CC BY
69
УДК 543.545.2
Павлова О.В., Калистратова А.В., Офицеров Е.Н.
К ПРОБЛЕМЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКВАЛЕНА В МАСЛЕ РАСТЕНИЙ РОДА АМШАШНиБИ ПРОДУКТАХ ЕГО ТРАНСФОРМАЦИИ
Павлова Ольга Валерьевна, аспирант 4 курса кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов Калистратова Антонида Владимировна, к.х.н., доцент кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов Офицеров Евгений Николаевич, д.х.н., профессор кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов; email: [email protected]
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия.
Масло амаранта является ключевым источником для получения сквалена, интересного с точки зрения использования в лекарственных и косметических средствах. Метод тонкослойной хроматографии подходит для экспресс-идентификации сквалена и может быть рекомендован для рутинного анализа в различных видах продукции его переработки.
Ключевые слова: сквален, амарантовое масло, тонкослойная хроматография (ТСХ), количественное и качественное определение, стандартизация метода.
ON THE PROBLEM OF DDETERMINING SQUALENE IN THE OIL OF PLANTS OF THE GENUS AMARANTHUS AND THE PRODUCTS OF ITS TRANSFORMATION
Pavlova Olga Valerevna, Kalistratova Antonida Vladimirovna, Ofitserov Evgeniy Nikolaevich
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
Amaranth oil is a key source for squalene which is used as a component for drugs and cosmetics. The thin-layer chromatography is a suitable express-method for squalene determination. This method can be recommended for routine analysis in various types of amaranth oil by products.
Keywords: squalene, amaranth oil, thin-layer chromatography (TLC), quantitative and qualitative determination, standardization of the method.
Введение
Амарантовое масло, получаемое из семян растений рода Amaranthus, является перспективным и ключевым источником для получения сквалена (рис. 1) - природного соединения тритерпенового ряда, обладающего широким спектром биологической активности. Сквален используют как биологически активную добавку к пище, компонент лекарственных средств, в косметике и в составе вакцин в качестве адъюванта вместо токсичного гидроксида алюминия. На его основе разрабатываются невирусные векторы для генной терапии и целый ряд новых инновационных лекарственных средств против рака и тяжелых вирусных заболеваний. Гидрированное производное сквалена - сквалан используется в качестве лубриканта или смазочных масел для всех вращающихся частей компьютеров, ноутбуков, а также в ГЖХ в качестве фазы.
Рис. 1. Структурная формула сквалена Растительные источники сквалена, такие как оливковое, подсолнечное, рапсовое и соевое масла содержат его в небольшом количестве, менее 0,5%, а добыча сквалена из животного источника - масла печени глубоководных акул [1] - стремительно сокращается, из-за мер по защите морских животных и угрозе высокого содержание тяжелых металлов и пестицидов в конечном продукте. Альтернативным источником сквалена, который не требует больших
затрат, является масло амаранта, в котором содержание сквалена, в зависимости от вида или сорта, составляет от 2,4 до 15,0 %. На данный момент многие компании в России активно занимаются получением масла амаранта (ООО «Русская олива», ООО Концерн «ОИТ», ООО «Агроолеум», ООО «Лакшми Энтепрайзис» и др.), что говорит о достаточном количестве субстанции для получения сквалена. Но при разработке технологии его выделения из масла амаранта мы столкнулись с проблемой отсутствия простого и доступного экспресс метода количественного и качественного определения содержания сквалена как в сырье, так и в готовой продукции, а так же оценки качества сырья в фермерских хозяйствах и агропромышленных холдингах.
Существующие методы идентификации скалена (ВЭЖХ и ГХ) в масле амаранта не подходят для рутинного использования из-за достаточно высокой стоимости оборудования и расходных материалов, в том числе дорогостоящих растворителей высокой степени очистки. Поэтому нами разработан экспресс-метод качественного и количественного анализа сквалена в масле амаранта с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) (восходящим способом на пластинках с силикагелем) с применением компьютерного анализа пятен хроматограмм в программе 7Рогш. Программа разработана на базе РХТУ им. Менделеева, расчет концентрации производится на основании определения площади пятна.
Качественный анализ сквалена
Анализ сквалена проводили на пластинах с силикагелем марки Sorbffl. Они хорошо подходят для проведения стандартных анализов, обеспечивают воспроизводимость и пятна долго не выцветают.
С целью подбора оптимального элюента на первом этапе нами было проведено сравнение растворителей и их смесей для элюирования раствора масла. Описанное ранее использование смеси гептана и бензола для определения сквалена в амарантовом масле в соотношении 9:1 [2] не подходит для ежедневного рутинного анализа из-за высокой токсичности бензола. Сравнительный анализ таких элюентов как гептан, хлороформ и смесь гексан:этилацетат не показали должных
Использование в качестве элюентов смесей гекссан:хлороформ в соотношении 7:1, 5:1, 3:1 и 2:1 обеспечивает оптимальное значение ИХ сквалена на хроматограмме. Максимальные значения числа теоретических тарелок (Ы) среди представленных хроматограмм получены для систем гексан:хлороформ 3:1 и 1:1, а минимальные значения высоты теоретической тарелки (Н) для систем гексан:хлороформ 3:1 и 2:1.
результатов с точки зрения разделения веществ. При подборе элюирующей системы использовались: гексан; гексан:хлороформ (10:1); гексан:хлороформ (7:1); гексан:хлороформ (5:1); гексан:хлороформ (3:1); гексан:хлороформ (2:1); гексан:хлороформ (1:1); гексан:хлороформ (1:2); гексан:хлороформ (1:3) (таблица 1).
Для каждой системы было проведено не менее 3 экспериментов, на основании которых рассчитаны средние показатели ИГ сквалена, оптимальное значение которого должно быть от 0,3 до 0,7; число теоретических тарелок (Ы), высота теоретической тарелки (Н) и фактор удерживания или коэффициент емкости (К).
Линейные изотермы сорбции сквалена характерны только для систем 5:1, 3:1 и 2:1, так как для данных систем зоны хроматографирования имели округлую форму.
По совокупности всех рассмотренных характеристик оптимальный состав элюента для качественного анализа сквалена в масле амаранта методом ТСХ - это смесь гексан:хлороформ в соотношение 3:1.
Таблица 1. Пример хроматограмм и хроматографические параметры сквалена в различных элюирующих системах
Элюент Гексан Гексан : Хлороформ (10 : 1) Гексан : Хлороформ (7 : 1) Гексан : Хлороформ (5 : 1) Гексан : Хлороформ (3 : 1)
Хрома-тограмма
Обозна-чение (слева-направо) Стандартные растворы сквалена 1 - 0,85 мг/мл; 2 -1,70 мг/мл; 4 - 4,25 мг/мл; 5 - 8,49 мг/мл 3 - раствор масла амаранта в гексан: хлорофом (10:1), разбавленный в 10 раз
К, 0,13 ± 0,005 0,23 ± 0,010 0,30 ± 0,005 0,45 ± 0,008 0,48 ± 0,007
К 6,69 3,35 2,33 1,22 1,08
N 11,11 92,99 136,11 238,04 348,44
И, мм 0,054 0,015 0,013 0,011 0,008
Элюент Гексан : Хлороформ (2 : 1) Гексан : хлороформ (1 : 1) Гексан : хлороформ (1 : 2) Гексан : хлороформ (1 : 3)
Хрома-тограмма Л
Обозначение (слева-направо) Стандартные растворы сквалена 1 - 0,85 мг/мл; 2 -1,70 мг/мл; 4 - 4,25 мг/мл; 5 - 8,49 мг/мл 3 - раствор масла амаранта в гексан: хлорофом (10:1), разбавленный в 10 раз
К, 0,70± 0,010 0,83± 0,006 0,82 ±0,010 0,89 ±0,007
К 0,43 0,21 0,22 0,12
N 522,45 324,00 292,10 236,69
И, мм 0,008 0,014 0,016 0,021
В качестве детектирующего реагента выбран йод и 5%-ый метанольный раствор фосфорномолибденовой кислоты. Йод является специфическим реагентом на непредельные углеводороды, к классу которого относится сквален. Для фиксации пятен на продолжительный период времени был использован 5%-ый метанольный раствор фосфорномолибденовой кислоты взамен ранее описанного в литературе 5%-ого этанольного раствор фосфорномолибденовой кислоты [2] из-за его способности быстрее испаряться с поверхности и тем самым меньше влиять на размытие хроматографических зон, что необходимо для количественной обработки пятен.
Количественный анализ сквалена.
Для количественного анализа сквалена в масле амаранта методом ТСХ нами был выбран метод абсолютной градуировки. В работе Дейнеки с соавт. [3] при построении калибровочных кривых использовалась площадь пятна. Однако, распределение вещества по площади пятна нелинейно: в центре концентрация вещества выше, чем по краям. Поэтому в зависимости концентрации от площади пятна не должно быть линейности. В связи с этим для построения калибровочного графика мы использовали логарифмическую зависимость концентрации сквалена от площади его пятна на хроматограмме. В качестве стандартных растворов использовали раствор сквалена в смеси гексан:хлороформ (10:1) в диапазоне концентраций от 0,01 мг/мл до 100 мг/мл с шагом 10 или 2. Количество повторностей не менее 3. На рисунке 2 приведен пример калибровочной хроматограммы, где содержание стандартного раствора сквалена составляет: 84,94 мг/мл; 8,49 мг/мл; 4,25 мг/мл; 1,70 мг/мл; 0,85 мг/мл.
•им
Рис. 2. Пример калибровочной хроматограммы (растворитель гексан:хлороформ 3:1)
Стандартизация нанесения проб и проведение анализа.
При использовании традиционного метода стандартизации путем нанесения линии старта на пластину, наблюдается деформация тонкого слоя сорбента, тем самым искажаются условия элюирования. Кроме того, использование автосемплеров (САМА^ IATROSCAN МК^) не подходит для 1-2 проб.
Для стандартизации нанесения проб был разработан шаблон из оргстекла, который позволял в аутентичных условиях наносить дозированные пробы в определенные места пластины без искажения результатов с помощью
хроматографического шприца на 1 мкл.
Заключение
Наиболее подходящие растворители для идентификации сквалена в масле амаранта - смесь гексан:хлорформ (3:1). Чувствительность
разработанного метода составляет до 0,01 мг/мл сквалена. Процесс хроматографирования лучше всего проводить на пластинах марки Sorbfil. В качестве детектирующего реагента подходит йод, для фиксации пятен на долгий период времени - 5%-ый метанольный раствор фосфорномолибденовой кислоты.
Разработанный метод и полученные данные по качественному и количественному определению сквалена в масле амаранта с помощью тонкослой хроматографии может быть рекомендован для использования при промышленном производстве амарантового масла и для проведения рутинного анализа для определения сквалена в различных видах продукции.
Список литературы
1. Popa O., Bäbeanu N., Popa I. Methods for Obtaining and Determination of Squalene from Natural Sources // Biomed Res. Int. - 2015. - Vol. 2015 - P. 1 - 1б.
2. Н.Я.Мокшина, А.А. Назарова, В.Ф. Селеменев, Е.Ф.Сафонова.
Выбор оптимальных параметров определения сквалена методом хроматографии в тонком слое.// Аналитика и контроль. - 200б - Т.10 -выпуск 1 - C. 17 - 19.
3. Дейнека Л.А. et al. Определение сквалена в семенах некоторых растений семейства Amaranthaceae // Химия растительного сырья. -2008. - № 4. - С. 69 -74.
4. Мартыненко Л.И. Неорганическая химия. Ч. 2. -М.: Изд-во МГУ, 1994. - 624 с.
5. Гутман В. Химия координационных соединений в неводных растворах. - М.: Мир, 1971. -220 с.
6. Бургер К. Сольватация, ионные реакции и комплексообразование в неводных средах. - М.: Мир, 1984. -
7. Marcus Y., Hefter G. Ionic partial molar heat capacities in non-aqueous solvents // J. Chem. Soc. Faraday Trans. - 199б. - V. 92. - P. 757-7б1.
8. Marcus Y., Hefter G. Standard partial molar volumes of electrolytes and ions in nonaqueous solvents // Chem. Rev. -2004. - V. 104. -P. 3405-3452.
9. Marcus Y. Ion sоlvation. - Chichester etc.: Wiley, 1985. -30б p.
10. Сафонова Л.П., Кинчин А.Н., Колкер А.М. Теплоемкость ионов в неводных растворах //Ж. физ. химии. -1999. - Т.73, №12. - С. 2154-2159.
11. Крестов Г.А., Виноградов В.И., Кесслер Ю.М. Современные проблемы химии растворов.- М.: Наука, 1986.
12. Крестов Г.А., Новосёлов Н.П., Перелыгин И.С., Колкер A.M., Сафонова Л.П., Овчинникова В.Д., Тростин В.Н. -Ионная сольватация.- М.: Наука, 1987. - 320 с.
13. Достижения и проблемы теории сольватации. Структурно-термодинамические аспекты / Под ред. A.M. Кутепова.- М.: Наука, 1998. - 247 с.
