CC BY
95
УДК 578.85/86.083:2:577.152
Изучение штаммов вируса шарки сливы
Ю.Н. ПРИХОДЬКО,
начальник отдела диагностики
ФГБУ«ВНИИКР»
Е.С. МАЗУРИН,
заведующий лабораторией
молекулярных методов
Т.С. ЖИВАЕВА, Ю.А. ШНЕЙДЕР,
Е.Е. СОКОЛОВА,
научные сотрудники
отдела диагностики
e-mail: [email protected]
Шарка сливы - наиболее вредоносная болезнь косточковых плодовых культур. Ее возбудитель - вирус PPV - включен в списки ограниченно распространенных карантинных объектов Перечней ЕОКЗР и Российской Федерации.
Лаборатория вирусологии Всероссийского центра карантина растений совместно с сотрудниками его филиалов и территориальных управлений Россельхознадзора проводит систематические обследования насаждений косточковых культур на территории Российской Федерации на наличие PPV. В 20072010 гг. очаги шарки сливы выявлены в 10 регионах: на персике и сливе - в Краснодарском крае; на вишне и сливе - в Белгородской и Самарской областях, на вишне войлочной и сливе - в Московской области, на сливе - в Волгоградской, Воронежской, Липецкой, Ростовской, Тамбовской областях и Ставропольском крае [2].
Идентифицировано 7 штаммов вируса шарки: PPV-D, PPV-M, PPV-C, PPV-W, PPV-EA, PPV-Rec и PPV-T.
Штамм PPV-D распространен повсеместно в Европе и выявлен также в Аргентине, Казахстане, Канаде, Пакистане, Китае, Тунисе, США, Чили и на Кипре. Изоляты этого штамма обнаружены практически на всех восприимчивых растениях рода Prunus, а из культивируемых видов они заражают преимуще-
ственно сливу и абрикос, реже персик.
Штамм PPV-М широко распространен в восточной части Средиземноморского бассейна, в центральной и юго-восточной Европе, наиболее вредоносен для персика, но заражает также сливу.
Изоляты штамма PPV-Rec, представляющие собой естественные рекомбинанты между штаммами PPV-D и PPV-М, выявлены в нескольких центральноевропейских и восточноевропейских странах и заражают почти исключительно сливу [3, 6].
Штаммы PPV-EA и PPV-T имеют ограниченное распространение и эндемичны соответственно для дельты реки Нил в Египте и окрестностей города Анкары в Турции [9].
О выявлении PPV на вишне и черешне сообщалось из нескольких европейских стран: России, Молдавии, Болгарии, Венгрии,Чехии, Италии [1, 6], но принадлежность этих изолятов к штамму PPV-C (Cherry) установлена лишь в Молдавии и Италии.
Штамм PPV-W (Winona) ранее был известен лишь на одном участке в Канаде [6, 7], однако затем появились сообщения о выявлении PPV-W-подобных изолятов в США на растениях сливы, импортированных из Украины [8], на растении Prunus nigra в Ботаническом саду МГУ и в Латвии [5].
Штаммы вируса шарки различаются по последовательности нукле-отидов вирусной РНК, антигенной специфичности, эпидемиологическим свойствам и патогенности для различных видов косточковых культур. Знание штаммового состава PPV крайне важно для разработки стратегии борьбы с этим вирусом.
В соответствии с общепринятыми методиками для идентификации
штаммов PPV нами были использованы штаммспецифичные моно-клональные антитела и праймеры, PCR-RFLP и сиквенирование продуктов амплификации.
Для серологической идентификации использовали моноклональные антитела производства фирмы «Agritest» (Италия): 4DG5 (специфичные к штамму PPV-D), Al (специфичные к штаммам PPV-M, PPV-Rec и PPV-T), AC и EA-24 (специфичные соответственно к штаммам PPV-C и PPV-EA).
RT-PCR проводили с использованием следующих штаммспецифич-ных праймеров: к штамму PPV-D -праймеры P1/PD [3] и М1/М5 [10], к штамму PPV-M - праймеры P1/PM [3] и М6/М7 [10], к штамму PPV-Rec -праймеры mM3/mD5, к штамму PPV-C - праймеры М10/М11 [10], к штамму PPV-W - праймеры 3174-sp-R1/3174-sp-F3 [7]. За исключением mM3/mD5 все остальные пары праймеров разработаны к различным участкам гена белка оболочки PPV.
Реакции обратной транскрипции проводили с наборами ООО «Агро-диагностика» и ПК ЗАО «Диалат Лтд» по рекомендуемым режимам.
Реакции амплификации проводили с мастер-миксами ПК ЗАО «Диалат Лтд». Концентрации праймеров и термоциклические условия ПЦР соответствовали таковым в оригинальных методиках. ПЦР ставили на амплификаторе «Mastercycler Personal» фирмы «Eppendorf».
Результаты RT-PCR регистрировали после проведения электрофореза в 1,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в гель-документирующей системе «Quantum-ST-4-1500». Размер продуктов ПЦР определяли, используя маркеры молекулярного веса «GeneRuler™ 100» и «FastRuler™» («Fermentas»).
В PCR-RFLP продукты из 243 п.о., амплифицируемые праймерами Р1/Р2, очищали с использованием набора «Gene JET PCR» фирмы «Fermentas» и подвергали обработ-
ке рестриктазами Rsa1 и Alu1, используя инструкцию фирмы-производителя («СибЭнзим»). Разделение продуктов после рестрикции выполняли в 2 % агарозном геле в течение 3 ч с напряжением тока 5В на 1 см геля. Известно, что изоляты штамма PPV-D имеют сайты рестрикции Rsa1 и Alu1, изоляты штаммов PPV-M, PPV-Rec и PPV-T - лишь сайт рестрикции Alu1, а в геноме изолятов штаммов PPV-C и PPV-W оба этих сайта рестрикции отсутствуют.
Полученные продукты амплификации подвергали прямому секве-нированию. Последовательности после секвенирования выравнивали при помощи программы «BioEdit». Выровненные последовательности анализировали в приложении «BLAST NCBI».
Для филогенетического анализа последовательности выравнивали с помощью программы «ClastalW» (Программа для множественного выравнивания последовательностей ДНК и белков) и анализировали в программе «MEGA 4.0».
Изоляты штамма PPV-D выявлены нами на вишне войлочной и сливе в Московской области и на сливе в Краснодарском и Ставропольском краях, Волгоградской, Воронежской, Липецкой и Тамбовской областях. Все эти изоляты реагировали с моноклональными антителами линии 4D, праймерами P1/PD, имели сайты рестрикции Rsa1 и Alu1. Сик-венсы продуктов этих изолятов (243 п.о.), амплифицируемые праймерами Р1/Р2, на 97-100 % соответствовали таковым у референтных изолятов штамма PPV-D в ген-банке данных.
Изоляты RD-2, KrK-18 и KrK-20 были дополнительно подвергнуты анализу с использованием прайме-ров М1/М5, специфичных к штамму PPV-D. Полученные специфические продукты величиной 159 п.о. были секвенированы. Их последовательности также оказались на 97 % (изо-лят RD-2) и 99 % (изоляты KrK-18 и KrK-20) аналогичны сиквенсам мно-
30
гочисленных изолятов штамма PPV-D в генбанке.
Согласно проведенному филогенетическому анализу все идентифицированные российские изоляты штамма PPV-D образуют один большой кластер с различными референтными изолятами PPV-D и четко дистанцируются от референтных изолятов штаммов PPV-Rec, PPV-M, PPV-EA, PPV-W и PPV-C.
Изоляты штамма PPV-М идентифицированы нами на персике в Краснодарском крае и на сливе в Ставропольском крае. Во всех случаях зараженные растения имели происхождение из бывшей Югославии. Эти изоляты реагировали с моноклональными антителами линии AL, праймерами P1/PM, имели сайт рестрикции Alu1, но не имели сайта Rsa1, а сиквенсы их продуктов амплификации (243 п.о.) на 97-100 % соответствовали последовательностям нуклеотидов референтных изолятов штамма PPV-М. Принадлежность изолятов KrD-32, KrD-33, KrD-44 и KrD-45 к штамму PPV-M была дополнительно подтверждена с использованием праймеров М6/М7 и секвенированием полученных специфических продуктов величиной 207 п.о.
Российские изоляты штамма PPV-M образуют один кластер с референтными изолятами штаммов PPV-M/PPV-Rec (o6, J4c, SK-68) и филогенетически неродственны изолятам штаммов PPV-D (Vulcan, PENN2, Fantasia), PPV-EA, PPV-W и PPV-C. При этом изоляты StM-7, StM-11, StM-13, StG-27, StG-34 и StG-38 составили одну подгруппу с изолятами штамма PPV-Rec J4c (Польша) и об (Сербия), а изоляты StG-44 и KrD-44 оказались наиболее филогенетически близки к изо-ляту SK-68 штамма PPV-M из Венгрии.
По сиквенсу продукта 207 п.о., амплифицированного праймерами М6/М7, изолят KrD-32 оказался наиболее генетически близок(98 %) к изолятам штамма PPV-M RS1, RS2 и PS из Сербии и SK1 из Словакии.
Последовательность нуклеотидов аналогичного продукта изолята KrD-44 на 99 % соответствовала таковой изолята GR-2 из Греции и на 98 % - 14 другим изолятам штамма PPV-M из Сербии, Венгрии, Греции, Болгарии, Словакии, Италии и Франции.
Для установления возможной принадлежности выявленных изо-лятов к штамму PPV-Rec необходимы дополнительные исследования. Как известно, штаммы PPV-M и PPV-Rec не различаются по последовательности нуклеотидов в гене белка оболочки, но изоляты штамма PPV-Rec имеют участки генома, характерные для штамма PPV-D в генах NIb и HC-Pro-P3 [5]. В настоящее время нами проводится работа по расшифровке последовательности нуклеотидов для данных генов PPV.
Изоляты штамма PPV-C (Cherry) выявлены нами в Белгородской области на вишне (BelR-19) и вишне-черешневом подвое формы П-7 (BelR-131) и в Самарской области на вишне (SamS-24).
Данные изоляты реагировали с поликлональными антисыворотками, универсальными праймерами Р1/Р2 и М2/М3/М4 и праймерами CsoC-2/HsoC-2 или М10/М11, специфичными к штамму PPV-C.
Полученные продукты амплификации были секвенированы и сравнены с сиквенсами двух изолятов PPV-C, имеющимися в генбанке: изолята SoC, выявленного на вишне в Молдавии, и изолята SwC, описанного на черешне в Италии [4].
Для изолятов BelR-19 и BelR-131 последовательность нуклеотидов продукта 243 п.о., амплифициро-ванного праймерами Р1/Р2, на 99 % и 98 % соответствовала участку 9346-9566 полных сиквенсов референтных изолятов SoC и SwC соответственно. Последовательность нуклеотидов продукта 224 п.о., ам-плифицированного праймерами М10/М11, у изолята BelR-19 на 99 % аналогична участку 8588-8768 референтных изолятов SoC и SwC.
Изоляты BelR-19 и BelR-131 образуют один кластер с изолятами SoC и SwC штамма PPV-C и генетически неродственны другим штаммам PPV. Принадлежность этих изолятов к штамму PPV-C подтверждает также отсутствие сайтов рестрикции Rsa1 и Alu1 на 3'конце гена белка оболочки.
К неожиданным результатам следует отнести широкое распространение в Российской Федерации штамма PPV-W (Winona). Изоляты этого штамма выявлены в Московской области на вишне войлочной (изолят RD-4) и сливе (изоляты TSXA-851(W), RD-1(W), STNB-1, STNB-2, BL-1), а также на сливе в Белгородской (изоляты BelB-1, BelB-6, BelT-122), Воронежской (изолят VorR-85), Ростовской (изолят Ros-1, Ros-2) областях и Ставропольском крае (изолят StP-2).
Все эти изоляты не имеют сайтов рестрикции Rsa1 и Alu1 на 3'конце гена белка оболочки (продукты 243 п.о., амплифицированные праймерами Р1/Р2), реагируют с универсальными моноклональными антителами линии 5В, но не реагируют с моноклональными антителами, специфичными к штаммам PPV-D, PPV-M, PPV-C и PPV-EA.
Помимо реакции с универсальными праймерами Р1/Р2 большинство из вышеперечисленных изолятов реагировало также с праймерами 3174spR1/3174spF3 [7], разработанными для идентификации изоля-та штамма PPV-W W3174 (Канада). Исключение составили изоляты BelB-1 и BelB-6, Ros-1 и Ros-2, которые не реагировали с праймера-ми 3174spR1/3174spF3.
Продукты амплификации 243 п.о. (праймеры Р1/Р2) и 327 п.о. (праймеры 3174spR1/3174spF3)всех вышеперечисленных изолятов были секвенированы.
По сиквенсам продуктов 243 п.о. констатирована высокая идентичность российских изолятов штамма PPV-W с референтным изолятом W3174: для изолятов STNB-1, STNB-2, RD-4 - 99 %, RD-1(W),
BelB-1, BelB-6, BelT-122 - 98 %, VorR-85 - 97 %, StP-2 - 96%, TSXA-851(W) - 95 %. Эти продукты соответствовали участку 9340-9586 генома изолята W3174, т.е. 3'концу гена белка оболочки и начальному участку 3'NTR. Более низкая идентичность изолятов VorR-85 и StP-2 обусловлена заменой большего числа нуклеотидов на данном участке их генома по сравнению с другими изолятами.
Согласно проведенному филогенетическому анализу изоляты STNB-1, STNB-2, RD-4, BelT-122, BelB-1, BelB-6, VorR-85 и StP-2 образуют один кластер с референтным изолятом штамма PPV-W (W3174), заметно дистанцируются от изолятов штамма PPV-C и группы самарских изолятов и не родственны изолятам штаммов PPV-D, PPV-M и PPV-EA. К изоляту W3174 филогенетически наиболее близки изоляты из Московской области (STNB-1, STNB-2, RD-4), а наименее - изоляты из Белгородской (BelB-1, BelB-6) и Воронежской (VorR-85) областей.
По сиквенсам продуктов 327 п.о. (праймеры 3174spR1/3174spF3) идентичность российских изолятов штамма PPV-W с референтным изолятом W3174 составила: для изолятов RD-1 (W), RD-4 - 96 %, BelT-122 - 95 %, StP-2 - 94 %, VorR-85 - 93 %, TSXA-851 (W), STNB-1, STNB-2 - 92-94 %. Полученные сиквенсы продуктов 327 п.о. соответствовали участку 8665-9001 генома изолята W3174, т.е. 5'концу гена белка оболочки PPV. Наиболее существенные различия констатированы для участка 8716-8860, на котором у российских изолятов наблюдаются многочисленные замены и вставки нуклеотидов по сравнению с геномом изолята W3174.
В Самарской области в долине реки Сок нами выявлен целый ряд изолятов PPV, отличающихся по серологическим и генетическим свойствам от всех известных штаммов этого вируса. Изоляты SamS-1, SamS-3, SamS-5, SamS-7, SamS-21
и SamS-22 выявлены на растениях вишни в двух кварталах сада ОПО «Сокское» Самарского НИИ садоводства и лекарственных растений «Жигулевские Сады» (кварталы были раскорчеваны в 2008 г сразу после выявления болезни). Изолят SamМ-41 обнаружен на растении вишни сорта Саратовская малышка на дачном участке, а изолят SamМ-40 - на дикорастущем растении сливы неизвестного происхождения.
Все эти изоляты реагировали с поликлональными антителами к PPV различных фирм, но не реагировали со всеми испытанными моноклональными антителами, включая универсальные моноклональные антитела линии 5В. Следует подчеркнуть, что в литературе ранее не было отмечено фактов отсутствия реакции какого-либо изолята PPV с моноклональными антителами линии 5В.
Данные изоляты эффективно выявлялись универсальными прайме-рами Р1/Р2. Изоляты SamS-1, SamS-3, SamS-5, SamS-7, SamS-21 и SamS-22 не реагировали со всеми испытанными штаммспецифич-ными праймерами, а для изолятов SamМ-40 и SamМ-41 установлена слабая и крайне нестабильная реакция с праймерами Р1/PD и 3174spR1/3174spF3.
PCR-RFLP продуктов 243 п.о., амплифицированных праймерами Р1/Р2, показал отсутствие у самарских изолятов сайтов рестрикции Rsa1 и А1и1, что характерно для штаммов PPV-C и PPV-W. Однако по расшифрованным последовательностям данных продуктов самарские изоляты оказалось невозможно отнести к какому-либо штамму, поскольку их идентичность со штаммами PPV-D, PPV-C и PPV-W составила всего 92-94 %.
Согласно филогенетическому анализу изоляты SamS-3, SamS-5, SamS-22, SamМ-40 и SamМ-41 образуют четкий обособленный кластер. Эти изоляты филогенетически наиболее близки штамму PPV-C, более отдаленно - штамму PPV-W,
но отчетливо дистанцируются от штаммов PPV-D, PPV-M и РРМ-ЕА.
Комплекс изученных свойств позволяет сделать предварительный вывод о принадлежности изолятов PPV из Самарской области к ново-
му, ранее неизвестному штамму этого вируса. Окончательное подтверждение открытия нового штамма PPV станет возможным после получения полных сиквенсов РНК этих изолятов.
УДК 632.92
Уссурийский
Ю.И. ГНИНЕНКО, заведующий лабораторией Всероссийского НИИ лесоводства и механизации лесного хозяйства М.С. КЛЮКИН, младший научный сотрудник e-mail: [email protected]
Уссурийский короед Polygraphus proximus Blandford (1894) сравнительно недавно проявил себя как опасный вредитель пихты в ряде регионов европейской части страны и в Сибири.
Первоначально он был обнаружен близ Санкт-Петербурга в 1999 г. [2], но это не вызвало тревоги у специалистов и фактически прошло незамеченным. Лишь после того, как короед стал причиной гибели пихт в окрестностях Москвы, опасность стала очевидной [4].
В 2009 г. очаги уссурийского короеда были выявлены в Красноярском крае [3]. В 2010 г. в результате специального обследования пихтарников Кемеровской области, в которых с 2005 г отмечались очаги «пальце-ходного лубоеда», нами было установлено, что это тоже очаги уссурийского короеда. Из-за ошибочного определения видовой принадлежности фитофага, повреждающего пихтарники, время для разработки адекватных мер защиты было упущено [1].
Как теперь установлено, очаги уссурийского короеда на площади более 5,2 тыс. га «действовали» в Кемеровской области еще в 2005 г. (табл. 1). Обнаружение очагов на такой большой площади свидетельствует о том, что фитофаг проник сюда значительно раньше. Установить дату его проникновения в настоящее время вряд ли возможно, но с высокой долей уверенности можно утверждать, что это произошло не менее, чем за 10 лет до 2005 г. После завоза короеда с лесом из регионов Дальнего Востока в середине 1990-х годов должно было пройти не менее 3-5 лет, чтобы фи-
ЛИТЕРАТУРА
1. Приходько Ю.Н., Чирков С.Н., Метлицкая К.В., Цубера Л.В. Распространенность вирусных болезней косточковых культур в европейской части России // Сельскохозяйственная биология, 2008, № 1, с. 26-32.
2. Приходько Ю.Н., Живаева Т.С,. Шнейдер Ю.А, Шероколава Н.А. Распространенность и диагностика вируса шарки слив (PPV) в Российской Федерации // «Биоресурсы и вирусы», тезисы докладов VI международной конференции. - Киев, 2010, с. 238-239.
3. Candresse T., Macquaire G., Lanneau M., Bousalem M., Quiot-Douine L., Quiot J.B., Dunez J. Analysis of plum pox virus variability and development of strain-specific PCR assays // Acta Horticulturae, 1995, № 386, р. 357-369.
4. Fanigliulo A., Comes S., Maiss E., Piazzolla P., Crescenzi A. The complete nucleotide sequence of Plum pox virus isolates from sweet (PPV-SwC) and sour (PPV-SoC) cherry and their taxonomic relationships within the species // Arch. Virol. 2003, vol. 148, p. 2137-2153.
5. Glasa M. A large scale effort to analyze the Plum pox virus diversity worldwide. Abstracts of the SharCo Research Workshop. September 6-7, 2010, Sofia, Bulgaria, p. 17.
6. EPPO, 2006. Current status of Plum pox virus and sharka disease worldwide // Bulletin OEPP/EPPO, 2006, vol. 36, p. 205-218.
7. James D., Varga A. Nucleotide sequence analysis of Plum pox virus isolate W3174: Evidence of a new strain // Virus Research, 2004, vol. 110, p. 143-150.
8. Mavrodieva V., Mock R., Levy L. Molecular characterization of PPV isolates from plum germplasm illegally imported from Ukraine. Abstracts of the 20th International Symposium on Virus and Virus-like Diseases of Temperate Fruit Crops, May 22-26, 2008, Antalya, Turkey, p. 112.
9. Myrta A., Varga A., James D. The complete genome sequence of an El Amar isolate of plum pox virus (PPV) and its phylogenetic relationship to other PPV strains // Archives of Virology, 2006, vol. 151, p. 1189-1198.
10. SzemesM., KalmanM., VertaA., BosciaD., NemrthM., KolberM., DorgaiL. Integrated RT-PCR/nested PCR diagnosis for differentiating between subgroups of plum pox virus // Journal of Virological Methods, 2001, v. 92, p. 165-175.
Аннотация. Проведена идентификация штаммов вируса шарки сливы (PPV), выявленных на косточковых культурах в различных регионах Российской Федерации. Для этого были использованы штаммспецифичные моноклональные антитела и праймеры, PCR-RFLP и сиквенирование полученных продуктов амплификации. Констатировано широкое распространение штамма PPV-D. Изоляты штамма PPV-M выявлены лишь в Краснодарском и Ставропольском краях на персике и сливе. Штамм PPV-C идентифицирован на вишне в Белгородской и Самарской областях. Ранее считающийся малораспространенным штамм PPV-W выявлен в Белгородской, Воронежской, Московской областях и Ставропольском крае. В Самарской области обнаружены изоляты PPV, отличающиеся по серологическим и молекулярным свойствам от всех известных штаммов этого вируса.
Ключевые слова. Вирус шарки сливы, косточковые культуры, штаммы PPV, ИФА, ПЦР, праймеры, RFLP, сиквенирование.
Abstract. It was to study the prevalence of the Plum pox virus strains (PPV), detected on stone fruit crops in different regions of the Russian Federation. The strain specific monoclonal antibodies and primers, PCR-RFLP and sequencing of the obtained amplification products was used for this purpose. Stated widespread of the PPV-D strain. Isolates PPV-M strain was detected only in the Krasnodar and Stavropol regions on peaches and plums. PPV-C strain was identified on the cherry plants in the Belgorod and Samara regions. Previously considered to be less common strain of PPV-W was detected in Belgorod, Voronezh, Moscow and Stavropol regions. In Samara region it was detected the unusual isolates of the PPV, differed by serological and molecular properties of all known strains of this virus.
Keywords. Plum pox virus, stone fruits, strains PPV, ELISA, PCR primers, RFLP, sequencing.
