатурация/ренату-рация; 5 - фрагмент B, подвергнутый циклу денатура-ция/ренатурация
Рис. 4. Фрагмент нуклеотидных последовательностей микросателлитного локуса MCW0034: А - амплифициро-ванный вырезанный нижний фрагмент; В - амплифицированный вырезанный верхний фрагмент. Подстрочной
чертой выделен динуклеотидный мотив
«микросателлитной нестабильности», которую связывают с различными генетическими заболеваниями [17]. Явление «проскальзывания» ДНК во время репликации молекулы приводит к образованию статтеров - ампли-фицированной ДНК, содержащей измененное количество единиц повтора микросателлитной последовательности (как инсерции, так и де-леции). Данное явление может иметь место и при амплификации микросателлитных локусов в процессе ПЦР, что приведет к возникновению дополнительных фрагментов (по сути -аллелей) на электрофореграммах [18]. Однако следует отметить, что образование статтеров -процесс вероятностный и происходит далеко не при каждой амплификации. В процессе изучения генетической структуры популяций кур украинской селекции (4 породы по 10 SSR-локусам) мы лишь единожды столкнулись с образованием статтеров в процессе ПЦР (локус MCW0104). Выявленный амплификационный фрагмент характеризовался слабой интенсивностью свечения на электрофореграмме и отличался от целевого аллеля ориентировочно на 2 п.н. (делеция). Достоверность его образования была подтверждена результатами денатурирующего гель-электрофореза. Если предположить, что процесс «проскальзывания» ДНК-полимеразы в микросателлитной последовательности является событием относительно редким, то количество копий статтеров в процессе амплификации должно быть более низким в сравнении с целевыми фрагментами. Поэтому при традиционных способах детекции (бромид этидиума или азотнокислое серебро) мы их либо не улавливаем, либо же имеет место относительно слабое свечение, которое позволяет принимать их за ложные аллели. Артефакты, в случае образования статтеров, представляют собой, по сути, гетеродуплекс-ную ДНК, т.е. гибридную молекулу, состоящую из цепей разной длины (различающихся на одну или несколько единиц микросателлитного повтора). Такой тип артефактов называется SI-DNA (Slipped Intermediates DNA) [15]. Название данного типа артефактов отражает механизм их образования - эффект «проскальзывания» (slippage). В случае отсутствия статтеров гибридные молекулы полностью идентичны описанной в нашей работе нелинейной гомоду-плексной ДНК, что доказывается результатами
секвенирования последовательностей (равное количество элементов микросателлитного мотива указывает на идентичность аллелей и, следовательно, отсутствие статтеров) (рис. 4). Однако авторы называют подобные структуры, в случае с тринуклеотидными повторами, S-DNA, т.е. Slipped DNA, что, с нашей точки зрения, несколько нецелесообразно, т.к. предполагает феномен «проскальзывания» как механизм образования мутантных вариантов исходного мотива. Поэтому использование термина «нелинейная гомодуплексная ДНК», на наш взгляд, больше подходит для данного типа артефактов, так как непосредственно указывает на конформационную природу их образования.
Предположение о том, что в процессе ПЦР наряду с целевыми образуются фрагменты нелинейной гомодуплексной ДНК, послужило причиной последующих исследований - изучения вопроса о влиянии количества циклов ПЦР на появление неспецифических продуктов (артефактов).
Для решения данной задачи провели серию амплификаций с последующим разделением продуктов в нативном ПААГ. Амплификации различались между собой только количеством циклов - от 5 до 35 с шагом 5. На рис. 5 представлены результаты опыта с использованием пробы ДНК, соответствующей № 4 рис. 2.
Как видно из рис. 5, артефакты появляются, начиная, ориентировочно, с 20-го цикла. В пределах первых 15 циклов синтезируются преимущественно целевые фрагменты. Начиная с 20-25-го циклов интенсивность свечения артефактов увеличивается вплоть до совпадения по значению с целевыми фрагментами, что указывает на приблизительно равный «выход» продуктов. С увеличением количества циклов ПЦР происходит увеличение концентрации продуктов амплификации (при условии совпадения эффективности реакций в целом). Поэтому появление артефактов после первых 20 циклов указывает на зависимость их образования от концентрации амплифицирован-ных фрагментов. В определенной степени на конечный результат могут также влиять такие факторы, как исходная концентрация матрицы ДНК, модель термоциклера и т.д., что, в свою очередь, также выражается в вариации эффективности ПЦР, т.е. в целом, опять-таки влияет на концентрацию конечного продукта. Однако
Рис. 5. Зависимость образования артефактов (нелинейных гомодуплексов) от количества циклов ПЦР: 1 - 5 циклов; 2 - 10; 3-4 - 15; 5-6 - 20; 7-8 - 25; 9-10 - 30; 11-12 - 35
зависимость образования именно «конформационных» артефактов от концентрации ампли-фицированных продуктов (ампликонов), на наш взгляд, очевидна.
Следует отметить, что возможность определения дополнительных фрагментов на элек-трофореграмме зависит также и от метода окрашивания геля. В случае использования окрашивания нитратом серебра (как гораздо более чувствительного метода) образование артефактов определяется, в среднем, с 15 циклов ПЦР.
На основе всего вышеизложенного можно предположить, что в условиях относительно низких концентраций амплифицированной ДНК происходит образование преимущественно целевых фрагментов (линейной гомо-дуплексной ДНК), т.к. в циклах денатурации/ ренатурации антипараллельные цепи комплементарно связываются друг с другом на всем протяжении и вероятность образования арте-фактных молекул низка и недостаточна для последующей детекции. В случае же, когда концентрация амплифицированной ДНК превышает определенное пороговое значение, комплементарные взаимодействия цепей на всем протяжении дуплексной молекулы нарушаются, что и приводит к образованию нелинейной гомодуплексной ДНК. Особого внимания заслуживает тот факт, что наблюдаемый феномен характерен только для микроса-теллитных локусов. Возможно, что стабилизация молекулы нелинейной гомодуплексной ДНК происходит именно из-за взаимодействия оснований внутри каждой из цепей в участке, содержащем микросателлитные повторы. В любом случае, более детальное освещение
данного вопроса, особенно касающегося влияния количества и состава микросателлитных повторов на эффективность образования конформационных химер, требует проведения дальнейших детальных экспериментов, которые, в свою очередь, будут служить продолжением представленных в работе исследований.
Заключение
Приведенные результаты исследований акцентируют внимание на особом классе артефактов ПЦР, возникающих в результате конформационных изменений структуры ДНК при амплификации динуклеотидных микросателлитных локусов. Речь идет о нелинейных го-модуплексных молекулах, имеющих близкую к целевым фрагментам электрофоретическую подвижность и, следовательно, существенно влияющих на эффективность генотипирова-ния при использовании нативных ПААГ. На примере представленных экспериментальных данных подтвержден механизм образования нелинейной гомодуплексной ДНК посредством взаимодействия цепей молекулы, а не в результате ошибок ДНК-полимеразы при проведении амплификации. Показана зависимость образования конформационных артефактов от концентрации амплифицированных фрагментов в процессе ПЦР. Вероятность образования нелинейных гомодуплексов существенно возрастает после первых 20 циклов амплификации, и к финальному циклу ПЦР (35 циклов) их количество соизмеримо с выходом целевых фрагментов.
Конформационная природа данного типа артефактов подтверждена также в опыте с использованием денатурирующих условий элек-
трофореза (дополнительные фрагменты отсутствуют при использовании денатурирующего ПААГ). Казалось бы, повсеместное использование денатурирующего гель-электрофореза решает проблемы со всевозможными разновидностями дуплексных молекул ДНК и избавляет исследователя от ошибок при гено-типировании. Однако, как следует из анализа электрофореграмм, приведенных в различных научных публикациях, далеко не всегда удается достичь полностью денатурирующих условий при проведении электрофореза, что впоследствии и приводит к ошибками геноти-пирования. Поэтому лучший способ избавления от возможных ошибок - детальный анализ полученных результатов и понимание природы происходящих процессов. В этой работе мы попытались разобраться в сути процесса образования наиболее распространенного типа артефактов при анализе микросателлитных локусов различных видов животных. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности проведения предварительного анализа именно в нативных условиях, чтобы представить в целом картину полиморфизма изучаемых особей и обратить внимание на возможные артефакты, что, безусловно, поможет при анализе данных в денатурирующих условиях. При получении определенного опыта с помощью анализа гомо- и гетеродуплексных фрагментов можно проводить успешные гено-типирования без обязательного проведения денатурирующего гель-электрофореза, который в отсутствии специального оборудования трудно воспроизводим и не лишен недостатков.
Список использованных источников
1. Chistiakov D.A. Microsatellites and their genomic distribution, evolution, function and applications: a review with special reference to fish genetics / D.A. Chistiakov, B. Hellemans, F.A.M. Volckaert // Aquaculture. - 2006. -Vol. 255. - P. 1-29.
2. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants / R.K. Kalia [et al.] // Euphytica. - 2011. - Vol. 177. - P. 309-334.
3. Methods for development of microsatellite markers: an overview / S. Senan [et al.] // Not Sci Biol. - 2014. - Vol. 6 (1). - P. 1-13.
4. Gholizadeh, M. Use of microsatellite markers in poultry research / M. Gholizadeh,
G.R. Mianji // International Journal of Poultry Science. - 2007. - Vol. 6 (2). - P. 145-153.
5. Abdul-Muneer, P.M. Application of microsatellite markers in conservation genetics and fisheries management: recent advances in population structure analysis and conservation strategies / P.M. Abdul-Muneer // Genetics Research International. - 2014. - Vol. 2014. - 11 p. - ID 691759.
6. Butler, J.M. Forensic DNA Typing, Second Edition: Biology, Technology, and Genetics of STR Markers / J.M. Butler. - Academic Press, 2005. - 688 p.
7. Walsh, P.S. Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleo-tide repeat locus vWA / P.S. Walsh, N.J. Fildes, R. Reynolds // Nucleic acids research. - 1996. -Vol. 24, N 14. - P. 2807-2812.
8. Olejniczak, M. Genotyping of simple sequence repeats - factors implicated in shadow band generation revisited / M. Olejniczak, W.J. Krzyzosiak // Electrophoresis. - 2006. -Vol. 27. - P. 3724-3734.
9. Interpretation of electrophoretograms of seven microsatellite loci to determine the genetic diversity of the Arabian Oryx / I.A. Arif [et al.] // Genetics and Molecular Research. - 2010. -Vol. 9 (1). - P. 259-265.
10. Кулибаба, Р. А. MspI-полиморфизм четвертого интрона гена гормона роста в популяциях кур различных пород. Анализ причин возникновения дополнительного паттерна рестрикции / Р.А. Кулибаба, П.С. Юрко, Ю.В. Ляшенко // Цитология и генетика. -
2015. - Т. 49, № 6. - С. 30-37.
11. Кулибаба, Р.А. Влияние артефактов ПЦР на эффективность генотипирования по микросателлитным локусам при использовании электрофореза в нативных полиакриламидных гелях / Р.А. Кулибаба, Ю.В. Ляшенко // Цитология и генетика. -
2016. - Т. 50, № 3. - С. 16-23.
12. Molecular genetic characterization of animal genetic resources / FAO Animal Production and Health Guidelines. - N 9. - Rome, 2011. - 87 p.
13. Irwin N., Janssen K.A. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press; 3th edition. 2001. 764 p.
14. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations / J. Chen [et al.] // DNA Research. - 2012. - Vol. 19. -P. 423-433.
15. Pearson, C.E. Trinucleotide repeat DNA structures: dynamic mutations from dynamic DNA / C.E. Pearson, R.R. Sinden // Current Opinion in Structural Biology. - 1998. - Vol. 8 -P. 321-330.
16. Pearson C.E. Alternative structures in duplex DNA formed within the trinucleotide repeats of the myotonic dystrophy and fragile X loci / C.E. Pearson, R.R. Sinden // Biochemistry. - 1996. - Vol. 35. - P. 5041-5053.
17. Triplet repeat DNA structures and human genetic disease: dynamic mutations from dynamic DNA / R.R. Sinden [et al.] // J. Biosci. -2002. - Vol. 27, No 1, Suppl. 1. - P. 53-65.
18. Microsatellite (SSR) amplification by PCR usually led to polymorphic bands: evidence which shows replication slippage occurs in extend or nascent DNA strands / A. Hosseinzadeh-Colagar [et al.] // Molecular biology research communications. - 2016. - Vol. 5 (3). - P. 167-174.
R.A. Kulibaba, Y.V. Liashenko
ON THE ISSUE OF GENERATION OF CONFORMATIONAL CHIMERIC MOLECULES DURING AMPLIFICATION OF DINUCLEOTIDE TANDEM
REPEATS
Institute of Animal Science of National academy of agrarian sciences of Ukraine
Kharkov, Ukraine, 62404
The issue related to the formation of a special class of conformational artifacts during the amplification of dinucleo-tide microsatellite loci was studied. It was shown that the origin of a non-linear homoduplex DNA molecule is typical for a large number of dinucleotide microsatellite loci of different animal species - for Gallus gallus (MCW0104, LEI0094, MCW0123, MCW0245, MCW0034 et al.), and for Bos taurus (RM185, BM027). It is proved that a cause of this type of PCR artifacts' formation during the amplification of target fragments of a genome is rather direct interaction of the antiparallel chains of the DNA molecule than errors of the DNA polymerase. The relation between the formation of a non-linear homoduplex DNA and the concentration of the amplified fragments was defined. It is shown that the formation of the non-linear homoduplex DNA in the concentration, sufficient for the detection during electrophoresis, occurs approximately from 20-25th PCR cycle.
Key words: genotyping, microsatellite, polymorphism, electrophoresis, artifacts.
Дата поступления статьи 27 октября 2016 г.
