CC BY
49
УДК 612.1
Н. И. Микуляк, Ю. А. Кинзирская, А. И. Микуляк, Л. В. Ионичева
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭТИЛМЕТИЛГИДРОКСИПИРИДИН ГЕМИСУКЦИНАТА НА ГЕМОСТАЗ
Изучено влияние нового антиоксиданта, производного 3-оксипиридина, близкого по химической структуре к мексидолу, - этилметилгидроксипиридин гемисукцината на гемостаз животных. Показано, что исследуемый препарат как и мексидол, оказывает сходное влияние на гемостаз, но с менее выраженным цитопротекторным действием.
Работы по созданию новых противоопухолевых средств направлены на получение таких препаратов, которые при максимально ингибирующем воздействии на опухолевые клетки минимально повреждали бы нормальные клетки и ткани организма. Несмотря на успехи молекулярной биологии, генетики, биохимии и вирусологии опухолей, до настоящего времени отсутствуют сведения об особенностях биологии опухолевой клетки, позволяющие четко сформулировать предпосылки создания противоопухолевых препаратов [1-3].
В настоящее время считается доказанным, что в патогенезе возникновения злокачественных новообразований заложены механизмы активации окислительных процессов [4-9], сопровождающиеся угнетением антиокси-дантной защиты [10]. Из этого следует, что одним из путей предотвращения возникновения заболеваний, сопряженных с окислительным стрессом, является усиление антиокислительных возможностей организма за счет экзогенного введения антиоксидантов [11, 12]. Актуальность проблемы определяет повышенный интерес к созданию новых эффективных лекарственных средств. Свободно-радикальная концепция канцерогенеза обосновывает потребность в препаратах, способных нормализовать активность антиоксидантной защиты и тем самым повышать резистентность неповрежденных тканей к токсическому воздействию химиопрепаратов [13].
Одним из перспективных путей снижения токсичности лекарственных препаратов является использование переносчиков естественных биологически активных веществ-регуляторов кроветворения, в частности гемопоэтиче-ских ростковых факторов [14-18]. Изучается влияние рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, активно используются иммуномодуляторы - интерферон, лейкинферон [19-23]. Между тем при выборе методов коррекции основных побочных эффектов противоопухолевых средств - явлений тошноты, рвоты, угнетения костномозгового кроветворения, алопеции, кардиотоксичности и гепатотоксичности - следует учитывать тот факт, что в основе токсического действия препаратов лежит их мембранодеструктивное действие [24-27].
Целью настоящего исследования явилось изучение возможности фармакологической коррекции побочных эффектов при проведении химиотерапевтического лечения. Установление роли ПОЛ в канцерогенезе и повреждении гомеостатических структур определило место антиоксидантов в профилактике как опухолевых заболеваний, так и осложнений цитостатической терапии. Появление нового типа водорастворимых антиоксидантов, производных 3-оксипиридина, обладающих широким спектром действия при различ-
ных патологических состояниях, явилось основанием для применения с целью коррекции побочного действия цитостатических лекарственных средств.
Нами изучалось влияние аналога производного 3-оксипиридина - мек-сидола, синтезированного этилметилгидроксипиридина гемисукцината на систему гемостаза.
Эксперименты были проведены на кроликах-самцах породы шиншилла, массой 2,5-З,0 кг. В опытах использовали животных, не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из десяти животных в каждой. Все исследования проводили в одно и то же время суток, с 8 до 12 часов, с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, Франция, 1986).
Выполнено две серии опытов, в которых изучалась реакция системы крови на фоне фармакологической коррекции этилметилгидроксипиридин гемисукцинатом, а также группа животных, которая служила контролем. Этилметилгидроксипиридин гемисукцинат вводили по 5 мг/кг внутривенно через день в течение 29 суток.
Во всех сериях венозную кровь забирали на 8-е, 15-е, 22-е и 29-е сутки опыта из краевой вены уха кроликов. Исследовали абсолютное число тромбоцитов в 1 мкл крови по унифицированной методике в камере Горяева. Костный мозг брали при помощи асептической аспирации иглой Кассирского и шприцом (обезвоженными) из подвздошной кости под местным обезболиванием 2,5 мл 2 % раствором новокаина. Исследовали абсолютное количество мегакариоцитов, абсолютное и относительное количество кроветворных клеток в состоянии митотического деления. Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами (по В. В. Меньшикову, 1987). Систему гемостаза изучали по унифицированным методикам:
- определение времени свертывания цельной крови;
- определение активированного парциального (частичного) тромбопла-стинового времени (АЧТВ) по J. Caen et al. (1968);
- аутокоагуляционный тест (АКТ) по Brekarda et al. (1965), разработанный и модифицированный Л. З. Баркаганом (1972);
- определение протромбинового времени по A. J. Qwick (1935);
- определение фибриногена по М. В. Рамплинг и П. Гаффней;
- определение тромбинового времени по R. M. Biggs, R. G. Macfarlane (1962);
- орто-фенантролиновый тест по В. А. Елыкомову, А. П. Момоту (1987);
- определение активности антитромбина III по V. Abildgaard et al. (1970) в модификации К. М. Бишевского (1983);
- Хагеман-зависимый фибринолиз по Г. Ф. Еремину, А. Г. Архипову (1982);
- естественный лизис фибринового сгустка по М. А. Котовщиковой и Б. И. Кузнику (1962);
- агрегация тромбоцитов под влиянием АДФ;
- агрегация тромбоцитов с универсальным индуктором агрегации (УИА);
- агрегация тромбоцитов с ристомицином по А. С. Шитиковой (1980). Все указанные методы исследования гемостаза изложены в [28-31].
Статистическую обработку результатов экспериментальных исследований проводили с помощью г-критерия Стьюдента (В. Я. Гельман, 2002) на персональном компьютере IBM PC/Pentium с использованием программы Microsoft Excel и применением поправки Бонферрони. Проверка нормальности распределения ввиду относительно малого количества данных производилась визуально по графикам на вероятностной бумаге, и наблюдавшаяся близость экспериментальных точек к прямой линии позволила не отвергать гипотезу о нормальности распределения. Вычисляли среднюю арифметическую выборочную (М), ошибку средней арифметической (m) и коэффициент достоверности (г). Степень достоверности различий показателей определяли в каждой серии во все периоды исследования через 8 суток воздействия, через 15 суток, через 22 дня и 29 суток относительно контроля (р) (таблица 1). Явление считали достоверным прир < 0,05 (0,01; 0,001).
Изучение гемостаза при введении этилметилгидроксипиридина геми-сукцината показало, что время свертывания крови на 8-е, 15-е сутки укорачивалось на 13,5 и 17 %, на 22-е сутки удлинялось на 20,5 %, к концу эксперимента, на 29-е сутки, снижалось и определялось ниже значений контроля. О первой фазе гемостаза - протромбинообразовании - судили по определению каолин-кефалинового времени и аутокоагуляционному тесту. Определение активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени показало стойко стабилизированное АЧТВ в течение всего эксперимента, которое не выходило за пределы контрольного АЧТВ. Для оценки максимальной тромбопластин-тромбиновой активности крови был использован аутокоагуляционный тест с определением времени достижения максимальной свертывающей активности. Время достижения максимальной активности свертывания удлинялось на 22,9 % через неделю после введения антиоксиданта, на 47,37 и 52,4 % на 15-е и 22-е сутки. К концу эксперимента отмечалось резкое укорочение АКТ в четыре раза относительно 22-х суток и в
1,5 раза относительно контроля. О второй фазе - тромбинообразовании - судили по протромбиновому времени, что характеризует внешнее свертывание. Протромбиновый индекс удлинялся во все периоды исследования с максимальным увеличением на 22-е сутки на 16,2 % (р < 0,001), что коррелирует с количественным изменением фибриногена. О третьей фазе - фибринообразо-вании - судили по количеству фибриногена и определению тромбинового времени. Количество фибриногена при введении этилметилгидроксипиридина гемисукцината стабильно повышалось в течение исследуемого периода: на 14,4 % (р < 0,05) при первом исследовании, на 30,7% (р < 0,001) при втором, на 60,7 % (р < 0,001) при третьем и на 52 % (р < 0,001) в конце эксперимента. Имело тенденцию к удлинению тромбиновое время на 12,7 % (р < 0,05) через неделю, на 19,2 % (р < 0,001) на второй неделе, с приближением к норме на третьей и четвертой неделе, что коррелирует с увеличением уровня фибриногена в эти периоды. О посткоагуляционном гемостазе судили по определению эуглобулинового и Хагеман-зависимого фибринолиза. Время лизиса замедлялось на второй неделе эксперимента на 16,6 % при определении эугло-булиновым методом и на 5,3 % Хагеман-зависимым фибринолизом относительно контроля.
Таблица 1
Изучение влияния этилметилгидроксипиридина гемисукцината на гемостаз крови кроликов в динамике
Коагулограмма Контроль 8-е сутки 15-е сутки 22-е сутки 29-е сутки
Время свертывания, мин 4,92 ± 0,07 4,17 ±0,03 р < 0,001 4,01 ±0,09 /7 < 0,001 5,93 ±0,13 р < 0,001 4,4 ±0,1 /7 < 0,001
Каолин-кефалиновое время, с 29,65 ± 0,43 30,75 ± 0,83 30,09 ± 0,8 31,4 ± 1,76 29,4 ± 1,54
Аутокоагулограмма, с 12,2 ±0,26 15 ± 1,13 р < 0,05 18,03 ±0,65 р< 0,001 18,6 ±0.16 р < 0,001 8,3 ±0,14 р < 0,001
Протромбиновое время, % 100,2±2,17 108,25± 1,24 р < 0,05 105,6±1,1 р < 0,05 116,25±1,16 /7 < 0,001 108,8±0,69 р < 0,05
Фибриноген, г/л 3,67 ±0,13 4,2 ±0,12 р < 0,05 4,8 ± 0,25 /7 < 0,001 5,9 ±0,53 р < 0,001 5,58 ±0,36 < 0,001
Тромбиновое время, с 12,58 ±0,17 14,18 ±0,47 р < 0,05 15 ± 0,36 /7 < 0,001 12,74 ±0,83 11,57 ±0,26 р < 0,05
Эуглобулиновый фибринолиз, мин 206 ± 4,9 194,4 ± 2,27 240 ± 8,98 р < 0,05 191,1 ±9,35 160 ± 13,03 р < 0,05
Хагеман-зависимый фибринолиз, мин 10,78 ± 0,74 7,7 ±0,39 р < 0,05 11,36 ±0,53 6,98 ± 1,14 р < 0,05 5.31 ±0,99 р < 0,001
О-фенантролиновый тест, х 10 2/ л 5,8 ±0,3 5,3 ±0,16 8.42 ± 0,73 р < 0,05 6,5 ± 0,22 6 ±0,11
Антитромбин III, % 102,7 ±3,19 90,74 ± 2,27 р < 0,05 115 ±2,51 р < 0,05 126 ±0,83 р < 0,001 107 ±5,02
Агрегационная активность тромбоцитов с АДФ, с 12 ±0,3 15,2 ±0,4 р < 0,001 17,3 ±0,34 р <0,001 16 ±0,24 р < 0,001 27 ± 0,59 р < 0,001
УИА, % 106 ± 1,42 85,87 ± 1,9 Р< 0,001 94,78 ± 1,68 р < 0,001 94 ± 1,4 /7 < 0,001 33,3 ± 3,23 р < 0,001
Агрегация с ристомицином, с 11 ± 0,07 12,6 ±0,01 14,3 ±0,03 /7 < 0.001 11,6 ±0,01 13,3 ±0,07 /7 < 0.001
Тромбоциты,л 286.89 ±8,41 211,1 ±2,6 р < 0,05 201,1 ±2,61 р < 0,05 220 ± 7,64 < 0,001 211 ±2.61 р < 0,05
Мегакариоциты, л 138,59 ±8,14 37,5 ± 1,61 р < 0,001 236,88 ± 57,63 р < 0,05 3028 ±351,53 р < 0,05 61,88 ±7,98 р < 0,05
Примечание, р - относительно контроля.
№ 1, 2008 Медицинские науки. Теоретическая и экспериментальная медицина
К третьей неделе фибринолиз приходил в пределы нормы с последующей активацией к концу эксперимента на 32,3 % (р < 0,05) при определении эуглобулинов и на 56,4% (р < 0,001) Хагеман-зависимый фибринолиз. С целью выявления растворимых фибрин-мономерных комплексов, являющихся индикатором ДВС-синдрома, использовали орто-фенантролиновый тест. Повышение уровня РФМК было характерно только на 15-е сутки. В течение всего остального периода исследования РФМК соответствовали контрольным цифрам. Антикоагуляционную активность плазмы исследовали по определению гепарин-кофакторной активности антитромбина III. При введении этил-метилгидроксипиридина гемисукцината активность АТ III увеличивалась на
11,9 % (р < 0,05) на 15-е сутки и на 22,6 % (р < 0,001) на 22-е сутки относительно уровня контроля. Для исследования нарушений тромбоцитарного гемостаза изучали агрегационную активность тромбоцитов с АДФ и проводили экспресс-оценку с универсальным индуктором агрегации (УИА). В течение всего экспериментального периода отмечалось замедленное образование агрегатов с УИА, что предполагает более низкую активность тромбоцитов. Время агрегационной активности тромбоцитов с АДФ было также выше нормы (удлинялось) в течение всего периода наблюдения. При введении этилметилгидроксипиридина гемисукцината имело место снижения количества тромбоцитов в периферической крови и мегакариоцитов в костном мозге. Курс вливаний этилметилгидроксипиридина гемисукцината вызывал умеренное уменьшение количества тромбоцитов в венозной крови - от 286,89 ± 8,41х103/мкл до 211,11 ± 2,61х103/мкл (р < 0,05). Количество мегакариоцитов на 8-е сутки резко снижалось, содержание мегакариоцитов в пунктате уменьшилось от 138,59 ± 8,14/мкл до 37,50 ± 1,61/мкл (р < 0,001), но в дальнейшем уровень их возрастал, на 15-й и 22-й день показатель достоверно поднялся соответственно до 236,88 ± 57,63/мкл и 3028,00 ± 351,53/мкл, на 29-е сутки 1 мкл пунктата содержал не более 61,88 ± 7,98 мегакариоцитов.
Выводы
Таким образом, этилметилгидроксипиридин гемисукцината стабилизирует процесс гемокоагуляции как по внешнему, так и по внутреннему механизму образования протромбиназы, повышает уровень фибриногена, замедляет все фазы свертывания крови, активирует фибринолиз, повышает анти-коагуляционную активность плазмы. При введении этилметилгидроксипири-дина гемисукцината имет место снижение количества тромбоцитов в периферической крови и мегакариоцитов в костном мозге, а также угнеталась аг-регационная активность тромбоцитов. Антиоксидант нового поколения можно рекомендовать при патологических процессах, сопровождающихся повышенной активностью гемокоагуляционного потенциала.
Список литературы
1. Богуш, Т. А. Снижение токсичности и повышение эффективности противоопухолевой химиотерапии путем коррекции активности монооксигеназ печени: от эксперимента - в клинику / Т. А. Богуш, Е. А. Богуш, Л. А. Дурнов [и др.] // Вестник РАМН. - 2002. - № 1. - С. 37-41.
2. Переводчикова, Н. И. Место химиотерапии в системе лечения онкологических больных и выбор терапевтической тактики / Н. И. Переводчикова // Современная онкология. - 2001. - Т. 3. - № 2.
3. Переводчикова, Н. И. Противоопухолевая химиотерапия / Н. И. Переводчикова. - М., 1993. - С. 4-208.
4. Киреев, Г. В. Зависимость перекисного окисления липидов при раке желудка от размеров опухоли / Г. В. Киреев, О. Ю. Баленков, Ф. К. Шарипов [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - № 12. - С. 20-34.
5. Корман, Д. Б. Рак молочной железы и ненасыщенность липидов крови / Д. Б. Корман, С. Л. Потапов // Вопросы онкологии. - 1997. - Т. 43. - № 2. -С.165-170.
6. Горожанская, Э. Г. Некоторые особенности механизма антиоксидантной защиты в доброкачественных и злокачественных опухолях печени и яичников /
Э. Г. Горожанская, Н. Е. Кушлинский, Е. Н. Королева [и др.] // I съезд онкологов стран СНГ : тез. докл. - М., 1996. - С. 81-82.
7. Рудой, С. В. Эффективность сочетанного применения непрямой электрохимической детоксикации крови гипохлоридом натрия при паллиативной химиолуче-вой терапии онкологическим больным / С. В. Рудой // Паллиативная медицина и реабилитация. - 1997. - № 2. - С. 13-16.
8. Ларионова, В. Б. Современные возможности улучшения непосредственных результатов хирургического лечения онкологических больных / В. Б. Ларионова, Н. Е. Кушпинский, Э. Г. Горожанская [и др.] // I съезд онкологов стран СНГ : тез. докл. - М., 1996. - С. 564-565.
9. Даманский, В. Ю. Функциональное состояние и фосфолипидный состав эритроцитов у больных раком молочной железы / В. Ю. Даманский, В. И. Мисы-чева, Г. И. Сергеева [и др.] // Вопр. онкол. - 1992. - № 11. - С. 1155-1163.
10. Донскова, Ю. С. Состояние антиоксидантной и иммунной систем у онкологических больных на этапах хирургического лечения с интраоперационной радиотерапией / Ю. С. Донскова, Н. А. Осипова, Р. И. Якубовская [и др.] // Анестезиология и реаниматология. - 2004. - № 3. - С. 67-70.
11. Горенкова, Н . А . Коррекция постреанимационных нарушений поведенческих реакций мексидолом и киоторфином / Н. А. Горенкова, И. В. Назаренко, И. В. Са-морукова // Анестезиология и реаниматология. - 2002. - № 6. - С. 63-66.
12. Orton, C. G. Uses of Therapeutic X - Rays in Medicine / C. G. Orton // Health Physics. - 1995. - Vol. 69. - № 5. - P. 662-676.
13. Степанов, В. А. Снижение кардиотоксичности адриамицина в присутствии экзогенного фосфокреатинина / В. А. Степанов, М. А. Вититнова, С. А. Крыжа-новский // VI Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 1999. - С. 69.
14. Скороход, А. А. Повреждающее воздействие рубомицина и доксорубицина на эритроциты человека in vitro / А. А. Скороход, В. М. Витвицкий, Р. А. Кульман [и др.] // Вопросы онкологии. - 1999. - Т. 45. - № 4. - С. 374-379.
15. Михайлова, А. О. Миелопептиды и перспективы их использования для иммунореабилитации больных с онкологическими заболеваниями / А. О. Михайлова, Л. О. Стрелков // International Jonnal on Immunorehabilitation. - 1998. - № 10. -С. 49-54.
16. Кузнецов, В. П. Лейкинферон-механизмы терапевтического действия и тактика иммунокоррекции / В. П. Кузнецов, А. В. Караулов // International Jоurnal on Immunorheabilitation. - 1998. - № 10. - Р. 66-67.
17. Лебедев, В. В. Иммунофармакологическая и клиническая эффективность применения регуляторного пептида имунофорана у инфекционных и онкологических больных / В. В. Лебедев, В. И. Покровский // International Jоurnal on Immunorhe-abilitation. - 1998. - № 8. - Р. 11.
18. Rowinsky, E. K. High-dose topotecan with granulocite-colone stimulating factor in fluoropyrimidine-refractory colorectal cancer: A phase II and pharmacodynamic study / E. K. Rowinsky, S. D. Baker, K. Burks [et al.] // International JоurnaI on Immunorhe-abilitation. - 1998. - Vol. 9. - P. 173-180.
19. Стрелков, Л. А. Миелопептиды отменяют супрессию Т-лимфоцитов, вызванную лейкозными клетками человека / Л. А. Стрелков, А. О. Михайлова // Иммунология. - 1980. - № 6. - С. 32-35.
20. Ингель, Ф. И. Геноинженерый у-интерферон как модификатор генетической активности циклофосфамида / Ф. И. Ингель, Ю. А. Ревазова // IV Рос. нац. конг. «Человек и лекарство» . - 1997. - С. 53.
21. Лаврентьева, Г. И. Опыт применения интерферона у больных хроническим миелолейкозом / Г. И. Лаврентьева, И. А. Урванцева, Т. А. Сеитова // International Jоurnal on Immunorheabilitation. - 1998. - № 8. - Р. 87.
22. Глушков, Н. В. Иммуномодулирующее влияние неовира у больных с операбельными опухолями желудочно-кишечного тракта / Н. В. Глушков, Н. В. Шаба-шова, Е. В. Фролова [и др.] // International Journal on Immunorehabilitation. - 1998. -November. - Р. 90.
23. Woll, P. J. Can cytotoxic dose-intensity be increased by using granocyte colony-stimulating factor? A randomixed controlled trial of lenograstin in small cell lung cancer / P. J. Woll, J. Hodgettes, L. Lomax [et al.] // J. Clin. Oncol. - 1995. - Vol. 13. -P. 652-659.
24. Russell, K. Photon versus fast neutron extrenal beam radiotherapy in the treatment of locally advanced prostate cancer: results of a randomized prospective trial / K. Russell, R. Caplan, G. Laramore [et al.] // Int. Radiat. Oncol. Biol. Phys. - 1994. - Vol. 28. -P. 47-54.
25. Pharmacokinetics of Doxorubicin in patients with lymphoproliferative disorders after infusion of Doxorubicin - Loaded Erythrocytes / F. I. Ataullakhanov, V. G. Isaw, A. V. Kohno [et al.] // Erythrocytes as Drug Carriers in Medicine. - New York ; London : Plenum press, 1997.
26. Monohydroxyethylrutoside as protector against chromis doxorubicin - induced cardio-toxicity / S. A. B. Vanacker, K. Kramer, J. A. Grimbergen [et al.] // Br. J. Pharmacol. -1995. - Vol. 115. - P. 1260-1264.
27. Pharmacokinetics of Doxorubicin in patients with lymphoproliferative disorders after infusion of Doxorubicin - Loaded Erythrocytes / F. I. Ataullakhanov, V. G. Isaw, A. V. Kohno [et al.] // Erythrocytes as Drug Carriers in Medicine. - New York ; London : Plenum press, 1997.
28. Лабораторные методы исследования систем гемостаза / под ред. В. П. Балуда [и др.]. - Томск, 1980.
29. Лычев, В. Г. Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови / В. Г. Лычев. - Н. Новгород, 1998.
30. Лабораторные методы исследования в клинике / под ред В. В. Меньшиков.- М., 1987.
31. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний : учебное пособие / под ред. Н. Н. Петрищева, П. П. Паяна. - СПб., 1999.
