CC BY-ND
11
ИЮНЬ IK (291) ЗНиСО
41
УДК 60:579
ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ В ОТНОШЕНИИ ТЕСТ-ШТАММОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Ю.С. Ковтун, А.А. Курилова, Л.С. Катунина
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Ставрополь, Россия
Проведена оценка специфической активности в отношении тест-штаммов Streptococcus pyogenes Dick I, Vibrio cholerae non О1 Р-9741 агаровых сред, содержащих в качестве источников азотного и углеродного питания панкреатические гидролизаты желатина, сои, соевого концентрата, глютена кукурузного, рыбной кормовой муки, кильки каспийской, крови КРС. Выявлены различия в количестве, диаметре и частоте диссоциации колоний указанных тест-штаммов, что позволит выработать дифференцированный подход к возможному использованию изученных гидролизатов.
Ключевые слова: гидролизаты белкового сырья, питательные среды, специфическая активность.
Yu.S. Kovtun, A.A. Kurilova, L.S. Katunina □ STUDY OF THE SPECIFIC ACTIVITY OF PROTEIN HYDROLYSATES REGARDING TEST STRAINS USED TO CONTROL OF NUTRIENT MEDIA □ The Federal Government Public Health Institution Stavropol Institute for Plague Control of the Rospotrebnadzor, Stavropol, Russia.
An evaluation of the specific activity towards the test strains of Streptococcus pyogenes Dick I, Vibrio cholerae non O1 P-974l agar media containing, pancreatic hydrolysates of gelatin, soy, soy concentrate, maize gluten, fish meal, common kilka, bovine blood as carbon and nitrogen sources was made. The variations in the number, size and frequency of dissociation among the colonies of these test strains were discovered, which allow to develop a differentiated approach to the possible usage of studied hydrolysates.
Key words: protein hydrolysate; nutrient medium; specific activity.
Важнейшим компонентом, определяющим качество питательных сред, являются пептоны - продукты ферментативного гидролиза белкового сырья [6]. В качестве источников азотного и углеродного питания в составе многих сред наряду с мясными пептонами нашли применение гидролизаты других белковых субстратов: казеина, рыбных продуктов, растительных белков и др. Потребность в использовании альтернативных источников сырья объясняется как экономическими соображениями, так и тем, что они, по отдельным качественным показателям, превосходят мясные пептоны [5]. Высокая питательная ценность папаиновых гидролизатов сои, например, позволяет получить на средах, содержащих эти пептоны, хороший рост стрептококков, гонококков и других требовательных бактерий без добавления сыворотки и факторов роста [6].
Целесообразность замены гидролизатов мяса на гидролизаты других видов белкового сырья в последнее время вызывается и частым инъецированием мяса смесями, составленными из воды, крахмала, триполифосфатов, карраги-нана, альгиновой кислоты и др. Следует отметить, что визуально определить инъецированное мясо не представляется возможным. Нам приходилось несколько раз сталкиваться с таким инъецированным мясом. В частности, в процессе варки куски мяса резко уменьшались в размере (в 1,5-2 раза). Гидролизная смесь, состоящая первоначально из мясного настоя и фарша, через несколько дней переваривания превращалась в студнеобразную массу светло-кремового цвета, занимавшую почти весь объем реактора (жидкого гидролизата оставалось 24 % от общего объема). Через несколько суток хранения при температуре 5-7 °С студнеобраз-
ная масса расслаивалась с выделением жидкости. Студнеобразная консистенция гидролизной смеси делала невозможным ее перекачивание с помощью вакуума или сжатого воздуха, требовала применения дополнительных технологических операций по ее обработке. По-видимому, в последнем случае мясо было инъецировано кар-рагинаном, молекулы которого, взаимодействуя с миозином, формируют каррагинан-белко-вый гель [9]. В процессе гидролиза мышечных белков из данного геля освобождались молекулы каррагинана, способные образовывать различные гели при комнатной температуре [3].
Исходя из вышеизложенного, с целью расширения спектра пептонов, применяемых при изготовлении микробиологических питательных сред, и выработки целенаправленных подходов к их использованию, нами ранее была проведена сравнительная оценка физико-химических свойств панкреатических гидролизатов желатина, сои, соевого концентрата, глютена кукурузного, рыбной кормовой муки, свежемороженной каспийской кильки, крови крупного рогатого скота [4]. Была также проведена оценка биологических свойств вышеперечисленных гидролизатов на модели питательного агара с использованием тест-штаммов бактерий Shige-lla flexneri la 8516, S. sonnei «S form», Pseudomonas aeruginosa 27/99, Serratia plymuthica 1. Проведенная оценка показала определенные различия в количестве, диаметре и частоте диссоциации колоний S. flexneri la 8516, S. sonnei «S form», пигметообразовании P. aeruginosa и S. plymuthica 1 на агаровых средах с изучаемыми гидролизатами. Однако использованные тест-штаммы достаточно легко культивируются на обычных питательных средах, три из них отно-
42
ЗНиСО июнь Нос (291)
сятся к одному семейству - Enterobacteriaceae, и для более детальной характеристики изучаемых гидролизатов представляется целесообразным изучить специфическую активность питательных сред, включающих данные пептоны, с помощью более «требовательных» тест-штаммов, относящихся к разным таксономическим группам.
Цель исследования - сравнительная оценка биологических свойств панкреатических гидролизатов желатина, сои, соевого концентрата, глютена кукурузного, рыбной кормовой муки, свежемороженной каспийской кильки, крови крупного рогатого скота в отношении тест-штаммов Streptococcus pyogenes Dick I, Vibrio cholerae non 01 Р-9741.
Материалы и методы. Объектами исследования являлись панкреатические гидролиза-ты желатина, сои, соевого концентрата, глюте-на кукурузного, рыбной кормовой муки, кильки каспийской, крови КРС, приготовленные по традиционной технологии.
Для определения биологических показателей питательных сред, содержащих изучаемые гидролизаты, использовали тест-штаммы бактерий S. pyogenes Dick I, V. cholerae non О1 Р-9741, полученные из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Оценку специфической активности моделей питательных сред проводили по количеству выросших колоний, их размеру и морфологии.
Для изготовления питательных сред использовали: агар микробиологический (ГОСТ 17206-96) [1], натрия хлорид (ГОСТ 4233-77) [8], D-глюкозу (ГОСТ 6038-79) [7], воду дистиллированную (ГОСТ 6709-72) [2].
В качестве сред сравнения использовали питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (СПА) производства ФГУП «НПО «Микроген» и питательную среду для выделения и культивирования холерного вибриона сухую (щелочной агар) производства ФБУН «ГНЦ ПМБ». Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней арифметической (m), ис-
пользуя t-критерий Стьюдента. При оценке ^с достоверности различий сравниваемых данных ^^ за уровень значимости принимали р < 0,05.
Результаты исследования. Питательные = среды для оценки специфической активности сравниваемых гидролизатов включали: гидро- ^^ лизат - из расчета содержания в 1 л среды 12 г ^ сухих веществ; натрия хлорид - с учетом веще- ^ ства, содержащегося в гидролизате, добавляли до содержания его в среде 5 г/л; агар микробиологический брали в количестве, обеспечивающем прочность готовой среды (340 ± 40) г. Для культивирования тест-штамма S. pyogenes Dick I дополнительно вводили глюкозу до концентрации 2 г/л. рН агаров устанавливали в пределах (7,5 ± 0,1) - для культивирования стрептококков, (7,7 ± 0,1) - для культивирования холерных вибрионов.
Данные о количестве, диаметре и морфологии колоний S. pyogenes Dick I через 48 ч инкубации, V. cholerae non О1Р-9741 через 12 ч инкубации, при температуре (37 ± 1) °С, представлены в таблице.
На средах с изучаемыми гидролизатами стрептококки образовывали серые, округлые, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии, которые имели приподнятый центр; на средах с гидролизатами сои, соевого концентрата, кильки, желатина центр был зернистым. На агарах с гидролизатами рыбной муки и сои часть колоний имела неправильную форму с неровными краями.
Наибольшее количество колоний стрептококков вырастало на средах, включавших гид-ролизаты глютена, сои и желатина, по данному показателю они были близки к питательному агару с 0,2 % глюкозы, используемому в качестве среды сравнения. Вышеперечисленным препаратам несколько уступали среды на основе соевого концентрата (р > 0,05) и кильки (р < 0,05), значительно - в 4-5 раз - уступали среды на основе гидролизатов крови и рыбной муки (p < 0,05). Колонии наибольшего диаметра вырастали на агарах, включающих гидроли-заты соевого концентрата, рыбной муки, кильки, наименьшего - на среде с гидролизатом желатина и крови.
Таблица. Специфическая активность питательных сред, включающих различные гидролизаты, в отношении S. pyogenes Dick I и V. cholerae non О1 Р-9741
Питательные агары на основе панкреатических гидролизатов Наименование тест-штаммов
Streptococcus pyogenes Dick I Vibrio cholerae non О1 Р-9741
Количество колоний из разведения 10-5 Диаметр колоний, мм Количество колоний из разведения 10-6 Диаметр колоний, мм
кильки 47,81 ± 5,32 0,6-2,2 35,35 ± 1,89 1,3-2,0
желатина 81,36 ± 3,38 0,4-1,2 41,94 ± 2,19 1,0-1,3
рыбной муки 16,68 ± 4,45 0,7-2,4 10,2 ± 2,59 1,0-1,7
крови 18,43 ± 5,16 0,6-1,3 35,64 ± 3,30 1,0-1,8
сои 84,57 ± 2,94 0,7-1,6 15,77 ± 0,91 0,7-1,2
соевого концентрата 69,52 ± 9,09 0,9-2,1 24,79 ± 2,94 1,1-1,6
глютена 89,10 ± 4,14 0,8-1,6 28,52 ± 1,89 1,4-2,0
Среда сравнения 83,96 ± 3,18 0,8-2,0 30,21 ± 2,97 1,0-1,5
июнь Нос (291) ЗНиСО
43
^^ Рост V. cholerae non О1 Р-9741 на агарах, содержащих гидролизаты кильки, глютена, кро-= ви, щелочном агаре, примененном в качестве сэ среды сравнения, наблюдался в виде круглых, гладких, блестящих выпуклых колоний. На средах с гидролизатами соевого концентрата и желатина вибрионы формировали круглые, глад-^ кие, мутноватые колонии с возвышающимся центром, а на агарах с гидролизатами сои и рыбной муки большинство колоний были плоскими, матовыми, с неровными краями и возвышающимся центром. Последние два препарата существенно (р < 0,05) уступали остальным средам по количеству вырастающих колоний. Использование в качестве источника питания гидролизата желатина обеспечивало формирование наибольшего числа колоний V. cholerae non О1 Р-9741. Несколько меньше колоний вибрионов вырастало на агарах, содержащих гидролизаты крови и кильки, существенно меньше - на агарах, содержащих гидролизаты соевого концентрата и глютена (p < 0,05).
Таким образом, в отношении штаммов S. pyogenes Dick I, и V. cholerae non О1 Р-9741 питательные среды, содержащие в качестве источников азотного и углеродного питания изучаемые гидролизаты, проявляли неодинаковую специфическую активность, что выражалось в разном количестве, размере и морфологии выросших колоний. Наибольшее количество колоний стрептококков формировалось на агарах с гидролизатами растительного сырья и желатина. Колонии стрептококков максимального размера вырастали на средах, включающих гидролизаты рыбной муки и кильки. Агар, содержащий гидролизат крови, уступал прочим средам по обоим показателям, а препарат, содержащий гидролизат желатина, - по диаметру вырастающих колоний.
В отличие от стрептококков, наибольшее количество колоний V. cholerae non О1 Р-9741 вырастало на средах, включающих гидролизаты животного сырья, за исключением рыбной муки. Наиболее крупными колонии вибрионов были на агарах с гидролизатами кильки и глютена.
На средах с гидролизатами рыбной муки и сои часть колоний обоих штаммов имела признаки диссоциации.
При сопоставлении специфической активности питательных сред, содержащих сравниваемые гидролизаты, в отношении штаммов S. pyogenes Dick I и V. cholerae non 01 Р-9741 с определенной ранее специфической активностью тех же сред в отношении штаммов S. flexneri 1а 8516 и S. sonnei «S form» следует
отметить, что разница в количестве вырастаю- +
щих колоний между средами, содержащими разные гидролизаты, была значительно более выражена в первом случае [4]. Так, для S. pyogenes Dick I она составляла 5,34 раза, для V. cholerae non 01 Р-9741 - 4,11 раза, а для S. flexneri 1а 8516 и S. sonnei «S form» - 1,24 и 1,57 раза соответственно. Размер колоний, вырастающих на агарах, содержащих в качестве источника азотного и углеродного питания гидролизат желатина, был наименьшим, за исключением размера колоний V. cholerae non 01 Р-9741, сформировавшихся на среде с гидролизатом сои. Включение в состав агаров гидролизата рыбной муки приводило к диссоциации колоний S. pyogenes Dick I, и V. cholerae non 01 Р-9741, в то же время признаков диссоциации колоний ши-гел на средах с этим гидролизатом не отмечено.
Полученные данные свидетельствуют о разной специфической активности изучаемых гидролизатов в отношении тест-штаммов различных таксономических групп, что позволит выработать дифференцированный подход к их возможному использованию.
ЛИТЕРАТУРА
1. Агар микробиологический. Технические условия: ГОСТ 17206-96 (дата введения: 01.01.1998).
2. Вода дистиллированная. Технические условия (с изменениями № 1, 2): ГОСТ 6709-72 (дата введения: 01.01.1974).
3. Каррагинаны. Спецификации для пищевых добавок и рецептуры [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://specin.ru/carraginan/98.htm (дата обращения 31.01.2015).
4. Ковтун Ю.С. и др. Сравнительная оценка потенциальных белковых основ микробиологических сред / Ю.С. Ковтун, А.А. Курилова, Т.В. Таран [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2014. Вып. 3. С. 92-95.
5. Мазрухо А.Б. и др. Сравнительная оценка белковых гидролизатов при создании на их основе универсальной питательной среды для диагностики чумы и холеры / А.Б. Мазрухо, Д.И. Каминский, Ю.М. Ломов [и др.] // Клин. лаб. диагностика. 2011. № 6. С. 46-48.
6. Поляк М. С. и др. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии / М.С. Поляк, В.И. Суха-ревич, М.Э. Сухаревич. СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2008. 352 с.
7. Реактивы. D-глюкоза. Технические условия: ГОСТ 6038-79 (дата введения: 01.07.1980).
8. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия: ГОСТ 4233-77 (дата введения: 01.01.1978).
9. Сарафанова Л.А. Применение пищевых добавок в индустрии напитков. СПб.: Профессия, 2007. 239 с.
Контактная информация: Ковтун Юрий Сергеевич, тел.: +7 (919) 742-25-80, e-mail: [email protected] Contakt information: Kovtun Yuriy, phone: +7 (919) 742-25-80,
e-mail: [email protected] + -
