CC BY
29
УДК 611.018.74:616.633.96-092.9
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ 2-СТИРИЛПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДИН-4(1Н)-ОНА НА СОСТОЯНИЕ АНТИТРОМБОТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА, НА ФОНЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ВЫЗВАННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ
A.B. Воронков, A.B. Мамлеев, Д.И. Поздняков
Пятигорский медико-фармацевтический институт —
филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России
г. Пятигорск, Ставропольский край, Россия, 357532
Аннотация. Проведено исследование о влиянии новых соединений — 2-стирилпроизводных пиримидин-4(1н)-она — на состояние антитромботического потенциала. Эксперимент реализован на крысах-самках линии Wistar. Влияние исследуемых соединений на антитромботический потенциал изучали на такой модели эндотелиальной дисфункции как недостаточность половых гормонов, путем регистрации процесса АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов. Определяли степень, скорость и показатель агрегации тромбоцитов. В качестве препарата сравнения использовали сулодексид
В результате исследования установлено значительное увеличение тромбогенного потенциала, сопровождаемое повышением степени и скорости агрегации тромбоцитов в 2,1 раза (P < 0,01) и в 4,57 (P < 0,01) соответственно (относительно ложнооперированных крыс). Применение исследуемых соединений позволило скорректировать анти- и про-агрегационный дисбаланс, вызванный эндотелиальной дисфункцией. При этом наиболее выраженный эффект отмечен на фоне введения соединения PMS-4-OH, превосходящий, при этом таковой от применения сулодексида.
Ключевые слова: эндотелиальная дисфункция, недостаточность половых гормонов, 2-стирилпроизводные пи-римидин-4(1 н)-она.
Введение. Эндотелиальная дисфункция — патофизиологический процесс, с которым ассоциирован целый ряд заболеваний сердечно-сосудистой системы. Важная роль отводится дисфункции эндотелия в патогенезе таких серьезных патологий как: атеросклероз, гипертоническая болезнь, хроническая ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, ишемический инсульт и т.д. [1—3]. В большинстве случаев расстройства функциональной активности эндотелия отождествляют с нарушением активности эндотелиальной синтазы
оксида азота, и как следствие, уменьшением продукции NO — одного из важнейших метаболитов, принимающего участие во множестве биохимических реакций и регуляции множества функций, в том числе и антитромботической [1; 4].
Таким образом, актуальным становится вопрос коррекции эндотелиальной дисфункции и сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе тех, которые ассоциированы с недостаточностью эст-рогеновых половых гормонов (НПГ). Многие факторы влияют на активность NOS и, учитывая
—--—
~ 603 ~
Since 1999
—■--—
значительную роль в регуляции активности NOS протеинкиназы С [5; 6], можно предположить, что фармакологическое воздействие на этот вид ферментов представляет собой большой научно-практический интерес.
По последним литературным данным предполагается, что ингибирование протеинкиназы С. позволит в значительной мере повысить активность eNOS в условиях патологического состояния сосудистого эндотелия [6; 7]. Таким образом, одна из ведущих ролей протеинкиназы С (ПКС) в регуляции активности ферментативных систем синтеза оксида азота делает данное семейство ферментов самостоятельной мишенью терапевтического воздействия, а поиск соединений со свойствами ингибиторов ПКС становится одной из актуальных проблем медицинской химии и фармакологии.
Материалы и методы. Исследуемые вещества представляют собой 2-стирилзамещенные производные 4-оксопиримидина, синтезированные на кафедре органической химии ПМФИ филиала ВолгГМУ. Выявление эндотелиопротекторной активности у прогнозируемых соединений основано на их тропности к активным центрам ПКС, выявленной с помощью моделирования молекулярной динамики системы лиганд-фермент [5].
Исследование проведено на 108 крысах-самках, предварительно рандомизированных по возрасту и массе и разделенных на 6 равных экспериментальных групп по 12 особей в каждой. Влияние исследуемых соединений на антитромботи-ческую функцию эндотелия изучали на модели недостаточности половых гормонов (НПГ). НПГ воспроизводили у животных под хлоралгидратной анестезией (350 мг/кг) путем экстерпации матки с придатками. Исследуемые соединения PMS-4-OH QTF, AZOtF, PMSB, PMS5MeSl и PMS34DiMeo — потенциальные ингибиторы ПКС в дозировке 50 мг/кг и препарат сравнения сулодексид (Вессел Дуэ Ф, Alfa Wasserman, Италия), в дозе 30 ЕВ Л (единицы высвобождения липопротеинлипазы) вводились внутрибрюшинно (исследуемые соединения в виде суспензии), ежедневно, в утренние часы. Группе крыс негативного контроля (НПГ) вводили 0,9% раствор натрия хлорида. По истечении 28-дневного периода у крыс производили забор венозной крови для определения показателей,
характеризующих антитромбогенный потенциал: регистрировали процесс агрегации тромбоцитов (степень, скорость и показатель агрегации). Процесс агрегации тромбоцитов регистрировали с помощью двухканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов АЛАТ-2 «БИОЛА» (НПФ «БИОЛА», Россия), методом определения относительного среднего размера агрегатов. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ (НПО «РЕНАМ») в конечной концентрации 5 мкМ [8].
Результаты опытов обрабатывали методом вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США для операционной системы Windows). Вычисляли среднее значение и стандартную ошибку среднего значения. Полученные данные проверяли на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро—Уилка. В случае нормального распределения данных для сравнения средних использовали t-критерий Стьюдента. При ненормальном распределении результатов эксперимента дальнейшую статистическую обработку данных проводили с использованием U-критерия Манна—Уитни.
Результаты и обсуждение. Анализируя данные, полученные при оценке АДФ-индуцирован-ной агрегации тромбоцитов можно сделать вывод, что недостаточность половых гормонов у крыс-самок способствует повышению степени агрегации тромбоцитов в 2,1 раза (P < 0,01), относительно группы ложнооперированных (Л/О) животных. Также у крыс группы негативного контроля, по сравнению с Л/О-группой животных отмечено увеличение скорости агрегации в 4,57 раза (P < 0,01) (рис.). Следует также сказать, что показатель агрегации тромбоцитов во всех экспериментальных группах крыс значимо не отличался (рис.). Полученные результаты, вероятно, можно объяснить тем, что эстрогены играют важную роль в регуляции функциональной активности сосудистого эндотелия (влияние на eNO — синтазную систему). В то же время на фоне недостаточности половых гормонов вероятен сбой данной регуляторной системы, что может привести к развитию эндо-телиальной дисфункции у животных негативного контроля, со сдвигом про/антиагрегантного равновесия в сторону повышения агрегации [9].
—--—
~ 604 ~
Рис. Изменение показателей процесса агрегации тромбоцитов при НПГ на фоне введения сулодексида, и исследуемых соединений
Примечания: * — достоверно, относительно Л/О группы (Р < 0,01); а — достоверно, относительно Л/О группы (Р < 0,05); # — достоверно, относительно НПГ группы (Р < 0,05); А — достоверно, относительно НПГ группы (Р < 0,01); 5 — достоверно, относительно НПГ группы (Р < 0,02)
Курсовое введение сулодексида в значительной мере способствовало нормализации антитром-ботической функции эндотелия. Так степень агрегации тромбоцитов по сравнению с группой крыс негативного контроля уменьшилась на 60,1% (Р < 0,05), с 3,24 ± 0,387 до 2,02 ± 0,185 ус. ед. Однако данный показатель все же значительно превосходил аналогичное значение группы Л/О крыс на 32,6% (Р < 0,05). Скорость агрегации, при введении сулодексида, изменялась аналогично степени. Данный показатель снизился относительно группы животных с НПГ в 4,1 раза (Р < 0,01) и статистически значимо не отличался от показателей ложно-оперированных крыс. В совокупности полученные данные согласуются с ранее проведенными исследованиями и подтверждают наличие у сулодексида эндотелиопротекторной активности.
Применение исследуемых соединений оказало не однозначное влияние на эндотелиальную антитромбогенную активность. Так при применении соединения ОТБ степень агрегации тромбоци-
тов относительно Л/О группы животных увеличилась на 64,7% (P < 0,05), а скорость агрегации на 99,2% (P < 0,05). Одновременно данные показатели уменьшились по сравнению с группой крыс негативного контроля на 28,8% и на 129,6% (P < < 0,05) соответственно.
На фоне введения соединения AZOtF степень агрегации тромбоцитов увеличилась относительно группы ложнооперированных животных на 22,8% (P < 0,05), в то же время по сравнению с крысами группы негативного контроля данный показатель значительно уменьшился — в 1,72 раза. Скорость агрегации изменялась однонаправлено со степенью. Так изменения относительно Л/О группы крыс составили +57,4%, а по сравнению с животными НПГ данный показатель снизился на 195,3%
(P < 0,02).
28-дневное внутрибрюшинное введение соединения PMS-4-OH оказало наиболее выраженный положительный эффект на антитромботиче-скую функцию эндотелия. Степень и скорость аг-
—--—
~ 605 ~
Since 1999
—■--—
регации тромбоцитов, относительно группы крыс негативного контроля, уменьшились в 2,16 (Р < < 0,01) и 5,13 (Р < 0,01) раза соответственно. При этом данные показатели практически не отличались от таковых группы ложнооперированных животных.
Введение вещества РМ8В животным привело к достоверному снижению скорости агрегации тромбоцитов в 1,98 раза (Р < 0,05) по отношению к крысам с НПГ.
При изучении показателей агрегации тромбоцитов в группах животных, которым вводили РМ85Ме81 и РМ834Б1Мео, достоверных изменений степени, скорости и показателей агрегации тромбоцитов по сравнению с группой животных с НПГ не наблюдалась.
Подобные изменения в степени, скорости и показателях агрегации тромбоцитов при применении исследуемых соединений на фоне недостаточности половых гормонов можно объяснить, как минимум, двумя механизмами. Первый механизм, вероятно, объясняется тем, что все представленные выше соединения (РМ8-4-0Н, ОТБ, А70Б, РМ8В) проявляют сродство к домену С3 (АТФ-связыва-ющий сайт) протеинкиназы С. В результате чего происходит деактивация данного фермента и де-фосфорилирование еКО8 (эндотелиальная синтаза оксида азота), что влечет за собой повышение активности N08111 и усиливает продукцию антиаг-регантных факторов (простациклин и N0) эндотелием. В результате наблюдается снижение агре-гационной активности тромбоцитов с восстановлением про/антитагрегантного равновесия. Второй механизм может быть связан с ингибированием протеинкиназы С в тромбоцитах, что также могло привести к снижению агрегационной активности [10; 11]. Интересно отметить, что изучение влияния данной группы исследуемых соединений на вазодилатирующую функцию эндотелия на фоне экспериментальной НПГ, привело к данным [5], коррелирующим с показателями агрегации тромбоцитов, указывая на первый механизм, в котором эндотелий может быть мишенью для исследуемых веществ.
Выводы
1. Экспериментально смоделированная недостаточность половых гормонов, как модель ЭД,
приводит к угнетению антитромботической функции эндотелия, сопровождаемой повышением степени и скорости агрегации тромбоцитов (относительно ложнооперированных крыс в 2,1 (P < 0,01) и в 4,57 (P < 0,01) раза соответственно)
2. Применение исследуемых соединений позволило скорректировать возникшую эндотели-альную дисфункцию, выраженную в изменении тромбогенного потенциала и агрегационной активности. При этом наблюдалось уменьшение, как степени, так и скорости агрегации тромбоцитов. Следует отметить, что показатель агрегации был сопоставим и значимо не отличался во всех экспериментальных группах. Причем фармакологический эффект на фоне введения соединения PMS-4-OH превосходил таковой от применения препарата сравнения- сулодексида.
3. Полученные данные позволяют предполагать наличие у изучаемых соединений: PMS-4-OH, QTF, PMSB и AZOtF антиагрегационной активности, возможно реализуемый посредством эндотелия сосудов. При этом лидером по данному виду активности можно считать соединение PMS4OH.
ЛИТЕРАТУРА
1. Эндотелиопротекторы — новый класс фармакологических препаратов / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А. А. Слиецанс и др. // Вестник РАМН. 2012. № 7. C. 54—57.
2. Cohen P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. Vol. 1(4). P. 309—315.
3. Kim KH., Bender J.R. Membrane-initiated actions of estrogen on the endothelium // Mol Cell Endocrinol. 2009. Vol. 308(1—2). P. 3—8.
4. The international burden of cardiovascular disease: responding to the emerging global epidemic / R.O. Bonow, L.A. Smaha. Smith et. al. // Circulation. 2002. Vol. 106. P. 1602—1605.
5. Воронков A.B., Кодониди И.П., Мамлеев A.B.. Сочнев B.C., Глушко А.А. Поиск и изучение эндотелио-протекторной активности новых 2-стирилпроизводных пиримидин-4(1Н)-она на фоне моделирования недостаточности половых гормонов // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 5. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=22482 (дата обращения: 24.04.2016).
6. Глушко А.А., Воронков А.В., Кодониди И.П.. Бичеров А.В., Черников М.В. Молекулярный докинг n-замещенного производного изохинолона с каталитиче-
—--—
~ 606 ~
ским доменом протеинкиназы С // Фармация и фармакология. 2014. № 1.
7. Karpov Iu.A. Disfunqtciia arterial'nogo endoteliia i ee znachenie dlia ocenqi prognoza u bolnykh serdechno-sosudisty'mi zabolevaniiami // Kardiovasquliarnaia terapiia i profilaqtiqa. 2010. Vol. 2. P. 69—73.
8. Габбасов 3.A., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю., По-зин Е.Я., Маркосян P.A. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов // Лабораторное дело. 1989. № 10. С. 15—18.
9. Воронков A.B., Поздняков Д.И., Мамлеев A.B. Изучение вазодилатирующей и антитромботичекой функций эндотелия мозговых сосудов на различных
моделях его ишемического повреждения // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 5. URL: http://www.science-education.ru/128-22406 (дата обращения: 24.04.2016).
10. Dual role of platelet protein kinase C in thrombus formation: stimulation of pro-aggregatory and suppression of procoagulant activity in platelets / A. Strehl, I.C. Munnix, M.J. Kuijpers et al. // J Biol Chem. 2007. Vol. 282(10). P. 7046—7055.
11. Functional divergence of platelet protein kinase C (PKC) isoforms in thrombus formation on collagen / K. Gilio, M.T. Harper, JM. Cosemans et al. // J. Biol. Chem. 2010. Vol. 285(30). P. 23410—23419.
STUDY OF INFLUENCE DERIVATIVES OF 2-STIRIL PYRIMIDINE-4(1H)-ONE TO STATE ANTITHROMBOTIC POTENTIAL, AGAINST EXPERIMENTALLY INDUCED INSUFFICIENCY OF SEX HORMONES
A. V. Voronkov, A. V. Mamleev, D.I. Pozdnyacov
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute
Annotation. A study on the effect of new compounds — the effect of 2-stiril derivatives of pyrimidine-4(1H)-one on the state of anti-thrombotic potential. Experiment implemented in rats — line female Wistar. Effect of test compounds on the antithrombotic potential were studied in a model of endothelial dysfunction as a lack of sex hormones by the process of registration of ADP-induced platelet aggregation. Determines the extent and the speed indicator of platelet aggregation. As a comparison, the drug used sulodexide.
The study found a significant increase of thrombogenic potential is accompanied by increased platelet aggregation degree and speed of 2.1 times (P < 0,01) and 4,57 (P < 0,01), respectively (relative to sham-operated rats). Application of test compounds adjusted allowed anti- and pro-aggregation imbalance caused by endothelial dysfunction. The most pronounced effect was observed on the background of administration of the compound PMS-4-OH, superior, and the application of such sulodexide.
Key words: endothelial dysfunction, sex hormone deficiency, derivatives of 2-stiril pyrimidine-4(1h)-one.
REFERENCES
1. Tyurenkov I.N., Voronkov A.V., Sliecans A.A. i dr. Endotelioprotektory — novyj klass farmakologicheskih preparatov. Vestnik RAMN, 2012, no. 7, pp. 54—57.
2. Cohen P. Protein kinases — the major drug targets of the twenty-first century. Nat. Rev. Drug Discov., 2002, vol. 1(4), pp. 309—315.
3. Kim K.H., Bender J.R. Membrane-initiated actions of estrogen on the endothelium. Mol Cell Endocrinol., 2009, vol. 308(1—2), pp. 3—8.
4. Bonow R.O., Smaha L.A. Smith et. al. The international burden of cardiovascular disease: responding to the emerging global epidemic. Circulation, 2002, vol. 106, pp. 1602—1605.
5. Voronkov A.V., Kodonidi I.P., Mamleev A.V., Sochnev V.S., Glushko A.A. Poisk i izuchenie ehndoteli-oprotektornoj aktivnosti novyh 2-stirilproizvodnyh piri-midin-4(1N)-ona na fone modelirovaniya nedostatochnosti polovyh gormonov. Sovremennye problemy nauki i obra-zovaniya, 2015, no. 5, URL: http://www.science-education.ru/ ru/article/view?id=22482 (Accessed: 24.04.2016).
6. Glushko A.A., Voronkov A.V., Kodonidi I.P., Bicherov A. V., CHernikov M.V. Molekulyarnyj doking n-zameshchennogo proizvodnogo izohinolona s kataliti-cheskim domenom proteinkinazy S. Farmaciya i farma-kologiya, 2014, no. 1.
7. Karpov Iu.A. Disfunqtciia arterial'nogo endoteliia i ee znachenie dlia ocenqi prognoza u bol'nykh serdechno-
—--—
~ 607 ~
sosudisty mi zabolevaniiami. Kardiovasquliarnaia tera-piia i profilaqtiqa, 2010, vol. 2, pp. 69—73.
8. Gabbasov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.YU., Po-zin E.YA., Markosyan R.A. Novyj vysokochuvstitel'nyj metod analiza agregacii trombocitov. Laboratornoe delo, 1989, no. 10, pp. 15—18.
9. Voronkov A.V., Pozdnyakov D.I., Mamleev A.V. Izuchenie vazodilatiruyushchej i antitrombotichekoj funkcij ehndoteliya mozgovyh sosudov na razlichnyh modelyah ego ishemicheskogo povrezhdeniya. Sovremennye problemy
nauki i obrazovaniya, 2015, no. 5. URL: http://www.science-education.ru/128-22406 (Accessed: 24.04.2016).
10. Strehl A., Munnix I.C., Kuijpers M.J. et al. Dual role of platelet protein kinase C in thrombus formation: stimulation of pro-aggregatory and suppression of procoagulant activity in platelets. J Biol Chem, 2007, vol. 282(10), pp. 7046—7055.
11. Gilio K., Harper MT., Cosemans JM. et al. Functional divergence of platelet protein kinase C (PKC) iso-forms in thrombus formation on collagen. J Biol Chem., 2010, vol. 285(30), pp. 23410—23419.
