CC BY
9
УДК 576.851.315
3. С. Верклова
ИЗУЧЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ, ТОКСИЧНОСТИ, ИММУНОГЕННОСТИ
РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ БДЕЛЛОВИБРИО БАКТЕРИОВОРУС
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
Одной из актуальных задач санитарной микробиологии является изучение процессов самоочищения воды от патогенной микрофлоры и факторов, которые могут способствовать усилению этих процессов. Особый интерес представляет изыскание биологических агентов, содействующих процессам самоочищения в воде поверхностных водоемов.
В 1962 г. Stolp и Potzold выделили из почвы неизвестные ранее паразитические микроорганизмы, обладающие литическим действием по отношению к грамотрицательным бактериям. В дальнейшем было установлено, что внутриклеточные бактерии — паразиты, инфицирующие грамотрица-тельные бактерии, широко распространены в природе. Их отнесли к новому роду и виду и назвали Bdellovibrio bacteriovorus (В. b.).
В 1966 г. Guelin выделил штамм В. b. (х — ty) из речной воды севера Франции, адаптированный к S. typhi. Для выделения чистой культуры было проделано около 100 пассажей одиночных бляшек с последующей фильтрацией. Штамм В. b. (х — ty) лизирует S. typhi, S. paratyphi А и В, Sh. paradysenteriae, Е. coli, Proteus, Pseudomonas и ряд грамположительных микроорганизмов CI. perfringens, В. subtilis, стафилококк и энтерококк.
Многие зарубежные исследователи изучали паразитический внутриклеточный жизненный цикл В. Ь. методами фазоконтрастного и электронного микроскопирования. Значительная часть исследований была посвящена изучению морфологических аспектов взаимодействия В. Ь. с клеткой хозяина. В последние годы В. Ь. рассматривается как один из возможных факторов самоочищения воды водоемов в отношении микробного загрязнения (Stolp и Starr; Guelin и Lamblin).
С 1969 г. в Институте общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина проводятся исследования в этом направлении (Г. И. Сидоренко и соавт., 1970, 1971). Установлено, что В. Ь. широко распространен в сточной воде и воде открытых водоемов различных географических зон страны.
Изучено влияние В. Ь. на патогенные энтеробактерии (S. typhi и Sh. Sonnei) в условиях совместного вегетирования в речной воде (автоклави-рованной и неавтоклавированной, при 20° и 4°). Выявлено, что патогенные энтеробактерии в присутствии В. Ь. претерпевают глубокие морфологические изменения, утрачивают биохимическую и серологическую активность, вирулентность для животных. Эти изменения быстрее наступают в неавтоклавированной воде, чем в автоклавированной, и при 20°, чем при 4°. Опыты по восстановлению утраченных свойств патогенных энтеробактерий различными методами (многократными пересевами на различные питательные среды, пассажи через организм животных) показали, что эти изменения необратимы.
Средние сроки выживаемости S. typhi в речной воде в присутствии В. Ь. следующие: в неавтоклавированной речной воде при 20° — 19дней, при 4° — 31 день, в автоклавированной речной воде — соответственно 21 день и 32 дня. Средние сроки выживаемости шигелл Зонне в присутствии В. Ь. соответственно равны 11, 21, 15 и 25 дням.
В связи с этим перед нами стояла задача выяснить, является ли В. Ь. безвредным для человека. С этой целью были изучены вирулентность и токсичность В. Ь. для белых мышей, морских свинок и кроликов, а также его иммуногенные свойства. Для исследований были отобраны 4 штамма В. Ь. (х — ty), полученные от quelin (Институт им. Пастера, Франция) и выделен-
ные из речной и сточной воды сотрудниками Института общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина (Л-1, CT, МР).
В. Ь. выращивали на клетках Е. coli, штамм АТСС 7020, в солевой среде А. Гелен. Рост В. Ь. контролировали 2 способами — по просветлению бактериальной взвеси на ФЭК-56 и по нарастанию титра числа бляшкообразую-щих единиц (БОЕ), определяемого методом агаровых слоев. Бляшки В. Ь. подсчитывали через 2—3 суток инкубации в термостате при 37°. Очищение культуры В. Ь. и концентрирование проводили путем центрифугирования и фильтрования последовательно через мембранные фильтры № 5, 3 и 1. Конечный титр очищенной культуры В. Ь. составлял 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Морфологическое исследование проводили при помощи фазо-контраст-ной микроскопии.
Вирулентность для белых мышей определяли у 4 штаммов В. b. (х — ty, Л-1, CT, МР) общепринятым методом заражения животных внутрибрюшин-но и внутривенно (в хвостовую вену). Дозы для заражения мышей брали те же и в тех же количествах, которые используются обычно для определения вирулентности патогенных бактерий семейства кишечных (1 млрд., 500 млн., 125 млн., 60 млн. микробных тел в 1 мл). На каждую заражающую дозу брали 10 животных. Наблюдение за ними вели в течение 14 дней. Вирулентность была изучена на 500 мышах.
Изученные штаммы В. Ь. оказались невирулентными для белых мышей даже в дозах 1 млрд.
Вирулентность тех же 4 штаммов В. Ь. определяли по кератоконъюнк-тивальной пробе на морских свинках. В глаз животному закапывали 2 капли взвеси В. Ь. в концентрации 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Наблюдение за свинками вели в течение 14 дней. Ежедневно просматривали конъюнктиву при помощи лупы с наведенным светом. Воспаления конъюнктивы у животных в период наблюдения отмечено не было. Таким образом, изученные штаммы В. Ь. не обнаружили биологической активности по кератоконъюнкти-вальной пробе.
Токсичность штаммов В. Ь.для белых мышей определяли тем же методом, что и вирулентность. Для заражения животных использовали убитую кипячением культуру В. Ь. Дозы для заражения брали такие же. Мышей заражали только внутривенно. Токсичность 4 штаммов В. b. (х — ty, Л-1, CT, МР) изучили на 200 мышах. Результаты исследований показали отсутствие ее.
Несмотря на данные об отсутствии вирулентности и токсичности для животных изученных штаммов В. Ь., мы провели эксперимент по выяснению способности этих культур вызывать в организме образование антител, т. е. иммуногенную способность. С этой целью иммунизировали кроликов живой культурой В. Ь. Была изучена антигенная характеристика 2 штаммов В. h. (х — ty и Л-1). Иммунизацию кроликов проводили по схеме, приведенной в табл. 1.
Проведены две серии иммунизации. В 1-й серии иммунизированы 16 кроликов, во 2-й — 20 кроликов. Как видно из табл. 1, схемы иммунизации отличались дозами антигена. Во второй серии опытов дозы были удвоены. Через неделю после заключительной иммунизации у кроликов забирали кровь из вены и готовили сыворотку, изучение которой проводили с помощью реакции нейтрализации. Для постановки реакции нейтрализации использовали среду НБ/10, штаммы В. b. (х—ty) и Л-1, сыворотки, полученные после
Таблица 1
Схема иммунизации кроликов живой культурой В. Ь., штаммы х—ty и J1-I
День иммунизации
Схема Доза
1-Я 5-й 9-й 13-й 17-й 21-й 25-й
1 серия 10" 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 3,0 3,0
2 серия 108 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2 6,0 6,0
иммунизации кроликов, для бактериального газона — штамм кишечной палочки АТСС 7020.
Полученные от иммунизированных кроликов сыворотки разводили в соотношении 1 : 1, 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80 и 1 : 100. Реакцию нейтрализации наблюдали в течение 72 часов.
В качестве контроля при постановке реакции нейтрализации использовали сыворотку, полученную от неиммунизированного кролика и кролика, иммунизированного фильтратом жидкой питательной среды (после фильтра № 1), на которой культивировали В. Ь., а также культуру без сыворотки
(в физиологическом растворе). Результаты реакции нейтрализации представлены в табл. 2.
Приведенные в табл. 2 результаты показывают, что активность сывороток повышалась при увеличении доз антигена: титр нейтрализации сывороток, полученных после иммунизации кроликов по 2-й схеме дозами, в 2 раза большими, чем по 1-й схеме, был 1 : 60, а по 1-й схеме — 1 : 10 для штамма х — 1у и 1 : 27 и 1 : 5 для штамма Л-1. Антигенная активность штамма х — 1у, выделенного из речной воды, была выше, чем у штамма Л-1, также выделенного из речной воды. Специфичность полученных сывороток была установлена в перекрестной реакции нейтрализации.
Результаты исследования иммунных сывороток свидетельствуют об иммуногенной способности изученных штаммов В. Ь. (х — 1у и Л-1). Перекрестная реакция нейтрализации показала отсутствие антигенного родства у изученных штаммов, а также специфичность полученных сывороток в отношении штаммов, взятых для иммунизации. Внутривенное введение кроликам больших доз живой культуры В. Ь. (двукратное введение 6 мл В. Ь., титр 108 по 2-й схеме иммунизации) и отсутствие при этом явлений интоксикации у кроликов еще раз подтверждают отсутствие у В. Ь. вирулентности и токсичности для животных.
Выводы
1. Определение биологической активности В. Ь. показало отсутствие вирулентности и токсичности для белых мышей, морских свинок и кроликов у штаммов х — , Л-1, СТ и МР.
2. Установлена способность штаммов В. Ь. вызывать в организме животных образование специфических антител. Это обстоятельство открывает дальнейшие возможности усовершенствования метода обнаружения В. Ь. в различных объектах внешней среды и, в частности, в воде. Специфические сыворотки позволяют ближе подойти к идентификации выделяемых штаммов В. Ь., более глубокому изучению его свойств и роли как фактора самоочищения воды водоемов.
3. Факт безвредности В. Ь., установленный в экспериментальных условиях, широкое распространение В. Ь. в природе и, в частности, в воде, а также отсутствие сведений об эпидемической опасности этого вида микроорганизма позволяют рассматривать В. Ь. как безвредный микроорганизм и изучать его в дальнейшем в качестве возможного биологического фактора самоочищения, искусственно привносимого на этапах биологической очистки сточных вод, содержащих возбудителей кишечных инфекций.
Таблица 2
Титры сывороток, полученных после иммунизации кроликов
Сыворотки Титры нейтрализации. средние из 16 определений
От иммунизированных кроли- Схема 1-я Схема 2-я
ков:
штаммом х—1у...... 1:10 1:60
штаммом Л-1 ..... 1:5 1:27
От неиммунизированного кро-
лика ........... - —
Фильтратом питательной среды —
ЛИТЕРАТУРА. Сидоренко Г. И. и др. В кн.: Материалы Конференции по итогам научных исслед. за 1969 г. Ин-та общей и коммунальной гигиены. М., 1970, с. 79.— Сидоренко Г. И. В кн.: Актуальные вопросы гигиены. M., 1970, с. 155. — G u е -1 i n A., L a m Ы i n D., Bull. Acad. Méd., 1966, v. 150, p. 526. — S t о I p H., Pot-z о 1 d H., Phytopathol. Z., 1962, Bd 45, S. 364. — S t о 1 p H. et al. Antonie v. Lecvenhock., 1963, v. 29, p. 217.
Поступила 2/VI 1972 r.
STUD Y OF VIRULENCE, TOXICITY AND IMMUNOGENICS Y OF VARIOUS STRAINS OF BDELLOVIBRIO BACTERIOVORUS
1. S. Verklova
Study of virulence, toxicity and immunogenicity of various strains of Bdellovibrio Bacteriovo'rus for albino'mice, rabbits and guinea-pigs showed that the strains x—ty, L-I, ST and MR are neither virulent nor toxic for warm-blooded animals but are capable of causing formation of antibodies in experimental animals. The serums obtained as a result of the immunization were strictly specific.
УДК 818-058.3-092.9-02:547.548
H. В. Русаков, Г. И. Короткова, В. Ш. Бикбулатов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АЛЛЕРГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ OPTO- И ПАРА-НИТРОХЛОРБЕНЗОЛА
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
К числу распространенных атмосферных загрязнений относятся различные соединения бензола. Среди них особое место занимают производные нитрохлорбензола. Так, по данным Н. Г. Андреещевой и В. Ш. Бикбулато-ва, содержание орто-нитрохлорбензола (ОНХБ) и пара-нитрохлорбензола (ПНХБ) в воздухе населенных мест может быть в концентрациях, превышающих допустимую норму. Следует отметить, что в выбросах производства нитрохлорбензола обычно определяется комплекс изомеров его. При производственном получении ОНХБ и ПНХБ в качестве побочного продукта образуется 2,4-динитрохлорбензол (2,4-ДНХБ). Известно, что 2,4-ДНХБ обладает резко выраженными аллергенными свойствами (А. С. Рабен и соавт.).
Общность химической структуры 2,4-ДНХБ, ОНХБ и ПНХБ дает возможность предположить наличие у них сенсибилизирующих свойств. В литературе представлены противоречивые данные о сенсибилизирующей способности этих изомеров (Landsteiner; Э. Райка, и др.) и совершенно нет сведений о возможном аллергенном действии их комплекса.
С целью изучения сравнительной аллергенной активности ОНХБ, ПНХБ и 2,4-ДНХБ были проведены опыты на 40 морских свинках белой масти при накожном нанесении этих веществ. На эпилированные участки кожи (выстригание) наносили по 3 капли 1 % растворов (растворитель — ацетон) в течение 5 дней. На 7-е сутки поставлена кожная проба в разрешающей дозе — 1 капля 1 % раствора. Разрешающие аппликации ставили на участках кожи, ранее не подвергавшихся действию изомеров. У всех животных, сенсибилизированных ДНХБ, отмечена резко положительная реакция, тогда как у животных, которым были сделаны аппликации ОНХБ, ПНХБ и их комбинаций, реакция кожи оказалась отрицательной.
Поскольку аллергенное действие изомеров нитрохлорбензола и их комбинации не выявлено при нанесении на кожу 1 % растворов указанных соединений, мы продолжили опыт на тех же животных с 10% растворами. На 22-е сутки опыта им в подушечки задних лап был введен адъювант Фрейн-да (0,2 мл) вместе с изучаемыми веществами из расчета 0,5 мг на 1 кг веса. На 6-е сутки после введения адъюванта поставлены разрешающие кожные пробы по описанной выше методике. При этом выявлена положительная кожная реакция у всех животных, сенсибилизированных ПНХБ. В группе
