CC BY
1Ветеринарный врач. 2024. № 6. С. 58 - 62 The Veterinarian. 2024; (6): 58 - 62
Научная статья
УДК 621.785.9:577.152.54:661.746 DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_6_58
ИЗУЧЕНИЕ СОХРАННОСТИ ШТАММОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ПОСЛЕ
ДОЛГОСРОЧНОГО ХРАНЕНИЯ
Елена Александровна Артемьева 1, кандидат ветеринарных наук, artemevaelena21@mail. ru Лилия Арсентьевна Мельникова кандидат ветеринарных наук, [email protected] Эльмира Наримановна Мустафина кандидат ветеринарных наук, elmira.mustafina. [email protected] Екатерина Витальевна Панкова кандидат биологических наук, [email protected] Рустам Хаметович Равилов 2, доктор ветеринарных наук, профессор, [email protected] Светлана Васильевна Садыкова [email protected]
1 Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Казань, Российская Федерация
2 Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Казань, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Елена Александровна Артемьева.
Аннотация. Основной задачей коллекционной деятельности является поддержание исходных характеристик микроорганизмов, обуславливающих возможность их целевого использования при разработке и производстве биопрепаратов, что имеет ведущее значение в обеспечении биологической и продовольственной безопасности Российской Федерации. Одним из представителей условно-патогенных микроорганизмов, является возбудитель синегнойной инфекции - P. aeruginosa, регистрирующийся на всех континентах мира в различных климатических зонах у всех видов животных, человека и растений. Синегнойная инфекция наносит огромный экономический ущерб отраслям животноводства. Среди заболеваний инфекционной этиологии эта инфекция получила широкое распространение на животноводческих предприятиях Российской Федерации. Для недопущения возникновения и распространения псевдомонозов проводятся профилактические, лечебные и карантинные мероприятия с применением препаратов ветеринарного назначения, которые разрабатываются и производятся на основе коллекционных штаммов возбудителя синегнойной инфекции. В представленной статье описаны результаты исследования штаммов P. аeruginosa, хранившихся в лиофилизированном виде при температуре +4... +8° С на протяжении 32 лет. Выявлено, что в зависимости от штамма процент их выживаемости снизился на 60 - 85%. Биологические свойства исследуемых штаммов остаются стабильны на протяжении всего этого периода. Это достигается благодаря созданию оптимальных условий хранения, отвечающих современным требованиям по ведению коллекционных фондов в Государственных коллекциях патогенных микроорганизмов.
Ключевые слова: штамм, синегнойная инфекция, биологические свойства, жизнеспособность, хранение
Для цитирования: Артемьева Е. А., Мельникова Л. А, Мустафина Э. Н., Панкова Е.В., Равилов Р.Х., Садыкова С.В. Изучение сохранности штаммов Pseudomonas aeruginosa после долгосрочного хранения // Ветеринарный врач. 2024. № 6. С. 58 - 62. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_6_58
STUDYING THE PRESERVATION OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS AFTER
LONG-TERM STORAGE
Elena A. Artemeva l, candidate of veterinary sciences, [email protected] Liliya. A. Melnikova l, candidate of veterinary sciences, [email protected] Elmira N. Mustafina \ candidate of veterinary sciences, [email protected] Ekaterina V. Pankova candidate of biological sciences, [email protected] Rustam H. Ravilov 2, doctor of veterinary sciences, professor, [email protected] Svetlana V. Sadukova \ [email protected]
1 Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russian Federation
2 Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.E. Bauman, Kazan, Russian Federation
Corresponding author: Elena Alexandrovna Artemeva.
Abstract. The main task of collection activities is to maintain the initial characteristics of microorganisms, which determine the possibility of their intended use in the development and production of biologics, which is of leading importance in ensuring the biological and food security of the Russian Federation. One of the representatives of opportunistic microorganisms is the causative agent - P. aeruginosa, which registers on all continents of the world in different climatic zones in all species of animals, humans and plants. Pseudomonas aeruginosa infection causes enormous economic damage to livestock industries. Among diseases of infectious etiology, this infection has become widespread in livestock enterprises of the Russian Federation. To prevent the occurrence, spread of pseudomonas, preventive, therapeutic, and quarantine measures are carried out using veterinary drugs, which are developed and produced based on collection strains of the causative agent of Pseudomonas aeruginosa infection. The presented article describes the results of a study of P. aeruginosa strains stored in lyophilized form at a temperature of +4...+80 C for 32 years. It was revealed that, depending on the strain, their survival rate decreased by 60-85%. The biological properties of the studied strains remain stable throughout this period. This is achieved through the creation of optimal storage conditions that meet modern requirements for maintaining collection funds in State collections of pathogenic microorganisms.
Keywords: strain, Pseudomonas aeruginosa infection, biological properties, viability, storage
Введение. В коллекционных фондах Государственных коллекций патогенов насчитывается от десятков до тысяч единиц хранения, представленных различными видами микроорганизмов и играющие важную роль в биологической безопасности страны [1]. Особое значение отводится штаммам возбудителей инфекционных заболеваний животных и людей, которые используются при производстве биопрепаратов, направленных на недопущение возникновения, распространения и купирования зооантропозоонозов. Последнее достигается проведением профилактических, лечебных и карантинных мероприятий с применением препаратов ветеринарного назначения [2-4]. Их качество и быстрота внедрения в производство напрямую зависят от тщательного изучения стабильности используемых штаммов микроорганизмов и всех присущих им генетических признаков (маркеров), которое осуществляется в Государственных коллекциях патогенов [5].
Одним из представителей условно-патогенных микроорганизмов, является возбудитель синегнойной инфекции - P. aeruginosa, регистрирующийся на всех континентах мира в различных климатических зонах у всех видов животных, человека и растений [6]. Синегнойная инфекция наносит огромный экономический ущерб отраслям животноводства. Среди заболеваний инфекционной этиологии эта инфекция получила широкое распространение на животноводческих предприятиях Российской Федерации ввиду высокой устойчивости возбудителя к факторам внешней среды и в этиологическом аспекте представляет значительную угрозу для организма животных ввиду наличия большого количества факторов его вирулентности и патогенных свойств [7].
В России в качестве профилактических средств против синегнойной инфекции применяются такие вакцины, как «Вакцина поливалентная против псевдомоноза сельскохозяйственных животных», «Вакцина против псевдомоноза свиней из инактивированных культур бактерий P. aeruginosa», «Вакцина против псевдомоноза пушных зверей (песцов и лисиц), «Вакцина против псевдомоноза норок». Биофабрики, изготавливающие данные препараты, получают производственные штаммы из Государственных коллекций патогенов. В коллекционном фонде Государственной коллекции штаммов микроорганизмов - возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», хранятся и поддерживаются в активном состоянии штаммы возбудителя P. aeruginosa, которые используются в качестве производственных (для изготовления биопрепаратов) и контрольных (при проведении диагностических исследований). Сохранение их жизнеспособном, неизменном виде имеет ключевое значение при разработке и производстве биопрепаратов.
Целью настоящего исследования явилось проведение определения жизнеспособности и изучение биологических свойств штаммов возбудителя P. aeruginosa после их долгосрочного хранения.
Материалы и методы. Для работы были взяты 13 штаммов Pseudomonas aeruginosa, полученные в 1991 году из ВГНКИ. Штаммы хранятся в коллекционном фонде в лиофилизированном виде в ампулах по 1 см3, при температуре + 4 °С +8 °С. Определение жизнеспособности проводили посевом из ампул после суспендирования культуры 0,85% раствором хлорида натрия в пробирки с
мясопептонным агаром (МПА) и мясопептонным бульоном (МПБ), в термостате инкубировали в течение 4 суток при температуре + 37 °С, отслеживая начало появления роста на данных питательных средах. После определения жизнеспособности и чистоты роста штаммов P. aeruginosa, проводили исследования их биологических свойств [8]. Для получения второй генерации проводили пересев культуры с целью изучения тинкториальных (отношение к красителям), культурально-морфологических (характер роста на МПА и МПБ при температуре + 37 ° С и тест на рост при температуре + 41° С, наличие жгутиков), биохимических (разжижение желатины, образования индола, сероводорода) свойств, пигментообразования (наличие/отсутствия пигмента) и проведения теста на каталазу. Полученные результаты сравнивали с паспортными данными на штаммы.
Пассаж через организм чувствительных животных (белых мышей) проводили путем введения 10-7 взвеси культуры по 0,2 мл внутримышечно в область бедра. После падежа или умерщвления животных в агональном состоянии на 4-5 день, осуществляли вскрытие и посев с органов (место введения культуры, селезенка, печень, кровь из сердца) при помощи пастеровской пипетки на МПБ и МПА. Работы с лабораторными животными проводилась в соответствии с основными этическими принципами проведения экспериментов на животных, изложенных в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г.). Эксперименты были научно обоснованы и утверждены Комиссией по биоэтике ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (протокол № 11 от 16.10.2023).
Лиофилизацию проводили на сублимационной установке «Frigera ЛЗ-9С» при отработанном нами режиме: 1) замораживание материала в течение 18 часов до - 40 0С в морозильной камере; 2) перенос материала в лиофильную установку, охлаждение плиты до - 52 0С; 3) включение вакуума; 5) включение обогрева (Р) через 17 часов с момента загрузки материала при следующих параметрах: t + 10 0С, t 0 0С; 6) включение обогрева (р+1) через 18 часов при следующих параметрах: t +200С, t +50с, вакуум 0,5 trr; 7) часовой диапазон 24 часа: t + 32 0С, t + 25 0С, вакуум 0,05 trr. ЛЗ-9. (5)
Для этого готовили их последовательные десятикратные разведения в физиологическом растворе и проводили посев на чашки Петри с МПГА по 0,1 см3. После чего, через 2 дня проводили учет выросших колоний. Процент выживаемости штаммов, определяли по отношению числа выросших колоний к первоначальному числу жизнеспособных клеток (число микробных клеток до начала хранения) которые брали за 100% [9]. Все работы с культурами проводили в соответствии с СанПиН 3.3686-21. Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней [10].
Результаты исследований и их обсуждение. В соответствии с паспортными данными один раз в 5 лет проводится контроль исследуемых штаммов на сохранность воспроизводства и стабильность биологических свойств, а также осуществляется их пассаж через организм чувствительных животных (белых мышей).
Определение жизнеспособности лиофилизированных культур, заложенных на хранение в 1991, 1996 и 2006 годах показало, что при посеве на МПБ наблюдался рост в виде равномерного помутнения, на МПА - в виде расплывчатых непрозрачных (круглых слизистых) колоний. При микроскопии мазков, приготовленных из культур и окрашенных по Граму, наблюдаются грамотрицательные прямые палочки, расположенные одиночно, попарно, встречаются цепочки. В препарате висячей капли отмечается подвижность бактерий. Наблюдается их рост при температуре + 41 °С.
Культуры образовывали пигмент, в первые дни росли на МПА в виде отдельных колоний, в дальнейшем сливаясь в сплошной налет окрашивая агар в зеленый цвет, на бульоне давали рост, в виде помутнения равномерного зеленого цвета, по всему столбику. Образуют сероводород - при посеве в МПБ индикаторная бумага, пропитанная ацетатом свинца, окрашивалась в черно-бурый цвет. Индол не образуют - при посеве культур в среду Строгова индикаторная бумага не поменяла цвет.
Тест на каталазу показал положительный результат - при нанесении 1 мл 1 % перекиси водорода на культуру, наблюдали образование пузырьков газа в слое нанесенной жидкости. При посеве культуры в 12% желатину наблюдается протеолитическая активность в виде разжижения среды.
Биологические свойства изученных штаммов P. aeruginosa после 32 лет хранения соответствовали возбудителю данной инфекции. Параллельно с определением жизнеспособности и сохранности биологических свойств, проведено определение процента жизнеспособных клеток. Процент выживаемости штаммов возбудителя синегной инфекции, хранящихся на протяжении 32 лет снизился на 60-85% к первоначальному числу жизнеспособных клеток.
Для поддержания биологических свойств штаммов, в том виде, в котором они были выделены первоначально, проводили их периодические пассажи через организм чувствительных моделей - белых мышей (6). Пассаж штаммов P. aeruginosa, показал восприимчивость белых мышей к возбудителю синегнойной инфекции, наблюдался падеж животных в течение 3 - 6 суток после введения культур. При вскрытии лабораторных животных наблюдалась свойственная для данной инфекции паткартина -окрашивание внутренних органов в специфичный для данной инфекции зеленоватый цвет. Выделенную культуру проверили по свойствам и провели ее лиофилизацию. Затем ампулы визуально проверены на целостность, лиофилизированные культуры на жизнеспособность и сохранность биологических свойств. После проверки оформлены паспорта на штаммы, данные внесены в Журнал
учета движения патогенных биологических агентов «Д» и Карту индивидуального учета коллекционного патогенного биологического агента (в соответствии с СП 3.3686-21), затем лиофилизированные штаммы заложены на долгосрочное хранение и занесены в опись штаммов, хранящихся в холодильнике.
Рисунок - Рост штамма Pseudomonas aeruginosa; A - в виде расплывчатых непрозрачных, круглых, слизистых колоний на МПА; Б - рост в виде равномерного помутнения на МПБ
IV1H
Заключение. Полученные результаты свидетельствуют, что исследуемые штаммы синегнойной инфекции, хранившиеся в лиофилизированном виде на протяжении 32 лет, соответствуют паспортным данным. Штаммы жизнеспособны, однако процент их выживаемости штаммов снизился на 60-85% к первоначальному числу жизнеспособных клеток. При этом биологические свойства исследуемых штаммов остались стабильными в течение срока наблюдения, что достигнуто благодаря созданию оптимальных условий хранения коллекционных штаммов, отвечающих современным требованиям по ведению коллекционных фондов Государственными коллекциями патогенов.
Финансирование исследования. Работа выполнена в соответствии с Государственным заданием по теме: 07.18.2022.05/03.5-4 «Изучение биологических характеристик штаммов заразных и особо опасных болезней животных и их стабильности в процессе длительного хранения».
Список источников
1. Молчанова Е. В., Агеева Н. П. Научно-методические аспекты совершенствования деятельности коллекции патогенных микроорганизмов Волгоградского научно-исследовательского противочумного института // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; N° 95 (3). С.117-126.
2. Раевский А.А. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Материалы межд. научно-практ. конф. / Щелково. 2003. С. 61 - 64.
3. Саттарова Р.С. Биологические свойства бактерий рода Moraxella, выделенных в Республике Казахстан / Р.С. Саттарова, Ф.А. Бакиева, К. Е. Боранбаева, А.Е. Аскарова, Г.Н. Спиридонов // Ветеринарный врач. - 2023. - № 1. - С. 15-20.
4. Спиридонов А.Г. Биологические свойства бактерий Clostridium perfringens, выделенных в регионе Среднего Поволжья от больных анаэробной энтеротоксемией телят / А.Г. Спиридонов, А.Ф. Махмутов, Г.Н. Спиридонов [и др.] // Ветеринарный врач. - 2022. - № 1. - С. 41-46.
5. Рахманин П.П. Производство ветеринарных биологических препаратов в России //Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы междунар. научно-практ. конф., посвещенной 35-летию тнститута. Щелково, 2005. С.12-15.
6. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. М.: Медицина, 1990, 223с.
7. Новгородова А.Ю. Экологические аспекты бактерий рода Pseudomonas на территории Украины // Сельскохозяйственные науки и аграрнопромышленный комплекс на рубеже веков. 2014. № 35. С.167-251.
8. Методические рекомендации по бактериологической диагностике синегнойной инфекции: Официальное издание: утверждены Начальником Главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР 15 августа 1984 г. № 3082-84 / разработаны сотрудником Ивано-Франковского медицинского института (С. Т. Дзюбак). - М.: Министерство здравоохранения СССР, 1984. - 19 с.
9. Хранение штаммов Francisella tularensis 15 НИИЭГ и Brucella abortus 19 ВА в жизнеспособном состоянии путем их глубокого замораживания / А. Н. Малахаева, О. Ю. Ляшова, О. П. Плотников, А. В. Осин // Проблемы особо опасных инфекций. 2015. № 1. С. 63-66.
10. СанПиН 3.3686-21. Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней: санитарно-эпидемиологические правила и нормативы: издание официальное: утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача РФ А. Ю. Поповой 28 января 2021 г. № 4: введены впервые: дата введения 2021-01-09 // Официальный электронный фонд правовых и нормативно-технических документов. - URL: https://docs.cntd.ru/document/573660140 (дата обращения: 15.11.2022).
References
1. Molchanova E. V., Ageeva N. P. Scientific and methodological aspects of improving the activities of the collection of pathogenic microorganisms of the Volgograd Anti-Plague Research Institute // Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2018; No. 95 (3). P. 117 - 126.
2. Raevsky A.A. Scientific basis for the production of veterinary biological products. Materials int. scientific-practical conf. / Shchelkovo. 2003. P. 61 - 64.
3. Etiology, pathogenesis and measures to combat necrobacteriosis in cattle / D. A. Khuzin, Kh. N. Makaev, F. A. Khusniev [etc.] // Veterinary doctor. 2010. № 5. P. 49-51.
4. Specific prevention of keratoconjunctivitis in cattle caused by the bacteria Moraxella bovis and Moraxella bovoculi / G.N. Spiridonov, L.Sh. Dupleva, I.T. Khusainov, A.S. [and etc.] // Veterinarian. Kazan. 2019. № 4. P. 8-13.
5. Rakhmanin P.P. Production of veterinary biological preparations in Russia //Scientific principles of production of veterinary biological preparations: Materials of the international. Scientific-practical Conf., dedicated to the 35th anniversary of the Institute. Shchelkovo, 2005. P.12-15.
6. Belyakov V.D., Ryapis L.A., Ilyukhin V.I. Pseudomonas and Pseudomonas. M.: Medicine, 1990, 223 p.
7. Novgorodova A.Yu. Ecological aspects of bacteria of the genus Pseudomonas on the territory of Ukraine // Agricultural sciences and agrarian-industrial complex at the turn of the century. 2014.№ 35. P.167-251.
8. Methodological recommendations for the bacteriological diagnosis of Pseudomonas aeruginosa infection: Official publication: approved by the Head of the Main Sanitary and Epidemiological Directorate of the USSR Ministry of Health on August 15, 1984 No. 3082-84 / developed by an employee of the Ivano-Frankivsk Medical Institute (S. T. Dzyubak). - M.: Ministry of Health of the USSR, 1984. - 19 p.
9. Storage of strains Francisella tularensis 15 NIIEG and Brucella abortus 19 VA in a viable state by deep freezing / A. N. Malakhaeva, O. Yu. Lyashova, O. P. Plotnikov, A. V. Osin // Problems of especially dangerous infections. 2015. № 1. P. 63-66.
10. SanPiN 3.3686-21. Sanitary and epidemiological requirements for the prevention of infectious diseases: sanitary and epidemiological rules and regulations: official publication: approved by the decree of the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation A. Yu. Popova January 28, 2021 No. 4: introduced for the first time: date of introduction 2021-01-09 // Official electronic fund of legal and regulatory documents. - URL: https://docs.cntd.ru/document/573660140 (access date: 11/15/2022).
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с
написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 16. 05. 2024;
© Артемьева Е. А., Мельникова Л. А, Мустафина Э. Н., Панкова Е.В., Равилов Р.Х., Садыкова С.В. 2024
