CC BY
71
УДК 639.3.07:639.331:597.442
К ВОПРОСУ О ВЛИЯНИИ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ОСЕТРОВЫХ РЫБ, ВЫРАЩИВАЕМЫХ В АКВАКУЛЬТУРЕ
© 2011 г. А.В. Казарникова1, Я.Б. Ловчикова 2, Е.В. Шестаковская 3, Ю.Н. Чмырь 2
1Южный научный центр РАН, 1Southern Scientific Centre RAS,
ул. Чехова, 41, г. Ростов-на-Дону, 344006 Checkhov St., 41, Rostov-on-Don, 344006
2ОАО «Новочеркасский рыбокомбинат», 2OAO «Novocherkassk Fish Plant»,
ул. Октябрьская, 2, Октябрьский сельский р-он, Oktyabrskaya St., 2, Oktyabrskiy District,
Ростовская обл., 346466 Rostov Region, 346466.
3 Ростовский отдел ФГУП ЦПС, 3 Rostov Branch CPR,
ул. Обороны, 49, Ростов-на-Дону, 344002, Oborone St., 49, Rostov-on-Don, 344002,
[email protected] [email protected]
Исследование влияния факторов внешней среды на гибридов русского х сибирского осетра (Acipenser gueldenstaedtii х A. baerii) проводилось на одном из рыбоводных хозяйств Нижнего Дона. Больные рыбы держались у поверхности воды, плохо брали корм. Наблюдались изменения в окраске кожных покровов, жабр, составе клеток крови и строении внутренних органов. Гибель рыб отмечалась на фоне высокого содержания NH4+, NH3, колебаний рН, кислорода и температуры.
Ключевые слова: осетровые, выращивание, заболевания, среда.
The influence of environmental factors on sturgeon hybrids (Acipenser gueldenstaedtii х A. baerii) was studied at one offish farms from low flow of Don river. Sick fishes stayed near water surface and did not eat. Changes in color of body surface and gills, in hematological indexes and histological structure were observed. Fish mortality was accompanied by high level of NH4+, NH3, changes in pH, oxygen and temperature levels.
Keywords: sturgeons, diseases, rearing, environmental factors.
Русский осетр (Acipenser gueldenstaedtii), бестер одним из направлений товарного осетроводства явля-
(H.huso x A. ruthenus), гибрид русский A. Gueldens- ется выращивание осетровых рыб в прудах малой
taedtii, сибирский осетр (A. baerii) - основные объек- площади с постоянной аэрацией, что позволяет уве-
ты аквакультуры на юге России. В настоящее время личивать биомассу на единицу объёма, интенсифици-
ровать кормление и т.д. Эффективность производства в таких хозяйствах гораздо выше. Наряду с положительными сторонами имеются и недостатки: высокие концентрации нитратов, нитритов, углекислого газа, перепады рН и др. Все они относятся к наиболее распространенным стрессорам водной среды.
Влияние факторов внешней среды на рыб происходит через прямое химическое или физическое воздействие на мембраны клеток или ткани. Изменяются физиологические и биохимические реакции, возрастает пресс факультативных патогенов и паразитов [1], снижается сопротивляемость организма рыб и, как следствие, возникают бактериальные заболевания в латентной и острых формах [2].
Для возникновения заболевания чаще всего необходимо суммарное воздействие нескольких стресс-факторов, таких как низкое содержание кислорода и рН, высокие концентрации аммония и углекислого газа, причем заболевание может не возникнуть в случае воздействия лишь одного из этих факторов [3]. Понимание того, в какой степени тот или иной стресс-фактор способствует развитию заболеваний рыб, дает возможность разработать меры профилактики для предотвращения воздействия неблагоприятных условий или снижения этого воздействия до минимума.
Определение параметров внешней среды, при которых изменения в организме рыб носят необратимый характер, изучение процессов, которые происходят в организме под влиянием абиотических и биотических факторов, исследование физиологических и гистологических изменений необходимо для определения стресс-факторов, имеющих наибольшее значение при выращивании осетровых рыб.
Материал и методы
Двухлетки гибридов русского х сибирского осетра длиной L= 47^60 см, 1= 42^50 см и весом Р = 440^690 г были выловлены из бетонных садков канального типа на одном из рыбоводных хозяйств Нижнего Дона летом 2008 г. Водоснабжение садков происходило из р. Аксай. Температура воды в период исследования колебалась в пределах 22^27 °С. Рыб кормили коммерческими кормами фирмы <^сгеШ^».
Для паразитологического исследования использовали методы, общепринятые в паразитологии [4].
Для бактериологического анализа брали посевы из паренхиматозных органов, асцитной жидкости, воды из садков. Всего на анализ взято 5 клинически здоровых и больных рыб. Для выделения, культивирования и идентификации бактерий использовали селективные среды и методы, общепринятые в ихтиопатологии [4].
Первичные посевы от рыб проводили качественно на чашках Петри с плотными питательными средами (мясо-пептонным агаром и эритрит-агаром). Условно патогенная микрофлора (ОКС+) подсчитывалась по результатам оксидазного теста.
Бактериологическое исследование воды проводили количественным методом (метод серийных разведений) и выражали общим микробным числом (ОМЧ). Учет выросших сапрофитных микроорганиз-
мов вели по количеству КОЕ (колониеобразующих единиц в 1 мл воды).
Гидрохимические показатели воды в садках определяли согласно методическим указаниям по исследованию проб воды из рыбохозяйственных водоемов [5].
Определение содержания химических элементов в грунте проводили с использованием методов атомно-абсорбционной спектрометрии, ренгенфлюоресцентно-го определения валового содержания тяжелых металлов в твердых веществах; исследование фито- и зоопланктона - согласно методике изучения биоценозов внутренних водоемов [6]; определение видов водорослей и коловраток - по [7, 8]; изготовление мазков крови - согласно общепринятым в ихтиопатологии методам [5, 9]. Лейкоцитарную формулу определяли, подсчитывая в окрашенных мазках 200 клеток белой крови. Индекс сдвига лейкоцитов рассчитывали по методике из [10]. Для изготовления гистологических препаратов (печень, селезенка, почки, сердце) использовали методы, общепринятые в гистологии [4].
Двухлетки гибридов русского х сибирского осетра содержались в бетонных садках канального типа, оснащенных аэраторами. Гибель рыб началась с единичных экземпляров и в течение месяца достигла нескольких десятков в день. Больные рыбы держались у поверхности воды, плохо поедали корм. На поверхности тела и на плавниках отмечены кровоизлияния, жабры темно-красного цветв с очагами некроза на концах, дистальные концы жаберных лепестков утолщены.
При патологоанатомическом вскрытии отмечали изменения в окраске печени, ее неоднородную структуру, мраморную окраску, точечные кровоизлияния, участки жирового перерождения. В желчном пузыре желчь имела ярко-зеленый цвет, что видимо, явилось следствием голодания.
Проведенный гидрохимический анализ воды показал превышение нормативных показателей в отдельных садках по МН4+ в 1,8 раза, аммиака - в 1,4. Содержание нитритов в пределах нормы, но по сравнению с водоисточником выросло в 2 раза. Соотношение N : Р в разных садках колебалось от 5:1 до 12:1. Содержание кислорода в воде нередко снижалось до 4 мг/л.
Перманганатная окисляемость (ПО) воды превышала норму в 2 раза. Показатели рН немного выше (8,05^8,33), а содержание СО2 ниже нормативных показателей (рис. 1).
.с
е
J3L
pH
CO2
Окисляемость
1 Садок 22 □ Садок 12 □ Садок 4 □ Водозабор □ Нормативные значения
Рис. 1. Гидрохимические показатели воды садков и водоисточника
25
Концентрация сульфатов в воде садков по сравнению с водоисточником снизилась в 2-3 раза, а хлоридов - увеличилась, что, видимо, связано с гидрохимическими процессами, происходящими в садках (рис. 2). Концентрация химических элементов в грунтах садков не превышала ПДК.
Жесткость Са 2+ Мя 2+ НСО, 8042" С"
мСэдок 22 Садок 12 I Садок 4 —¿^—водоисточник —норма
Рис. 2. Солевой состав воды садков и водоисточника
Исследовании фито- и зоопланктона показало присутствие в воде садков 17 видов водорослей (табл. 1). Биомасса низкая. Зоопланктон также практически отсутствует, за исключением единичных представителей отряда СМосега в отдельных садках.
Таблица 1
Спектр фитопланктона в садках осетрового участка
Вид Водоисточник Садок 22 Садок 12 Садок 4
Llemodinium sp. +* + + +
Steletonema sp. + + + -
Nitzschia sp. _ ** + - -
Navicula sp. 1 - + + -
Navicula sp. 2 - + + -
Centritractus sp. - + + -
Tabellara sp. - + - -
Lepocinelis sp. + + - -
Euglena sp. + + + +
Trachelononas sp. - - + -
Actinostronis sp. - - + -
Ankistrodesnues sp. - - + -
Scenedesnius guadricaudo + - - -
Chlanidomonus sp. + + - -
Cartería sp. + - - -
Oscillatoria sp. - + + -
Synedra ulna - - - +
Всего 7 11 10 3
была гибель (садок № 22), эти показатели на 2 порядка выше - 1104 КОЕ/г.
Качественный состав микрофлоры, выделенный от больных и здоровых рыб, включал условно патогенные бактерии родов Aeromonas, Citrobacter, Proteus. Дрожжеподобные грибы не обнаружены. В количественном соотношении у больных рыб преобладали аэромонады (90^94 %). При проведении теста на чувствительность выделенной микрофлоры к антибиотикам отмечена их чувствительность к нифулину, тетрациклину, окситетрациклину.
Паразитологическое исследование рыб паразитов не выявило.
Проведено гематологическое исследование рыб с признаками заболевания. Процентное содержание лимфоцитов в крови исследованных рыб - 54,1±3,32 %, что ниже нормальных значений (70^80 %). Количество лимфоцитов 42^72 % у разных рыб (табл. 2). В мазках преобладали зрелые лимфоциты. Молодые и созревающие клетки встречались редко.
Таблица 2
Показатели крови гибридов русского х сибирского осетра (числитель - интервал колебания значений, знаменатель - среднее значение)
* - наличие вида, ** - отсутствие.
Наиболее высокая бактериальная обсемененность воды и паренхиматозных органов рыб отмечалась в тех садках, где наблюдалась гибель осетровых.
ОМЧ воды садков - Ы0^2-Ш4 КОЕ/мл. Показатели ОМЧ в 2 раза выше в тех садках, где отмечалась гибель осетровых рыб. В количественном отношении преобладали бактерии родов Aeromonas, Citrobacter, Proteus. Колииндекс не превышал 900 в садке № 4 и 1800 в садке № 22, колититр - 1,11 и 0,56, что указывает на принадлежность водоема к группе загрязненных. ОМЧ паренхиматозных органов рыб из «благополучного» садка (№ 4) - 1-102 КОЕ/г, тогда как в садках, где
Эритроциты, %
Эритробласты -
Базофильные 0,2 - 1,4
1,3 ± 0,08
а н Полихроматофильные 1,6 - 4,0
ю о 3,3 ± 0,37
S ер Оксифильные 0,2 - 0,6
К 0,31 ± 0,05
Ортохромные 93,7 - 96,0
94,1 ± 1,06
Интенсивность эритропоэза 2,0 - 10,0
6,5 ± 1,0
Лейкоциты, %
Миелоциты -
и Метамиелоциты -
sä Палочкоядерные 8,0 - 8,0
о 11,7 ± 1,13
£ Сегментоядерные 7,0 - 24,0
и м 11,9 ± 2,25
Лимфоциты 50,0 - 60,0
54,1 ± 3,32
Эозинофилы 2,0 -1 5,0
9,3 ± 1,79
Моноциты 6,0 - 24,0
9,3 ± 1,79
Белок 1,7 - 2,46
2,2 ± 0,10
Индекс сдвига лейкоцитов, у.е. 0,28 - 0,69
0,5 ± 0,05
Нейтрофилы представлены сегментоядерными (11,9±2,25 %) и палочкоядерными (11,7±1,13) формами. Количество этих элементов значительно превышало норму (в 24 и 19 раз).
Количество моноцитов - 13±2,31 %. Значительное увеличение числа этих клеток по сравнению с нормой (0,1^0,5 %) свидетельствует о неблагоприятном воздействии факторов среды на организм рыб.
Число эозинофилов ниже нормы - 9,3±1,79 % (при норме 13^18). У отдельных рыб отмечали лизис клеток - разрушение клеточных оболочек. Макрофаги не обнаружены.
Тромбоциты представлены двумя типами клеток -одиночными с овальным ядром и вытянутой с обоих концов цитоплазмой и мелкими, округлыми клетками, образующими скопления.
Количество белка в крови ниже нормы - 2,2±0,10 % (3,0^3,5 - норма).
Эритроциты представлены зрелыми клетками, составляющими 94,1 ± 1,06 %, и незрелыми клетками - нормобластами: оксифильными (0,31±0,05 %), базофильными (1,3±0,08), полихроматофильными (3,3±0,37 %). Практически на всех мазках отмечались эритроциты со смещенными и деформированными ядрами. Наблюдалось нарушение формы эритроцитов, изменение текучести цитоплазмы, ее вакуолизация и расслоение. Изменения крови выражались в гемолизе эритроцитов, их разрушении, появлении молодых и патологических форм, а также микроци-тов. Все это сопровождалось развитием анемии.
Лейкоцитарная формула характеризовалась индексом сдвига лейкоцитов, который составил 0,5 у.е. (норма 0,2 - 0,3 у.е).
На гистологический анализ взяты участки печени, селезенки, почек и сердца осетровых рыб.
Отмечено жировое перерождение печени. В паренхиме выявлены жировые вакуоли, количество которых заметно возрастает к периферии. У большинства рыб (64 %) число вакуолизированных клеток превышало число нормальных. Участки ткани с деструкцией и лизисом располагались ближе к периферии. Вокруг крупных кровеносных сосудов отмечено возникновение обширных зон некробиоза и фиброзно-коллагеновых образований.
По проявлению патологических изменений в селезенке рассматривались 3 группы рыб.
Селезенка 1-й группы рыб (33 %) содержала сосуды, в которых не было отмечено изменений. Во 2-й группе (33 %) отмечались расширения и утолщения в стенке сосудов. В паренхиме разбросаны глыбки пигмента. Патологические изменения в селезенке отмечены у 3-й группы (34 %) осетров. Они выражались в образовании лимфоидных фолликулов с пустыми реактивными центрами и очень сильной пигментацией. Если предпатологию оценивать по 5-бальной шкале, то 1-й группе можно дать 2 балла, 2-й - 3, 3-й - 4.
Патологические изменения в почках выражались в дистрофии эпителия канальцев, полнокровии и отеке пирамид, очаговом склерозе. Капсулы имели неправильную вытянутую форму со слабо выраженным просветом. На отдельных участках просматривались пустые капсулы сосудистых клубочков. Стенки канальцев состояли из уплощенных клеток. Ядра клеток были также уплощенной формы. Просветы канальцев расширены.
Эпителий проксимального и дистального канальцев набухший в состоянии зернистой дистрофии. Корковое вещество почки малокровное, сосуды расширены и переполнены кровью, строма разрыхлена и отечна. Периваскулярно и перигломулярно встречались очаги гистиолимфоцитарной инфильтрации. У
отдельных рыб пролиферация эндотелия и клеток умеренная: резкое утолщение мембран капилляров клубочка, скопление белка, эритроцитов, слущенных клеток эпителия в полости капсулы Боумена.
Патологические изменения в сердце связаны с ге-модинамическими нарушениями (полнокровие, кровоизлияния), дистрофией, некробиозом паренхиматозных элементов. Отчетливо выражена очаговая пролиферативная реакция эндотелия и клеток перива-скулярной соединительной ткани. Гистиолимфоци-тарная реакция приобретала гранулематозный характер. Все это вело к развитию миокардита с участками переваскулярного склероза и атрофии паренхимы.
Обсуждение
Среди многообразия факторов внешней среды, играющих важную роль в жизни рыб, наибольшее значение имеют термический, газовый и солевой режимы воды. Накопление органических веществ в процессе интенсивной эксплуатации садков часто приводит к загрязнению воды и активизации представителей водной микрофлоры.
Высокое содержание NH4+ (в 1,8 выше нормы) и КН3, (в 1,4 выше нормы), колебание рН (7,87^8,33), кислорода (4^8 мг/л) и температуры (22^27 °С), высокие показатели ПО (21,8 мгО/л) воды в садках привели к снижению сопротивляемости организма осетровых рыб. По литературным данным [11], известно, что аммиак при рН 8,0 в 10 раз токсичнее, чем при рН 7,0, за счет резкого повышения концентрации неионизиро-ванных молекул (ЫН3). При повышении рН воды, дефиците растворенного кислорода и воздействии на рыб других неблагоприятных факторов среды экскрекция аммиака через жабры рыб тормозится. Последнее приводит к накоплению его в организме, особенно в жабрах, вызывая их повреждение, что мы наблюдали у двухлетков гибридов русского х сибирского осетра. Кроме этого, на поверхности тела и на плавниках отмечены кровоизлияния.
Согласно результатам анализов исключено отравление рыб токсинами водорослей и тяжелыми металлами. Биомасса водорослей была низкой, а концентрация тяжелых металлов в грунтах садков не превышала ПДК.
Низкая биомасса водорослей, как и отсутствие паразитов у рыб, видимо, связаны с регулярным внесением в воду садков негашеной извести. В противном случае высокие показатели органического загрязнения воды должны способствовать развитию фито- и зоопланктона, а также паразитов рыб.
Неблагоприятные условия внешней среды оказали влияние на бактериальную контаминацию воды. В [12, 13] установлено, что при ОМЧ воды, превышающем 1-103 КОЕ/мл, бактериальный прессинг на рыбу (особенно ослабленную) может способствовать контаминации ее внутренних органов микроорганизмами, в том числе и сапрофитными. В нашем случае ОМЧ воды в садках колебалось в пределах 1104 - 2-104 КОЕ/мл. По показателям колииндекса (900 - 1800) и колититра (0,56 - 1,11) водоем был отнесен к группе загрязненных.
ОМЧ паренхиматозных органов рыб колебалось в пределах 1-102^1-104 КОЕ/г, причем самые высокие значения были в садках, где отмечалась гибель рыб. Качественный состав микрофлоры, выделенной от больных и здоровых рыб, включал условно патогенные бактерии родов Aeromonas, Citrobacter, Proteus. Дрожжеподобные грибы необнаружены. В количественном соотношении у больных рыб преобладали аэромонады (90^94 %).
В условиях неблагоприятного воздействия внешней среды в первую очередь меняются показатели белой крови. Изменения в составе клеток красной крови проявляются в виде возрастания процента незрелых клеток. В нашем случае изменения в лейкоцитарной формуле выражались в индексе сдвига лейкоцитов, который составил 0,5 у.е. при норме 0,2^0,3.
Увеличение содержание нейтрофилов от 2 до 19 раз у больных рыб по сравнению с нормой свидетельствует о мобилизации защитных сил организма. Ней-трофилы являются наиболее реактивными клетками крови, обладающими высокой чувствительностью к разнообразным изменениям внутренней среды, которые сопутствуют нарушению гомеостаза. Основной функцией нейтрофилов является защита от инфекции и одновременно токсического воздействия. В процессе жизнедеятельности нейтрофилы выделяют ряд веществ, обладающих широким спектром действия. Они повышают антибактериальную активность и улучшают регенерацию тканей.
Значительное увеличение содержания моноцитов (более чем в 20 раз по сравнению с нормой) свидетельствует о мобилизации защитных сил организма рыб. Моноциты являются активными фагоцитами крови. Они поглощают не только бактерии, но и продукты распада клеток и тканей и содержат специальные ферменты для дезинтоксикации отдельных веществ.
Изменения в строении клеток красной крови выражались в деформации и смещении ядер эритроцитов, образовании шистоцитов, разрушении клеток. Отмечен гемолиз клеток, вакуолизация и отслоение цитоплазмы, ядерные тени. Разрушение эритроцитов сопровождалось появлением молодых и патологических форм, а также микроцитов. Таким образом, у рыб постепенно развивалась анемия и снижалось содержание белка в крови.
При гистологическом исследовании установлено неспецифическое изменение в строении печени, почек, селезенки и мышц сердца, что связано с неблагоприятным воздействием факторов внешней среды. Эти изменения могут быть непосредственно связаны с повышенным содержанием биогенных элементов в воде садков и низким содержанием кислорода, что ранее описывалось в литературе [14].
Высокая амплитуда колебания липид-зависимых полостей в клетках печени связана с низкой выживаемостью рыб. Для поддержания гомеостаза и резистентности организма очень важны механизмы деток-сикации. Ряд экзогенных и эндогенных жирорастворимых токсикантов имеет высокую биоаккумуляци-
Поступила в редакцию_
онную способность. Чем выше содержание липидов в клетках, тем больше в них может накапливаться таких загрязнителей. Печень как орган, богатый липидами, отличается большой способностью к аккумуляции токсинов. Характер поражения связан в первую очередь с особенностями питания и степенью адаптации отдельных особей.
Таким образом, при выращивании в аквакультуре осетровые рыбы подвергаются воздействию разнообразных стресс-факторов окружающей среды, основные из которых - органическое загрязнение воды, колебания рН и температуры. В этих условиях увеличилась контаминация воды и внутренних органов рыб условно патогенными микроорганизмами. Все это оказывает негативное влияние на организм рыб, вызывая морфологические изменения в крови и структуре внутренних органов.
Литература
1. Effects of treated domestic waste water on infectious agents
in brown trout (Salmo trutta L.) / D. Bernet [et al.] // Fischokologie. 2001. Vol. 12. P. 1-16.
2. Бормотова С.В., Ларцева Л.В., Рогаткина И.Ю. Сани-
тарное состояние аквакультуры осетровых и среды ее обитания // Рыбное хозяйство. Аквакультура. Болезни рыб. 1995. Вып. 2. С. 1-7.
3. Plumb J.A. Health maintenance and principal microbial
diseases of cultured fishes. Ames, USA, 1999. 328 p.
4. Лабораторный практикум по болезням рыб / под ред.
В.А. Мусселиус. М., 1983. 296 с.
5. Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб: в 2 ч.
М., 1998, 1999.
6. Митропольский В.И., Мордухай-Болтовская Ф.Д. Зоо-
бентос и другие биоценозы, связанные с субстратом // Методика изучения биоценозов внутренних водоемов. М., 1975. С. 158-170.
7. Голлербах М.М.., Полянский В.И. Пресноводные водо-
росли и их изучение // Определитель пресноводных водорослей СССР. М., 1951. Вып. 1. 199 с.
8. Кутикова Л.А. Коловратки фауны СССР Л., 1970. 744 с.
9. Иванова Н.Т. Атлас клеток крови рыб. Сравнительная
морфология и классификация форменных элементов крови рыб. М., 1983. 110 с.
10. Житенева Л.Д., Рудницкая О.А., Калюжная Т.И. Эколо-
го-гематологические характеристики некоторых видов рыб: справочник. Ростов н/Д, 1997. 149 с.
11. Грищенко Л.И., Акбаев М.Ш., Васильков Г.В. Болезни
рыб и основы рыбоводства. М., 1999. 123 с.
12. Юхименко Л.Н., Койдан Г.С., Бычкова Л.И. Перспективы
использования субалина для коррекции микрофлоры кишечника рыб и профилактики БГС // Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре. М., 2000. С. 133-135.
13. Проблема экологической безопасности лечебных и про-
филактических мероприятий в рыбоводстве / Л.Н. Юхименко [и др.] // Аквакультура и интегрированные технологии: проблемы и возможности: материалы Ме-ждунар. науч.-практ. конф. Москва, 11-13 апреля 2005 г. М., 2005. Т. 2. С. 344-347.
14. Experimental field exposure of brown trout to river water
receiving effluent from an integrated newsprint mill / K. Johnsen [et al.] // Ecotoxicology and Environmental Safety. 1993. № 40. P. 184 - 193.
9 июля 2010 г.
