CC BY
61
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
К ВОПРОСУ О МЕХАНИЗМАХ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
С.Ю.Родионов1, О.В.Лебединская2, М.В.Киселевский3, А.А.Штиль3, М.В.Черешнева1, В.А.Черешнев1, Л.А.Тараненко2, Т.В.Гаврилова1, О.А.Орлов2, Н.Н.Шур2, Е.Г.Орлова1
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург1 ГОУВПО "ПГМА Росздрава", г. Пермь2 Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, г. Москва3
В результате изучения противоопухолевого влияния АФП на культурах злокачественных клеток в условиях in vitro установлено, что АФП обладает прямым антипролиферативным воздействием на опухолевые клетки через реализацию неиммунных механизмов мембранотоксичности и блокады синтеза РНК, ДНК и белка. Установлено, что АФП в диапазоне доз от 153 до 1250 мкг/мл оказывает выраженное цитотоксическое воздействие на клетки мышиной мастоцитомы Р-815; АФП препятствует синтезу ДНК клеток эритромиелолейкоза К-562 в дозах 640, 320 и 160 мкг/мл и синтезу РНК клеток эритро-миелолейкоза К-562 в дозах 640, 320 и 80 мкг/мл; в дозах 640, 320 и 160 мкг/мл АФП снижает уровень синтеза белка в клетках эритромиелолейкоза К-562; в дополнительных исследованиях показано, что АФП в дозах 165 и 82 мкг/мл задерживает синтез РНК в клетках эритромиелолейкоза человека К-562 и мастоцитомы мышей Р-815; в дозах 40-100 мкг/мл при 72-часовой инкубации с клетками линии эритромиелолейкоза человека К-562 АФП обладает выраженным цитотоксическим действием от 55 до 100 %.
EFFECT OF HUMAN ALPHA-FETOPROTEIN ON DNA, RNA, AND PROTEIN SYNTHESIS, AND VIABILITY OF
TUMOR CELLS IN VITRO
S.J.Rodionov1, O.VLebedinskaia2, M.VKiselevskii3, А.А^ШИ3,
M.VChereshneva1, VA.Chereshnev1, L.А.Taranenro2, T.VGavrilova1, OA.Orlov2, N.N.Shur2, E.G.Orlova1
Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch of the Russian Academy of Science1,
Perm Medical Academy, Faculty of hospital surgery2,
Oncologic centre of science of RAMS a name of N.N. Blohina, laboratory of mechanisms of tumor cells destruction3
Effect of human alpha-fetoprotein (AFP) on the synthesis of RNA, DNA, and protein in tissue cultures of tumor cells (mastocytoma P815 from DBA/2 mice and erythromyeloleukosis K562) was investigated by radioisotope method. It was determined that AFP provided direct anti-proliferative effect on tumor cells in vitro via involvement of non-immune mechanisms of membrane toxicity and blockade of RNA, DNA, and protein synthesis. Within dose range from 153 to 1250 g/ml AFP exhibited an expressed cytotoxic effect on cells of murine mastocytoma P815; it impeded DNA synthesis in cells of erythromyeloleukosis K562 in the doses 640, 320, and 80 g/ml; and it decreased the level of protein synthesis in cells of erythromyeloleukosis K562 in doses 640, 320, and 160 g/ml. Under the additional examination AFP inhibited RNA synthesis in cells of human erythromyeloleukosis K562 and murine mastocytoma P815 in doses 165 and 82 g/ml. AFP within dose range from 40 to 100 g/ml (72 h incubation) exhibited an expressed cytotoxic effect on cells of human erythromyeloleukosis K562 from 55 % to 100 %.
Альфа-фетопротеин (АФП) человека относится к группе онкофетальных белков, которые вырабатываются в организме человека преимущественно в эмбриональном периоде, а также при ряде онкологических заболеваний [3, 10]. АФП содержит различные функциональные последовательности и сайты связывания. Большое число функциональных последовательностей в молекуле АФП свидетельствует о высоком регуляторном потенциале данного белка и широком спектре его биологической активности [4, 8]. АФП является регулятором роста для многих клеток и тканей, причем он способен как усиливать, так и подавлять пролиферативные процессы, в зависимости от его концентрации и свойств конкретных клеток [8]. Неослабевающий интерес к онкофетальному белку альфа-фетопротеину в последнее время обусловлен тем, что он является лигандом к эмбриональным рецепторам опухолевых клеток [21]. АФП оказывает влияние на активность клеток иммунной системы, причем он воздействует, как правило, на профилирующие клетки, не затрагивая их зрелых форм. Ранее нами показана способность АФП активировать натуральные киллеры, цитотоксические лимфоциты и дендритные клетки для подавления пролиферации линий раковых клеток в условиях in vitro [2, 5, 6]. Некоторые конформационные формы АФП могут служить в качестве двойных регуляторов роста, как усиливая, так и ингибируя его [16, 18].
L.H. Butterfield et al. [11] сообщают, что 4 эпитопа человеческого АФП являются иммуногенными для Т-лимфоцитов и могут быть потенциально перспективными для терапии рака печени. В сообщении группы исследователей в эксперименте и в клинике подтверждена высокая эффективность лечения гепато-целлюлярных злокачественных новообразований очищенным АФП отдельно и в комплексе с цитостатиками (адриамицин, митомицин) [14]. В проведенных нами клинических исследованиях выявлена высокая противоопухолевая активность белка АФП в отношении умеренно- и высокодифференцированных злокачественных опухолей [7, 9].
В постановлении IV и V Всероссийских съездов онкологов было определено, что одним из перспективных направлений практической онкологии является поиск веществ, обладающих апоптотическим воздействием на опухолевую клетку. В работах D.C. Hooper et al. [15] и J. Laborda et al. [17] показана способность АФП индуцировать апоптоз опухолевых клеток в условиях in vitro. Опухолевая клетка в состоянии апоптоза поглощается макрофагами при отсутствии воспалительного процесса, характерного для некроза [1]. Распад небольших по объему опухолей под дей-
ствием фетальных протеинов дает основания предполагать наличие неиммунных механизмов клеточной элиминации. Исследованиями отечественных и зарубежных лабораторий показано, что обработка человеческой гепатомы и человеческой лимфоблас-томы АФП in vitro приводит к выраженному торможению роста клеток, появлению морфологических изменений, характерных для апоптоза [12, 15, 17, 20], через реализацию экспрессии гена р53 [13, 19].
Целью настоящего исследования являлось изучение механизмов противоопухолевых свойств препарата «Профеталь» (альфа-фетопротеин человека) in vitro.
Материал и методы
В работе использован препарат «Профеталь» (Регистрационное удостоверение № ЛС 000941 М3 РФ от 18.11.05), предоставленный ЗАО «Институт новых медицинских технологий» (г. Пермь) , который включает в качестве основного компонента альфа-фето-протеин человеческий лиофилизированный и стабилизированный декстраном.
Для изучения влияния АФП на жизнеспособность опухолевых клеток, синтез РНК, ДНК и белка линий Р-815 и К-562 проведены эксперименты в условиях in vitro при совместной инкубации клеток с АФП в диапазоне разведений белка от 5 до 1250 мкг/ мл. Радиоизотопные методы исследования проведены с использованием Р-счетчика (Mark-3, Tracor Analytic). Мембранотоксическое действие АФП изучалось с использованием предварительно меченных С14-уридином клеток мастоцитомы мышей DBA/2 линии Р-815 в присутствии РНК-азы. Клетки поддерживали в асцитной форме. Инкубацию клеток (40000/лунку) с изотопом С14-уридин 0,5 mkCi /лунку проводили в 96-луночных планшетах при 37°С в течение 24 часов.
В качестве контроля служили клетки линии Р-815, меченные С14-уридином и инкубированные в аналогичных условиях в бессывороточной среде. В опытном исследовании клетки линии Р-815, меченные С14-уридином, инкубировали в присутствии АФП в разведении (1/2), начиная с 1,25 мг/мл (по АФП). В качестве сравнения к меченным С14-уридином клеткам мастоцитомы Р-815 добавляли белки сыворотки крови человека (Sigma) в аналогичных дозах с АФП, рассчитанных по количественному содержанию.
Биологическую активность АФП изучали на клетках эритромиелолейкоза человека К-562 (клетки поддерживали в культуре на среде RPML-1640). Синтез ДНК, РНК и белка определяли радиоизотопным методом по включению в клетки-мишени Н3-тимидина,
К вопросу о механизмах противоопухолевой активности альфа-фетопротеина человека in vitro
Н3-или С14-уридина и С14-лейцина, соответственно. Дополнительно, с целью усиления анаболических процессов, к культуральной среде RPML-1640 добавляли 10 % эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС). Это не касалось клеток контрольного эксперимента, где клетки линии К-562 находились в бессышороточной среде.
В основном эксперименте к клеткам эритромиелолейкоза К-562, помимо ЭТС, добавляли АФП с разведением (1/2), начиная с 640 мкг/мл. В эксперименте сравнения аналогично к клеткам линии К-562, помимо ЭТС, добавляли белки сыворотки крови человека (Sigma) в дозах, соответствующих дозам АФП, по количественному содержания белка. Инкубацию клеток (40 000/лунку) проводили в 96-луночнык планшетах при 37°С в течение 24 ч с включением радиоизо-топной метки.
С целью уточнения антипролиферативного эффекта АФП человека на опухолевые клетки в системе in vitro нами были поставлены дополнительные эксперименты. Это было обусловлено тем, что в предыдущих исследованиях в культуры клеток, помимо АФП, добавляли стимулятор роста - 10 % раствор ЭТС, а в качестве эксперимента сравнения использовали клетки К-562, активированные белками сыторот-ки крови человека. В данном эксперименте мы попытались исключить факторы, влияющие на объективность конечного результата.
Исследование влияния АФП человека на синтез РНК проводили на двух линиях опухолевык клеток: эритромиелолейкоза человека К-562 (клетки поддерживали в культуре на среде RPML - 1640 без ЭТС) и мастоцитомы мышей Р-815 (клетки поддерживали на мышах линии DBA/2 в асцитной форме). Синтез РНК определяли радиоизотопным методом по включению в клетки-мишени С14-уридина. Инкубацию клеток (40000/лунку) с изотопом (0,1 mkCi/лунку) проводили в 96-луночных планшетах при Т 37°С в течение 24 ч в бессышороточной среде, с включение радиоизотопной метки в клетки. Изменение скорости синтеза РНК при действии АФП выфажали в % по отношению к скорости синтеза РНК в популяции клеток - без присутствия АФП.
В дополнительном эксперементе для изучения влияния АФП на жизнеспособность опухолевых клеток линии MCF-7, HCT-116, К-562 использовался препарат АФП «Профеталь». С этой целью клетки рассеивали на 96-луночные планшеты (Costar, США) (5-10x10* клеток в 200 мкл культуральной среды). В
лунки вносили препарат в объеме не более 5% от количества среды в лунках. Каждую концентрацию препарата (20, 40, 60, 80, 100 мкг/мл) изучали в 3 повторениях. Культуры инкубировали при 37° С, 5 % С02 до 72 ч. По окончании инкубации в лунки вносили 20 мкл водного раствора 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-диметилтетразолия бромида, и планшеты помещали в С02-инкубатор на 2 ч. О жизнеспособности клеток судили по цветной реакции, развивающейся при восстановлении тетразолиевой соли в формазан дегидрогеназами митохондрий. Окраску регистрировали на спектрофотометре BioRad (США) при длине волны возбуждения 490 нм. Оптическую плотность в лунках, где клетки инкубировались только с растворителем (контроль), принимали за 100 %. Показатели оптической плотности в лунках с каждой концентрацией испытуемых препаратов усредняли и вычисляли процент выживших клеток при той или иной концентрации исследуемого вещества.
Результаты и обсуждение
Исследование влияния препарата АФП на культуры клеток мастоцитомы Р-815, эритробластного лейкоза человека К-562, показало, что АФП в диапазоне концентраций от 153 до 1250 мкг/мл оказывает выраженное цитотоксическое воздействие на клетки мышиной мастоцитомы линии Р-815. Причем отчетливо прослеживается дозозависимый эффект. В то же время белки крови не оказывают никакого влияния на жизнеспособность клеток линии Р-815 (рис. 1).
В клетках линии К-562 на фоне стимулирующего влияния ЭТС белки сыворотки крови значительно увеличивали синтез ДНК и РНК. АФП, напротив, значительно подавлял этот процесс. Так же как и в предыдущем исследовании по изучению мембраноток-сичности, очевиден дозозависимый эффект АФП. Однако в концентрациях 153 мкг/мл АФП не влиял на синтез ДНК, а в дозе 160 мкг/мл не отмечено выраженного ингибирования синтеза РНК (рис. 2, 3).
Из приведенных на рис. 4 данных следует, что в клетках эритромиелолейкоза человека К-562 в концентрациях 160, 320, 640 мкг/мл АФП существенно снижает уровень синтеза белка. При использовании концентрации АФП 80 мкг/мл подобного эффекта не наблюдалось.
С*
п
О
Л
н
X
§
о
X
ю
о
о
о
с
100 -
50
-50 -
-150 -1
□ Белки сыворотки крови человека + ЭТС
АФП + ЭТС
153
625
1 250
Разведение АФП и белков сыворотки человека, мкг/мл
Рис. 1. Влияние АФП на жизнеспособность клеток линии Р-815. По оси абсцисс: разведение АФП и белков сыворотки крови, мкг/мл; по оси ординат: жизнеспособность клеток в % от контроля (клетки без АФП и
сывороточных белков)
ч
о
а
н
я
§
25000
20000 -
15000 -
10000 -
5000 -
□ Белки сыворотки крови человека + ЭТС
АФП + ЭТС
153 306 625 1 250
Разведение АФП и белков сыворотки человека, мкг/мл
Рис. 2. Влияние АФП на синтез ДНК в клетках линии К-562. По оси абсцисс: разведение АФП и белков сыворотки крови, мкг/мл; по оси ординат: включение Н3-тимидина в клетки линии К-562 относительно контроля (клетки в бессывороточной среде), в %
Таблица
Изменение скорости синтеза РНК в клетках эритромиелолейкоза К-562 и мастоцитомы мышей Р-815 под влиянием АФП
АФП, мкг/мл К-562 Р-815
М етка,ср m** Активнос ть,% М етка,ср m** Активнос ть,%0
Без АФП 14881 100 24309 100
165 2880 19* 5738 * 5 2
82 6733 45* 13984 56*
41 13982 94 5834 23*
21 14245 96 20994 86*
10 15045 101 23674 97
5 15945 107 25033 103
Примечания: * - достоверное отличие от контроля (р<0,05), ** - cpm (count per minute) - число импульсов в минуту.
Из таблицы следует, что наличие в культурах опухолевык клеток АФП влияет на синтез РНК. Так, в дозах 82 и 165 мкг/мл он достоверно задерживает синтез РНК в клетках эритромиелолейкоза на 81 и 55 % соответственно. В клетках мастоцитомы мышей достоверное снижение синтеза РНК зарегистрировано при наличии в клеточной культуре АФП в концентрациях 21, 41, 82 и 165 мкг/мл.
Рис. 3. Влияние АФП на синтез РНК в клетках эритромиелолейкоза человека К-562. По оси абсцисс: разведение АФП и белков сыворотки крови, мкг/мл; по оси ординат: включение Н3-тимидина в клетки линии К-562 относительно контроля (клетки в бессывороточной среде), в %
с*
п
о
&
н
X
§
н
о
10000
8000
6000
4000
2000
0
Белки сыворотки □ крови человека + ЭТС
п АФП + ЭТС
80
160
320
640
а
§
н
о
Разведение АФП и белков сыворотки человека, мкг/мл 1200
1000
800
600
400
200
О
АФП + ЭТС
Белки сыворотки П крови человека + ЭТС
АФП + ЭТС
80
160
320
640
Разведение АФП и белков сышоротки человека, мкг/мл
Рис. 4. Влияние АФП на синтез белка в клетках эритромиелолейкоза человека К-562. По оси абсцисс: разведение АФП и белков сыворотки крови, мкг/мл; по оси ординат: включение С14-лейцина в клетки линии К-562 относительно контроля (клетки в бессывороточной среде), в %
При определении уровня цитотоксической активности белка АФП по отношению к линиям клеток рака молочной железы MCF-7, рака толстой кишки НСТ-116, эритробластного лейкоза человека К-562 показано, что АФП в изучаемых концентрациях вызывает гибель клеток К-562, другие клеточные линии были устойчивы к действию АФП (рис, 5).
Заключение
В результате изучения противоопухолевого влияния АФП на культурах злокачественных клеток в условиях in vitro установлено, что АФП обладает прямым антипролиферативным воздействием на опухолевые клетки через реализацию неиммунных механизмов мембранотоксичности и блокады синтеза РНК, ДНК и белка. АФП оказывает выраженное цитотоксическое воздействие в диапазоне доз от 153 до 1250 мкг/мл на клетки мышиной мастоцитомы Р-815. В дозах 40-100 мкг/мл при 72-часовой инкубации АФП с клетками линии эритро-миелолейкоза человека К-562 цитотоксичность составляет от 55 до 100 %. АФП препятствует синтезу ДНК и белка в клетках эритромиелолейкоза К-562 в
дозах от 160 до 640 мкг/мл. АФП препятствует синтезу РНК в клетках эритромиелолейшза К-562 в дозах от 80 до 640 мкг/мл и в клетках мастоцитомы линии Р-815 в дозах от 82 до 165 мкг/мл.
ЛИТЕРАТУРА
1. Волянский Ю.Л., Колотова Т.Ю., Васильев Н.В. Мо лекулярные механизмы программированной клеточной гибе ли // Усп. совр. биол. 1994. Т. 114, вып.6. С. 679-692.
2. Лебединская О.В., Черешнев В.А., Гаврилова Т.В. и др. Сравнительный анализ возможности экстракорпоральной генерации активированных лимфоцитов периферической крови человека с применением «Профеталь» и ИЛ-2 // Вест. Ураль ской мед. академической науки. 2005. № 4. С. 52-58.
3. Татаринов Ю.С. Присутствие эмбрионального аль фа-глобулина в сыворотке больных с первичным раком пече ни // Вопр. мед. химии. 1964. № 10. С. 90-91.
4. Черешнев В.А., Род-ионов С.Ю., Черкасов В.А. и др. Альфа-фетопротеин. Екатеринбург: УрО РАН, 2004. 376 с.
5. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К. и др. Получение активированных лимфоцитов из мононукдеарных лейкоцитов переферической крови человека под воздействием альфа-фетопротеина // Сибирский онкологический журнал. 2005. № 1. С. 40-46.
6. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Род-ионов СЮ и др. Влияние препарата «Профеталь» на функциональную ак тивность мононуклеарных лейкоцитов и дендритных клеток человека // Мед. иммунология. 2005. № 5-6. С. 18-24.
7. Черешнев В,А., Черкасов В,А., Васильев Н.В. и др.
Применение альфа-фетопротеина в комплексном и комбинированном лечении опухолевых заболеваний // Вопросы онкологии. 2005. № 1. С. 57-61.
8. Шмагелъ К.В., Черешнев В. А. Иммунитет беременной женщины. М.: Медицинская книга; Н.Новгород: Изд-во НГМА, 2003. 226 с.
9. Шур Н.Н., Тараненко Л.А., Черешнев В.А. и др. Динамика иммунологических показателей у больных злокачественными опухолями при комбинированной и монотерапии препаратом «Профеталь» // Иммунология Урала. 2005. № 1 (4). С. 159-161.
10. Abelev G.I. Production of embryonal semur alphafetoprotein by hepatomas: review of experimental and clinical data // Cancer Res. 1968. Vol. 28. P 1344-1350.
11. ButterfieldL. H., Meng W.S., Koh A. et al. T-cell responses to HLA-A*0201-restricted peptides derived from human alphafetoprotein // J. Immunol. 2001. Vol. 166, № 8. P. 5300-5308.
12. Dudich E.I., Semenkova L.N., Dudich l.V et al. Alpha-fetoprotein-induces apoptosis of cancer cells // Bull. Exp. Biol. Med. 2000. Vol. 130, № 12. P. 1127-1133.
13. Fujiwara Т., Grimm E. A., Cai D. W. A retroviral wild type p53 expression vector penetrates human lung cancer spheroids and inhibits growth by including apoptosis // Cancer Res. 1993. Vol. 53. P. 4129-4133.
14. Hirai H., Taga H., Kaneda H. et al. // Human tumor
markers: Biol.Clin. Appl. Proc. 3 rd Int. Conf., Lacco Ameno d’Ischia, Naples. 1986. Berlin; New Jork, 1987. P 181-201.
15. Hooper D. C., Cohen B. L., Ducas D. et al. Selective inhibition of murine T-cell proliferation and lymphokine-activated natural killer cell function by AFP // Biological activities of alphafetoprotein. 1987. Vol. 1. P. 153-167.
16. Hsourigui M., Thabie N., Martin M.E. et al. In vivo transient rise in plasma free fatty acids alters the functional properties of alpha-fetoprotein // Biochim Biophys Acta. 1992. Vol. 1125. P. 157-165.
17. Laborda J., Naval J., Allouche M. et al. Specific uptake of alpha-fetoprotein by malignant human lymphoid cell // Int. J. Cancer. 1987. Vol. 40. P. 314-318.
18. Mizejewski GJ. Alpha-fetoprotein as a biologic response modifier: Relevance to domain and subdomain ctructure. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1997. Vol. 215. P. 333-362.
19. Semenkova L.N., Dudich E.I., Dudich I. V. Induction of apoptosis in human hepatoma cells by alpha-fetoprotein // Tumour Biol. 1997. Vol. 18, № 5. P. 261-273.
20. Thompson С. В. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science. 1995. Vol. 267. P. 1456-1462.
21. Torres J.M., Laborda J., Darracq N. et al. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation // Mol. Immunol. 1989. Vol. 26. P. 851857.
Поступила 19.03.06
