CC BY
44
УДК 547.968.4:612.017
Ю. А. Кривенцев, Р. А. Бисалиева, А. И. Носков Астраханская государственная медицинская академия
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЕТЕРГЕНТОВ НА ЭМБРИОНАЛЬНЫЙ ГЕМОГЛОБИН
Эмбриональный гемоглобин (НЬР) синтезируется в раннем эмбриогенезе в эмбриональном желточном мешке и находится в эритроцитах зародыша с 5 по 18 неделю эмбрионального развития. Если эмбриональные гемоглобины обнаруживаются в крови новорожденного, это является признаком врожденных аномалий развития [1-4]. Для количественного анализа НЬР колориметрические методы неприменимы в силу их низкой селективности. Определение НЬР в современной клинической практике используют крайне редко, т. к. его синтез у взрослого человека и ребенка полностью репрессирован. Но существует ряд патологических состояний, при которых возможна активация генов НЬР [1, 2, 5, 6]. Поскольку до сих пор сведения о НЬР в научной литературе крайне скудны, целью исследований являлось пополнение сведений о физико-химических свойствах НЬР.
Материал и методы
Исходным биоматериалом служили:
— абортивный материал сроком 7-9 недель (отделение неонатологии 5-й городской больницы);
— очищенный препарат НЬР, полученный по самостоятельно разработанной схеме (гомогенизация тканей, щелочное осаждение с сульфатом аммония и ионообменная хроматография на ДЕАЕ-сефадексе 0-50);
— коммерческий препарат сывороточного альбумина человека.
В ходе исследований использовали следующие биохимические и иммунохимические методы: гомогенизация, центрифугирование, высаливание, электрофорез в полиакриламидном геле, иммуноэлектрофорез, концентрирование фракций, диализ, ионообменная хроматография, гель-фильтрация, радиальная иммунодиффузия. Основная методика работы -электрофорез в агаровом геле. Электрофорез проводили в приборе ПЭФ-3. Условия аналитического электрофореза: 1 % агар «Дифко», приготовленный на цитратном буфере, рН 6,0 с ионной силой 0,1 моль/л (лимонная кислота 0,1 М раствор - 40,5 мл; лимоннокислый натрий 0,1 М раствор 59,5 мл). Электрофоретическое разделение проводили при силе тока 50 мА и напряжении 200 В в течение 1,5-2 часов.
Было исследовано действие детергентов на НЬР. После 60-минутной экспозиции раствора НЬР с гидрофобными или полярными веществами (тритон, додецилсульфат натрия (ДСН), мочевина, бихромат калия) проводили аналитический электрофорез. Результаты показали, что действие тритонов различных видов снижает электрофоретическую подвижность
НЬР, мочевина и бихромат калия не изменяют электрофоретической подвижности НЬР, но делают его фракцию гетерогенной. Додецилсульфат натрия меняет вектор электрофоретической подвижности НЬР на противоположный и, кроме того, увеличивает скорость движения этого белка.
Для уточнения природы воздействия ДСН на НЬР был проведен сравнительный электрофоретический анализ действия данного вещества на НЬР и белки сыворотки крови здоровых доноров (преимущественно альбумин). На электрофореграмме (рис.) видно, что ДСН также меняет направленность движения сывороточных белков человека, но электрофоретическая подвижность НЬР, обработанного ДСН, значительно превышает таковую у альбумина (также обработанного ДСН). Если учесть, что в нативном состоянии при электрофорезе в агаре НЬР движется значительно медленнее альбумина ф-зона), а молекулярная масса этих белков практически равна (68-70 кДа), то напрашивается очевидный вывод: обработка НЬР додецилсульфатом натрия, по-видимому, приводит к диссоциации тетрамерной молекулы НЬР на димеры или даже на мономеры. Изменение же направления движения многих белков, обработанных ДСН, на противоположное отмечено в научной литературе [4] и объясняется тем, что анионы, образующиеся в водных растворах, при диссоциации ДСН активно сорбируются на белковые глобулы и придают им значительный отрицательный заряд, обеспечивая их движение к аноду.
Электрофореграмма воздействия ДСН на НЬР и белки сыворотки крови:
1 - альбумин; 2 - НЬР; 3 - альбумин + ДСН; 4 - НЬР + ДСН; 5 - НЬГ;
6 - НЬР + ДСН; 7 - НЬГ + ДСН; 8 - сыворотка крови + ДСН
При проведении процедуры обессоливания на колонке с сефадексом 0-25 (0,07 М фосфатный буфер, рН - 7,7) был зарегистрирован следующий феномен: при внесении в колонку смеси солевого препарата гемоглобина с бихроматом калия (цветной свидетель движения солей) красная
зона гемоглобина вначале двигалась вместе с оранжевой зоной бихромата калия, но затем прекращала свое движение и совершенно останавливалась в верхней части столба геля.
Контроль выхода белка проводили биуретовым методом. Показано, что белковая фракция элюировалась, как и должно, задолго до оранжевой зоны бихромата калия. Проведением бензидиновой реакции было доказано, что эта фракция обладает высокой каталазной активностью (характерной для гемоглобина).
Выводы
1. Действие тритонов различных видов снижает электрофоретическую подвижность НЬР, мочевина и бихромат калия не изменяют электрофоретической подвижности НЬР, но делают его фракцию гетерогенной.
2. Впервые показано, что додецилсульфат натрия меняет вектор электрофоретической подвижности НЬР на противоположный и, кроме того, увеличивает скорость движения этого белка.
3. Впервые показано, что электрофоретическая подвижность НЬР, обработанного ДСН, значительно превышает таковую у альбумина. Это косвенно свидетельствует о диссоциации тетрамерной молекулы НЬР на димеры или даже на мономеры.
4. Впервые зарегистрировано, что скорость элюции НЬР (на сефа-дексе 0-25), обработанного раствором бихромата калия, значительно превышает таковую у нативного НЬР.
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Валкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. - М.: Медицина, 1980. - 132 с.
2. Карпищенко А. И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справ. - Т 1. - СПб.: Интер-Медика, 1998. - 144 с.
3. Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Ю. А. Кривенцев, Р. А. Бисалиева, Д. М. Никулина и др. // Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины: Материалы Междунар. конф. - Астрахань - Волгоград - Москва, 2006. - С. 58-62.
4. Стародуб Н. Ф., Назаренко В. И. Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / АН УССР, Ин-т молекулярной биологии и генетики. - Киев: Наук. думка, 1987. - 198 с.
5. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. - СПб.: ООО «ЭЛБИ-СПб.», 2000. - 384 с.
6. Зайчик А. Ш., Чурилов Л. П. Основы патохимии / СПб.: ООО «Элби-СПб.», 2000. - 229 с.
Получено 31.10.2006
THE RESEARCH OF THE INFLUENCE OF DETERGENTS ON EMBRYONIC HEMOGLOBIN
Yu. A. Kriventsev, R. A. Bisalieva, A. I. Noskov
The influence of different detergents (triton, sodium dodecyl sulfate, urea, potassium dichromate) on the embryonic hemoglobin (HbP) in the process of electrophoresis in the agar gel and during chromatographic division has been studied in the work. It is shown that the action of tritons of different species decreases the electrophoretic mobility of HbP, but urea and potassium dichromate do not change the electrophoretic mobility of HbP, but make its fraction heterogenic. Sodium dodecyl sulfate changes the vector of electrophoretic mobility of HbP on the opposite one and increases the speed of its migration. It is shown that sodium dodecyl sulfate changes the moving direction of human serum proteins, but electrophoretic mobility of HbP, processed by sodium dodecyl sulfate, is much higher then albumin has.
