CC BY
68
УДК 582.272:576.367:616-006.446-092.4
А. А. Philchenkov1, М. P. Zavelevich1, N. N. Khranovskaya , T. S. Zaporozhets3, T. I. Imbs4, T. N. Zvyagintseva4, N. N. Besednova3
FUCOIDANS FROM FAR-EASTERN BROWN SEAWEEDS MODULATE IN VITRO APOPTOSIS IN HUMAN MT-4 LEUKEMIC CELLS
1 R. E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev Institute of Oncology, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kiev Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Siberian Branch, Russian Academy of Medical Sciences, Vladivostok 4Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok
ABSTRACT
Ability of fucoidans from brown seaweed Fucus evanescens and Laminaria cichorioides to modulate an apop-tosis, induced by inhibitor of DNA-topoisomerase П etoposide was investigated. It is shown, that the incubation of MT-4 leukemic cells with fucoidans prior to etoposide treatment increases the apoptosis percentage, which has not been accompanied by additional activation of caspase-3. The involvement of caspase-independent effector apop-totis pathways in enhancement of apoptosis by fucoidans is discussed.
Key words: fucoidan, brown seaweed, apoptosis, human leukemk cells, etoposide, caspase-3.
А. А. Фильченков1, М. П. Завелевич1, Н. Н. Храновская2, Т. С. Запорожец3, Т. И. Имбс4, Т. Н. Звягинцева4, Н. Н. Беседнова3
ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ФУКОИДАНОВ ИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ МОДУЛИРОВАТЬ АПОПТОЗ КЛЕТОК МТ-4 ЛЕЙКОЗА ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
1 Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии
им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев Институт онкологии АМН Украины, Киев Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток Тихоокеанский институт биоорганической химии, Владивосток
РЕЗЮМЕ
Изучена способность фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides модулировать апоптоз, индуцированный ингибитором ДНК-топоизомеразы П этопозидом. Показано, что усиление апоптоза под действием исследуемых фукоиданов не сопровождается дополнительной активацией кас-пазы-3, инициируемой этопозидом. Обсуждается возможность участия каспазо-независимых путей реализации апоптоза клеток МТ-4 лейкоза человека при действии фукоиданов.
Ключевые слова: фукоидан, бурые водоросли, апоптоз, клетки лейкоза человека, этопозид, каспаза-3.
ВВЕДЕНИЕ
Разработка новых эффективных препаратов на основе субстанций растительного происхождения, обладающих комплексным действием, - одна из актуальнейших задач современной онкологии. К настоящему времени наряду с препаратами, выделенными из наземных растений и микроорганизмов, особое внимание исследователей привлекают углеводсодержащие соединения и пептиды, выделенные из морских водорослей [1; 6; 14; 16]. Механизмы их терапевтической активности связывают со способностью проявлять по отношению к опухолевым клеткам цитотоксический либо цитостатический эффекты, стимулировать противоопухолевый иммунитет, а также с выраженным антиангиогенным действием [1; 6; 7; 10], причем в ряде работ подчеркивается, что именно апоптогенные свойства могут обусловливать противоопухолевое и цитотоксическое действие углеводсодержащих соединений из морских растений. Особенно четко это было показано в отношении фукоиданов, которые представляют собой семейство сульфатированных гомо- и гетерополисахаридов, состоящих в основном из L-фукозы, а также галактозы, маннозы, ксилозы, рамно-зы и глюкуроновой кислоты.
При исследовании фукоидана, выделенного из бурой водоросли Cladosiphon okamuranus, К. Напер е! а1.
[8] обнаружили его выраженную способность к индукции апоптоза клеток пролимфоцитарного лейкоза человека. Этот фукоидан представляет собой сульфа-тированный 1,3-а-£-фукан, имеющий в боковых цепях остатки глюкуроновой кислоты. Апоптоз опухолевых клеток могут также индуцировать фукоиданы, полученные из Kgellmaniella crassifolia [9] и других бурых водорослей [15].
Известно, что реализация апоптоза, вызванного цитотоксическими химиопрепаратами, равно как и другими индукторами апоптоза, осуществляется при участии эндопептидаз семейства каспаз, в частности, каспазы-3, которая представляет собой универсальную эффекторную протеазу [13]. Субстратами каспа-зы-3 являются многие структурные и регуляторные клеточные белки [8]. Вместе с тем вклад каспазо-
зависимых механизмов апоптоза в противоопухолевую активность фукоиданов практически не исследовался, за исключением работы [4], в которой было показано, что в клетках НБ-БиКап лимфомы человека индукция апоптоза фукоиданом осуществляется через митохондриальный путь и сопровождается активацией каспазы-3. Важно отметить, что индукция апоптоза клеток НБ-БиКап не была связана с Ь- или Р-селектином, рецепторами фукоидана. Вместе с тем мало известно, обладает ли этот препарат модифицирующей активностью в отношении индукции апопто-за опухолевых клеток под действием цитотоксических химиопрепаратов.
Целью настоящей работы явилось изучение способности фукоиданов, имеющих разную структуру и выделенных из различных бурых водорослей, модулировать апоптоз, индуцированный ингибитором ДНК-топоизомеразы II этопозидом, а также проанализировать особенности участия в этих процессах каспазы-3.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали препараты фукоидана, выделенные сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (Владивосток, Россия) из бурых водорослей Fucus evanescens (Ф1 и Ф2) и Laminaria cichorioides (Ф3) по методам [2; 18].
Как видно из таблицы, фукоиданы значительно различаются по химическому составу и степени очистки. Препарат Ф1 представляет собой суммарную фракцию полисахаридов, выделенную из F. evanes-cens, гетерогенную по моносахаридному составу и содержащую, помимо фукоидана, около 30 % полиман-нуроновой кислоты, для которой показаны иммуномодулирующая и противоопухолевая активности [18]. Фукоза в составе фукоидана связана чередующимися а-1,3- и а-1,4-гликозидными связями [2]. Препарат Ф2 выделен из Ф1 с помощью ионнообменной хроматографии и является практически чистым 1,3;1,4-а-£-фуканом, сульфатированным в основном по С2 фуко-зы и частично ацетилированным по свободным положениям [2]. Препарат Ф3, выделенный из другой бурой водоросли - L. cichorioides, - высокосульфатиро-
Характеристика препаратов фукоиданов из бурых водорослей морей Дальнего Востока
Источник, шифр фукоидана Полиманну-роновая кислота, % Тип фукозидной связи М.м., кДа Моносахаридный состав, мольные доли 304, %
Мап Fuc Gal Ху1 G1c
F. evanescens Ф1 30 а-1,3 а-1,4 20-60 10,0 64,4 15 7,9 2,6 13,9
F. evanescens Ф2 0 а-1,3 а-1,4 20-40 0,4 95,0 1,6 3,0 0 28,5
L. сichorioides Ф3 0 а-1,3 50-80 3,2 76,2 0 0 20 28,0
ванный 1,3-а-£-фукан с примесью ламинарана (около 20 %) [17]. Для растворения препаратов фукоидана использовали 0,9%-ный изотонический раствор хлорида натрия; стоковые растворы фукоидана (концентрация около 5 мг/мл) стерилизовали на кипящей водяной бане. Препараты вносили в культуру клеток в лог-фазе роста в указанных концентрациях. В качестве стандартного индуктора апоптоза использовали противоопухолевый препарат этопозид («Brystol-Myers Squibb SpA», Италия).
Экспериментальной моделью служила Т-кле-точная линия МТ-4 острого лимфобластного лейкоза человека. Клетки, полученные из банка клеточных линий Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Украины, культивировали по общепринятой методике при температуре 37 °С в среде RPMI-1640, содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров (Сангва, Украина) и 2 ммоль/л L-глутамина. Образцы клеток, инкубированных с исследуемыми препаратами, анализировали с помощью светового и флюоресцентного микроскопа. Гиподиплоидные клетки выявляли после окраски пропидия иодидом с помощью проточного цитофлюориметра FACScan (Becton Dickinson, США). Для анализа распределения клеток по фазам митотического цикла использовали программу ModFit LT 2.0. Активную форму каспазы-3 в клетках выявляли с помощью набора «mAb Apoptosis Kit FITC» (BD Bioscience Pharmingen, США) согласно инструкции фирмы-производителя.
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как оказалось, обработка клеток МТ-4 фукоида-ном Ф1 в концентрациях 5-500 мкг/мл не приводит к существенному торможению их роста и не сопровождается массовой гибелью (рис. 1). Аналогичные результаты получены и при использовании других фу-коиданов, применяемых в настоящем исследовании. В дальнейших экспериментах все препараты фукои-данов использовали в дозе 500 мкг/мл.
Данные определения количества гиподиплоидных клеток в культуре МТ-4 при кратковременном действии фукоиданов (24 ч) представлены на рис. 2. Как видно, содержание апоптотических клеток в культу-
10° 10' 10; 103 10‘ FL2-H
в
Рис. 2. Определение количества гиподиплоид-ных клеток по данным проточной цитометрии клеток МТ-4, обработанных разными препаратами фукоидана:
А - контроль;
Б - Ф1;
В - Ф2;
Г - Ф3.
Концентрация фукоидана во всех вариантах составляла 500 мкг/мл, время инкубации - 24 ч. На каждом из графиков указано содержание ги-подиплоидных клеток в препаратах.
сутки после внесения препаратов
Рис. 1. Кинетика роста клеток МТ-4 в присутствии различных препаратов фукоидана
рах, обработанных различными фукоиданами, практически одинаково и не отличается от такового в контрольной культуре. Лишь в случае препарата Ф2 регистрируется некоторое повышение количества гиподиплоидных клеток.
При инкубации с фукоиданами на протяжении как 24, так и 48 ч распределение клеток МТ-4 по фазам цикла практически не отличается от такового в контроле (рис. 3). Эти результаты не согласуются с данными, полученными D. Riou et al. [11] и K. Haneji et al.
[9], которые наблюдали остановку в Gi-фазе клеточного цикла при действии фукоидана in vitro на клетки
Рис. 3. Распределение по фазам цикла клеток МТ-4, обработанных на протяжении 24 или 48 ч разными препаратами фукоидана (Ф1, Ф2, Ф3 в дозе 500 мкг/мл):
Приведены усредненные результаты 3 независимых экспериментов по данным проточной цитометрии.
соответственно немелкоклеточного рака легкого и Т-клеточного лейкоза взрослых. Такое расхождение может быть объяснено различием в используемых пре-
паратах фукоидана либо особенностями клеточной модели.
При индукции этопозидом апоптоза в клетках МТ-4, культивированных в обычных условиях или в присутствии различных фукоиданов, наблюдается существенное повышение количества гиподиплоид-ных клеток в культурах, которые были предварительно прокультивированы с фукоиданами, причем эффект усиления этопозид-индуцированного апоптоза обнаруживается в клетках, предкультивированных с фукоиданом уже на протяжении 1 сут (рис. 4). Обращает на себя внимание факт, что подобное действие в наименьшей степени выражено в случае прединкуба-ции клеток с фукоиданом Ф2 (см. рис. 4, Г).
Аналогичные эксперименты по выявлению возможного апоптогенного действия фукоиданов были проведены с клетками, которые инкубировали в присутствии различных фукоиданов на протяжении более длительного срока (до 14 сут). При этом некоторое отставание в кинетике роста на протяжении 1-го пассажа нивелировалось при последующих пассажах культуры. Содержание апоптотических клеток при этом не отличалось существенно от такового в клетках, кратковременно обработанных фукоиданами (24 ч), за исключением некоторого увеличения количества гиподиплоидных клеток при культивировании в присутствии препарата Ф2 (рис. 5).
В
10° 101 102 103 10* Р1_2-Н
д
Рис. 4. Определение количества гиподиплоидных клеток по данным проточной цитометрии клеток МТ-4, предобработанных разными препаратами фукоидана и культивированных в присутствии индуктора апоптоза этопозида (в дозе 4 мкг/мл):
А - контроль (без этопозида);
Б - этопозид добавлен к клеткам, культивированным без фукоидана;
В, Г, Д - этопозид добавлен к клеткам, культивированным на протяжении 24 ч в присутствии разных препаратов фукоидана в дозе 500 мкг/мл (В - Ф1; Г - Ф2; Д - Ф3).
На каждом из графиков указано содержание гиподиплоидных клеток в препаратах.
34 БИОТЕРАПИЯ
Рис. 5. Определение количества гиподиплоидных клеток по данным проточной цитометрии клеток МТ-4, культивированных на протяжении 14 суток при постоянном присутствии в среде разных препаратов фукоидана:
А - контроль;
Б - Ф1;
В - Ф2.
Концентрация фукоидана во всех вариантах составляла 500 мкг/мл. На каждом из графиков указано содержание гиподиплоидных клеток в препаратах.
При длительном культивировании клеток МТ-4 2-кратное повышение относительного содержания
в присутствии различных фукоиданов и обрабо- гиподиплоидных клеток по сравнению с контро-
танных затем этопозидом отмечается почти лем (рис. 6).
10° 10' 102 10* 10* Г12-И
10° 101 102 10э 10* П2-И
В
10° Ю1 10" 1'03
РІ.2-Н
Г
10“ 10' 102 103 РІ.2-Н
Д
Рис. 6. Определение количества гиподиплоидных клеток по данным проточной цитометрии клеток МТ-4, культивированных на протяжении 14 суток при постоянном присутствии в среде разных препаратов фукоидана с последующей индукцией апоптоза этопозидом (4 мкг/мл, 18 ч):
А - контроль (без этопозида);
Б- этопозид добавлен к клеткам, культивированным без фукоидана;
В, Г, Д - этопозид добавлен к клеткам, культивированным на протяжении 14 суток в присутствии разных препаратов фукоидана в дозе 500 мкг/мл (В - Ф1; Г - Ф2; Д - Ф3).
На каждом из графиков указано содержание гиподиплоидных клеток в препаратах.
Хотя различия между 3 препаратами фукоидана были несущественными, можно отметить тенденцию к более выраженному усиливающему действию в случае препарата Ф3.
Исследованные в настоящей работе фукоиданы отличаются друг от друга типом гликозидных связей, моносахаридным составом, степенью сульфатирова-ния, молекулярными массами. Тем не менее все они обладают проапопототической активностью. Возможно, для ее проявления тип связи не важен либо необходимо присутствие только а-1,3-связанной фукозы, степень же сульфатирования может быть достаточной даже в случае использования самого низкосульфати-рованного препарата.
Следует отметить, что из 2 фукоиданов, выделенных из водоросли Гист еуспе8сеш (Ф1 и Ф2), наименее выраженным действием обладал высокоочищен-ный препарат фукоидана Ф2 - низкомолекулярный, практически гомогенный по моносахаридному составу сульфатированный 1,3;1,4-а-£-фукан. Однако при его самостоятельном действии отмечалось незначительное повышение количества гиподиплоидных клеток по сравнению с таковым в контроле либо при дей-
ствии фукоиданов Ф1 или Ф3. Эффект усиления индукции апоптоза этопозидом у фукоидана, выделенного из Ьсштсгш с1скогю1Се8, сопоставим с таковым у неочищенного фукоидана, выделенного из Гист evсnescens.
Для выяснения возможной роли каспазо-зависимых механизмов в усилении препаратами фукоиданов апоп-тоза, вызванного этопозидом, исследовали содержание клеток с активной формой каспазы-3. С помощью моноклональных антител С92-605 обнаружена активация этого фермента через 24 ч после культивирования обработанных или не обработанных фукоиданами клеток с этопозидом (рис. 7). Следует отметить, что повышение уровня апоптоза в исследуемых образцах не коррелирует с содержанием клеток, которые имеют активированную каспазу-3 (см. рис. 4).
Отсутствие достоверных различий в активации каспазы-3 при действии этопозида или его комбинаций с фукоиданами может быть объяснено следующим образом. Возможно, что для оптимальной индукции апоптоза клеток МТ-4 достаточно того уровня активации каспазы-3, который мы регистрировали в данной работе (не более 25 %). Кроме того, нельзя исключить
8,3 %
4,5 %
10° 10' 1СГ 10* 10*
7,6 %
10° 10' 1СГ 10! 10*
6,4 %
10° 10' 10; 10! 10*
10° 10' 10“ 10! 10*
в
Рис. 7. Определение содержания клеток МТ-4 с активной формой каспазы-3 после обработки клеток разными препаратами фукоидана и культивированных в присутствии индуктора апоптоза этопозида (в дозе 4 мкг/мл):
А-Г - без этопозида (А - контроль; Б - Ф1; В - Ф2; Г - Ф3);
Д-З - с этопозидом (Д - контроль; Е - Ф1; Ж - Ф2; З - Ф3).
На каждом из графиков указано содержание клеток с активной формой каспазы-3.
участия в реализации этопозид-индуцированной апоп-тотической гибели других протеиназ (например, катеп-синов или кальпаинов). Выяснению этого вопроса будут посвящены дальнейшие исследования с использованием специфических ингибиторов каспаз.
Ранее на этой же клеточной линии нами было показано усиление этопозид-индуцированного апоптоза под влиянием физиологических доз препаратов, относящихся к другим классам модуляторов апоптоза (ре-тиноиды или флавоноиды) [3; 5]. Использование модуляторов апоптоза с разными механизмами действия в нетоксических дозах в сочетании с химиотерапевтическими препаратами, которые применяются в современных протоколах лечения, несомненно, может оказаться перспективным подходом для усиления эффективности противоопухолевой терапии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, установлено, что инкубация клеток МТ-4 в присутствии различных фукоиданов приводит к повышению их чувствительности к последующей индукции апоптоза стандартным индуктором
- ингибитором ДНК топоизомеразы II, этопозидом. Такой сенсибилизирующий эффект становится еще более выраженным при длительной инкубации клеток с препаратами фукоидана (более, чем 2-кратное увеличение количества гиподиплоидных клеток при совместном действии препаратов).
Усиление индукции апоптоза под действием всех исследованных в настоящей работе фукоиданов не сопровождалось дополнительной активацией каспазы-
3, что свидетельствует как о предельном уровне активации этого фермента, необходимом для развития апоптоза в данной системе, так, возможно, и о подключении других каспазо-независимых путей реализации апоптоза.
Полученные данные могут представлять определенный интерес в плане возможного синергического эффекта фукоидана с противоопухолевыми препаратами, к которым относится этопозид. Перспективным представляется проведение аналогичных исследований на других моделях, а также с применением противоопухолевых препаратов, отличающихся по механизму либо цитотоксического действия, либо индукции апоптоза от этопозида как ингибитора ДНК топоизомеразы II.
Работа выполнена в рамках интеграционных проектов СО РАМН-ДВО РАН№№ 05-П-СМ-05-007 и 06-П-СМ-05-004, поддержана грантом РФФИ 06-04-48540-а, а также программой РАН «Молекулярная и клеточная биология».
ЛИТЕРАТУРА
1. Апрышко Г. Н., Нехорошев М. В. Противоопухолевые препараты из морских организмов. - Севастополь: Аквавита, 2000. - 105 с.
2. Кусайкин М. И., Чижов А. О., Алексеева С. А. и др. Сравнительное исследование специфичности
фукоиданаз морских микроорганизмов и беспозвоночных // Докл. акад. наук. - 2004. - Т. 396, № 5. - С. 1-3.
3. Фильченков А. А., Завелевич М. П., Бутенко З. А. Индукция апоптоза в злокачественных лимфоидных клетках человека ДНК-повреждающими препаратами с различным механизмом действия // Эксперим. он-кол. - 2001. - Т. 23, № 3. - С. 170-4.
4. Aisa Y., Miyakawa Y., Nakazato T. et al. Fuc-oidan induces apoptosis of human HS-sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways // Am. J. Hematol. - 2005. - Vol. 78, No 1. - P. 7-14.
5. Butenko Z. A., Zavelevich M. P., Smirnova I. A. et al. Different etoposide-induced apoptotic response of human malignant lymphoid cell lines // Exp. Oncol. -2000. - Vol. 22, No 1-2. - P. 26-31.
6. Chida K., Yamamoto I. Antitumor activity of a crude fucoidan fraction prepared from the roots of kelp (Laminaria species) // Kitasato Arch. Exp. Med. - 1987. -Vol. 60, No 1-2. - P. 33-9.
7. Itoh H., Noda H., Amano H. et al. Antitumor activity and immunological properties of marine algal polysaccharides, especially fucoidan, prepared from Sargas-sum thunbergii of Phaeophyceae // Anticancer Res. -1993. - Vol. 13, No 6A. - P. 2045-52.
8. Fischer U., Janicke R. U., Schulze-Osthoff K. Many cuts to ruin: a comprehensive update of caspase substrates // Cell Death Differ. - 2003. - Vol. 10, No 1. -P. 76-100.
9. Haneji K., Matsuda T., Tomita M. et al. Fucoidan extracted from Cladosiphon okamuranus Tokida induces apoptosis of human T-cell leukemia virus type 1-infected T-cell lines and primary adult T-cell leukemia cells // Nutr. Cancer. - 2005. - Vol. 52, No 2. - P. 189-201.
10. Matsubara K., Xue C., Zhao X. et al. Effects of middle molecular weight fucoidans on in vitro and ex vivo angiogenesis of endothelial cells // Int. J. Mol. Med. -2005. - Vol. 15, No 4. - P. 695-9.
11. Riou D., Colliec-Jouault S., Pinczon du Sel D. et al. Antitumor and antiproliferative effects of a fucan extracted from ascophyllum nodosum against a non-small-cell bronchopulmonary carcinoma line // Anticancer Res.
- 1996. - Vol. 16, No 3A. - P. 1213-8.
12. Sagawa T.I.H., Kato I. Fucoidan as functional foodstuff. Structure and biological potency // Jpn. J. Phy-col. (Sorui). - 2003. - Vol. 51. - P. 19-25.
13. Philchenkov A. Caspases: potential targets for regulating cell death // J. Cell. Mol. Med. - 2004. - Vol. 8, No 4. - P. 432-44.
14. Sogawa K., Matsuda M., Okutani K. Induction of apoptosis by a marine microalgal polysaccharide in a human leukemic cell line // J. Mar. Biotechnol. - 1998. -Vol. 6, No 4. - P. 241-43.
15. Umeda Y., Kihara H., Ikai K., Kato I. Food or beverage containing fucoidan and method for production thereof / Pat. 20050049221 US. - 2005.
16. Yamamoto I., Takahashi M., Suzuki T. et al. Antitumor effect of seaweeds. IV. Enhancement of antitumor
activity by sulfation of a crude fucoidan fraction from Sargassum kjellmanianum // Jpn. J. Exp. Med. - 1984. -Vol. 54, No 4. - P. 143-51.
17. Zvyagintseva T. N., Shevchenko N. M., Chizhov A. O. et al. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions // J. Exp. Marine Biol. Ecol. 2003. - Vol. 294, No 1. - P. 1-13.
18. Zvyagintseva T. N., Shevchenko N. M., Nazarenko E. L. et al. Water-soluble polysaccharides of some brown algae of the Russian Far-East. Structure and biological action of water-soluble polyuronans // J. Exp. Marine Biol. Ecol. 2005. - Vol. 320, No 2. - P. 123-31.
Поступила 03.08.2006.
