CC BY
41
УДК [59.088:597-113.4.08]:597-1.044
В. Н. Крючков, Д. А. Дремкова, Ю. С. Показеева
ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТОВ У РЫБ В НОРМЕ И ПРИ ТОКСИКОЗАХ
Введение
Оценка иммунной реактивности рыб необходима при проведении различного рода исследований.
Иммунологическая природа трансплантационных реакций стала известна после работ П. Медавара [1]. Среди первых работ по трансплантологии костистых рыб были работы В. Хильдемана [2], установившего, что отторжение трансплантата у костистых рыб происходит в те же сроки, что и у наземных позвоночных.
Метод аллотрансплантации стал применяться при решении различных вопросов, например для выявления степени родства между внутривидовыми группировками рыб и даже популяциями, пока для этих целей не были предложены адекватные методы биохимической генетики [3, 4]. Затем появился цикл работ, выполненных Л. А. Добринской [5], где иммунологическая дифференциация рыб исследована при помощи реакции трансплантации. По мнению М. И. Абраменко [6, 7], при помощи трансплантации могут быть решены задачи селекционно-генетического плана, а именно: проверка однородности гиногенетических карпов, карасекарповых гибридов, оценка степени иммуногенетического сходства рыб различного происхождения, выяснение некоторых вопросов эволюции рыб.
Одним из вопросов, который может решаться с применением метода аллотрансплантации, является оценка иммунного статуса рыб при различного рода внешних воздействиях [8, 9]. При этом среди доступных нам источников мы не встретили работ, которые показывали бы влияние интоксикации на течение реакций отторжения, кроме работ, выполненных в Астраханском государственном техническом университете [10]. Ответная реакция организма при токсическом влиянии не всегда однозначна, она может определяться характером воздействующего агента. Кроме того, в зависимости от исходного физиологического состояния токсичные агенты могут вызывать как одинаковые, так и различные изменения иммунофизиологического статуса. Следует отметить, что реагирование отдельных компонентов защитной системы организма может иметь автономный характер и не совпадать по времени и направленности изменений. Именно поэтому оценивать иммунофизиологическое состояние рыб после токсического воздействия следует с помощью целого комплекса показателей (например, отражающих функционирование как иммунной системы, так и неспецифических защитных реакций) или же попытаться выявить, насколько регистрируемые изменения иммунофизиологических параметров характеризуют такое понятие, как общая резистентность. Как известно, основной задачей иммунной и связанной с ней систем является защита организма от патогенов. Одним из доступных и информативных методов оценки иммунной реактивности может являться метод аллотрансплантации. Преимуществами данного метода может быть то, что реакция отторжения аллотрансплантата специфична, а главное то, что она может быть легко оценена количественно.
Материал и методы исследований
В качестве объекта исследования были использованы карп (беспородный чешуйчатый) Cyprinus carpió (L.) и карась Carassius auratus gibelio (Bloch.). Для количественной оценки одной из специфических иммунных реакций, из которых складывается иммунологическая реактивность, использовалась реакция отторжения аллотрансплантата. Методика проведения трансплантации у рыб довольна проста. Чешуйки у рыб легко выдергиваются - их не надо вырезать, затем чешуйка вставляется в другой чешуйный карман, их которого только что была удалена собственная чешуйка. Каждая отдельная чешуйка становится первичным трансплантатом. Чешуйки обладают хроматофорами, которые легко подсчитываются. Если трансплантат пересажен в методическом отношении правильно, то он хорошо приживается, становясь антигенным раздражителем, и вызывает специфическую иммунную реакцию.
Для контроля приживления аллотрансплантатов проводилась пересадка гомотрансплантатов, т. е. чешуйки у одной особи пересаживали с одного участка кожи на другой. Приживление происходило примерно у 80 % трансплантатов, пересаженные гомотрансплантаты выживали в течение всего периода наблюдения за ними (до 1 месяца), отторжения гомотрансплантатов не происходило.
Реакцию отторжения трансплантата оценивали по следующим параметрам: количество хроматофоров в эпидермисе чешуи [2], длительность воспалительной реакции вокруг аллотрансплантата, время выживания аллотрансплантата.
При оценке уровня содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови пользовались ускоренным способом определения по реакции с раствором сульфата цинка, основанном на измерении оптической плотности растворов и пересчете единиц оптической плотности в г% [11]. Количество иммуноглобулинов (ИГ, г%) рассчитывали по формуле
а
ИГ =----------0,1442,
0,4924
где а - оптическая плотность пробы.
Количество лейкоцитов в периферической крови определяли в счетной камере [12].
В качестве токсикантов использовали соли меди и кадмия.
Результаты исследований и их обсуждение
Пересадка чешуи, которая становится первичным аллотрансплантатом, вызывает у рыбы-реципиента общую и местную ответную реакцию. Это обусловлено тем, что белок чешуи -склеропектин обладает ярко выраженными антигенными свойствами [13]. Наблюдения показали, что после трансплантации чужеродной чешуи наблюдается рост гиперпластической ткани хозяина, многочисленные кровоизлияния в капиллярах и гиперемия в зоне, прилегающей к ткани реципиента. Пересаженные аллотрансплантаты сначала васкуляризируются, но затем наблюдается полный стаз, за которым следует гибель трансплантата.
После восстановления кровообращения в пересаженном трансплантате количество хрома-тофоров несколько увеличилось, что также является подтверждением приживления аллотрансплантата. Если среднее количество хроматофоров в одной чешуйке карася составляло 48,47 ± 3,70, а у карпа - 62,3 ± 4,4 шт., то через трое суток после пересадки первичного трансплантата их количество увеличилось соответственно до 65,50 ± 4,20 и 77,5 ± 6,1 шт. (табл. 1).
Таблица 1
Изменение количества хроматофоров в чешуе рыб при реакции отторжения первичного аллотрансплантата
^Длительность, ^-\сут Вид рыб 0 3 5 7 9
Карп 62,3 ± 4,4 77,5 ± 6,1 19,8 ± 1,1 2,6 ± 0,5 0
Карась 48,47 ± 3,70, 65,50 ± 4,20 9,5 ± 0,9 0 -
Восстановление кровообращения играет двоякую роль в будущей судьбе трансплантата. С одной стороны, восстановление полноценного кровообращения необходимо для нормального приживания трансплантата, а с другой - при восстановлении кровотока иммунная система реципиента распознает антиген (белки чешуйки донора). В результате происходит распознавание чужеродного трансплантата лимфоцитами и фагоцитирующими клетками хозяина и развивается реакция отторжения.
О начале реакции отторжения можно судить по уменьшению количества хроматофоров. Так, на пятые сутки после пересадки первичного трансплантата число хроматофоров заметно уменьшилось: у карася до 9,5 ± 0,9, у карпа - до 19,8 ± 1,1 шт.
Проявление видимых признаков начала реакции реципиента на трансплантат зависит в том числе и от температуры воды (табл. 2). Так, при ґ = 25 °С воспалительная реакция начиналась в среднем через 4,5 ± 0,3 суток, при ґ = 17 °С - через 8,8 ± 0,50 суток, при температуре 14-15 °С - через 9,1 ± 0,58 суток.
Таблица 2
Длительность выживания первичных чешуйных трансплантатов карпа при различных значениях температуры воды
Температура воды, °С Начало воспаления, среднее время и его пределы, дни Среднее время выживания и его пределы, дни
25 M ± m ^, % M ± m ^, %
4,5 ± 0,3 (3-6) 20,48 7,8 ± 0,35 (7-10) 13,8
16-18 8,8 ± 0,50 (6-13) 25,41 13,35 ± 0,69 (9-18) 22,63
14-15 9,1 ± 0,58 (3-7) 19,31 15,6 ± 1,58 (10-19) 18,58
Кроме отмирания хроматофоров, видимыми признаками начавшейся реакции отторжения было появление небольших кровоизлияний в кожу вокруг пересаженной чешуйки. Затем в течение нескольких дней кровоизлияние усиливалось. Кровоизлияние было заметным в течение 3-5 и более дней, затем его симптомы начинали уменьшаться. Одновременно с уменьшением видимых признаков воспаления исчезала пигментация чешуйки.
Если хроматофоры принадлежат аллотрансплантатам, то они обречены, впрочем, как впоследствии и сами аллотрансплантаты. При дальнейшем течении реакции отторжения чешуйка полностью теряла пигментацию, становясь мутной, т. е. гибель чешуйки начиналась с гибели хроматофоров в покрывающем чешую эпителии. В это время геморрагии вокруг аллотрансплантата сохранялись, хотя стали уменьшаться.
Кровоизлияние вокруг трансплантата возникало вследствие того, что в ответ на антигенное раздражение со стороны чужой ткани вокруг трансплантата собираются иммунокомпетент-ные клетки реципиента. Этот процесс находил свое отражение в изменении клеточного состава периферической крови.
Известно, что важная роль в развитии сосудистых и тканевых изменений в зоне воспаления отводится эмигрирующим лейкоцитам. Они освобождают в зону воспаления комплекс ферментов и биологически активных соединений, которые, с одной стороны, могут оказывать повреждающее действие и усугублять процессы альтерации (повреждения при первой фазе воспаления), а с другой - обеспечивают развитие местных неспецифических механизмов защиты [14]. Выделяемые лимфоцитами лимфокины, по-видимому, играют в реакции отторжения двоякую роль. С одной стороны, по свидетельству Э. Купера [13], они вместе с лимфоцитами-эффекторами принимают участие в реакции разрушения трансплантата, с другой стороны, одним из механизмов разрушения чешуйного трансплантата у рыб является, по-видимому, то, что активная миграция к очагу воспаления лейкоцитов усугубляет нарушение микроциркуляции в области трансплантата. Именно нарушение нормального кровоснабжения и, как следствие, нормального питания привело на первых этапах реакции отторжения к гибели хроматофоров, что четко визуально идентифицируется. Деструкция трансплантата клетками инфильтрата сопровождается закупоркой сосудов трансплантата и его гибелью в результате ишемии [15].
При максимальном развитии воспаления в крови отмечалось повышение абсолютного количества лейкоцитов до 47,8 ± 3,28 тыс. шт./мкл при 37,9 ± 3,78 тыс. шт./мкл в контроле и 33,8 ± 3,50 тыс. шт./мкл при начале воспаления.
Одна из фаз воспаления (экссудация) характеризуется в том числе и эмиграцией клеток в зону воспаления. Исходя из этого вполне объяснимо уменьшение относительного количества моноцитов и нейтрофилов в периферическом кровяном русле (рис. 1).
250 -г
К I II III
Рис. 1. Изменение количества нейтрофилов в периферической крови карпа (шт./мкл) при реакции отторжения первичного аллотрансплантата:
К - контроль; I - начало воспаления; II - сильное воспаление; III - отторжение. МН - миелоциты;
ММН - метмиелоциты; ПЯН - палочкоядерные нейтрофилы; СЯН - сегментоядерные нейтрофилы
Нейтрофильные лейкоциты являются активными фагоцитами, они очищают зону воспаления. Кроме того, они могут являться источником синтеза кининов, комплекса лизосомальных ферментов и др. В ходе реакции отторжения была выявлена устойчивая тенденция к уменьшению количества в крови незрелых форм нейтрофилов: миелоцитов - от 206,74 ± 1,26 до 35,82 ± 12,87 шт./мкл при произошедшей реакции отторжения; метмиелоцитов - от 134,06 ± 4,8 до 53,68 ± 7,56 шт./мкл.
Что касается зрелых нейтрофилов, то на начальной стадии отторжения трансплантата (сильное воспаление) отмечалось значительное увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов -до 179,42 ± 30,11 шт./мкл, затем их количество в периферической крови уменьшалось до 9,16 ± 0,11 шт./мкл, а после завершения реакции отторжения возвращалось к первоначальному уровню.
Моноциты, эмигрировавшие в зону воспаления, превращаются в тканевые макрофаги. По-видимому, накопление макрофагов в зоне воспаления произошло за счет эмиграции моноцитов из кровеносного русла, что делает вполне объяснимым уменьшение их количества.
Активность иммунокомпетентных клеток приводит к активизации целого комплекса иммунных реакций. Так, после пересадки чешуи на 4 сутки, когда стали проявляться первые симптомы воспаления вокруг трансплантата, количество иммуноглобулинов в сыворотке крови уменьшилось с 0,26 ± 0,07 до 0,1 ± 0,039 г%. О причинах снижения уровня иммуноглобулинов можно только предполагать. В дальнейшем, на 5-7 сутки, в зависимости от индивидуальных особенностей рыб или от температуры воды, произошло повышение содержания иммуноглобулинов до уровня, близкого к первоначальному. Повышение содержания иммуноглобулинов до 0,78 ± 0,02 г% было отмечено при отторжении чешуи. Не мог не заинтересовать вопрос о дальнейшем количестве иммуноглобулинов в крови после отторжения чешуи. Несмотря на некоторый разброс показателей, прослеживалась тенденция к сохранению повышенного уровня иммуноглобулинов еще в течение 7-10 суток. Более длительные наблюдения не велись. Повышенный уровень иммуноглобулинов в крови может быть связан с тем, что чужеродный белок склеропектин, обладающий антигенными свойствами, кроме воспалительных реакций, вызвал в организме рыбы-реципиента образование специфических антител, принадлежащих к классу белков-иммуноглобулинов. Динамика уровня иммуноглобулинов в крови при отторжении трансплантата представлена на рис. 2.
Рис. 2. Изменение концентрации иммуноглобулинов в периферической крови карпа, г%, при реакции отторжения аллотрансплантата. К - контроль; I - начало воспаления;
II - сильное воспаление; III - отторжение; IV - через 10 суток после отторжения
Теперь покажем, как интоксикация влияет на течение реакции отторжения первичного че-шуйного трансплантата у карпа. Рыбам, предварительно выдержанным в растворе меди с концентрацией Си2+ 0,50 и С<12+ - 0,25 мг/л, были пересажены единичные чешуйные трансплантаты. Пересадка аллотрансплантатов вызывала воспалительные реакции, которые возникали в среднем на 10-14 день от момента пересадки чешуйки. Гиперемия наблюдалась в течение нескольких дней (от 5 до 10), затем постепенно исчезала. Гибели меланофоров в чешуйках не отмечалось. Чешуйки оставались живыми в течение всего периода наблюдения после пересадки (до 30 дней) у 24 % рыб. У остальных рыб отторжение произошло, но время выживания трансплантатов увеличилось в среднем до 25 суток, т. е. отмечалось значительное угнетение иммунной реактивности подопытных рыб (табл. 2).
Таблица 2
Длительность выживания первичных чешуйных трансплантатов у карпа при действии токсикантов
Условия Начало воспаления, среднее время и его пределы, сут Среднее время выживания трансплантата и его пределы, сут Т емпература воды, °С
М ± т СУ, % М ± т СУ, %
Контроль 9,1 ± 0,58 (3-7) 19,31 15,6 ± 1,58 (10-19) 18,58 14-16
Интоксикация Си2+ 0,50 мг/л, 40 сут 11,2 ± 0,52 (8-14) 20,36 25,6 ± 1,58 (17-30) 18,58 14-16
Интоксикация Cd2+ 0,25 мг/л, 40 сут 13,87 ± 0,93 (10-17) 17,81 31,50 ± 1,25 (28-36) 10,52 14-16
Токсическое действие кадмия в концентрации 0,25 мг/л вызвало следующие изменения в продолжительности реакции отторжения чешуйного аллотрансплантата. Прежде всего следует отметить, что интоксикация кадмием не оказала действия на приживаемость трансплантат. Приживалось около 80 % пересаженных чешуек (как и у рыб контрольной группы). Первые симптомы реакции отторжения в виде начинающегося кровоизлияния в области трансплантата у отравленных рыб появились только на 10 сутки (в среднем через 13,87 ± 0,93 суток). Кровоизлияния были выражены менее ярко. В отдельных случаях отмечалась лишь незначительная гиперемия. Следует отметить, что, как правило, внешнее проявление воспалительной реакции было связано с последующей судьбой трансплантата. При незначительном кровоизлиянии в ткани, окружающие пересаженную чешуйку, можно было с большой долей вероятности ожидать, что отторжение не произойдет.
Изменения некоторых показателей, характеризующих течение реакции отторжения, представлены в табл. 3.
Таблица 3
Сравнительная характеристика реакции отторжения первичного аллотрансплантата у рыб,
подвергнутых интоксикации
Показатель До трансплантации Начало воспаления Сильное воспаление Отторжение
Количество лейкоцитов, тыс. шт./мкл Контроль 39,3 ± 3,78 35,26 ± 3,50 48,7 ± 3,28 36,3 ± 3,45
Интоксикация Си2 + 0,50 мг/л, 40 сут 25,4 ± 0,78 34,5 ± 4,92 27,3 ± 80,6 26,8 ± 1,31
Интоксикация С^ + 0,25 мг/л, 40 сут 19,25 ± 2,68 20,12 ± 3,14 27,34 ± 4,56 26,72 ± 2,40
Иммуно- глобулины, г% Контроль 0,26 ± 0,07 0,1 ± 0,039 0,26 ± 0,08 0,78 ± 0,02
Интоксикация Си2 + 0,50 мг/л, 40 сут 0,17 ± 0,02 0,15 ± 0,04 0,10 ± 0,01 0,22 ± 0,08
Интоксикация С^ + 0,25 мг/л, 40 сут 0,48 ± 0,13 0,20 ± 0,08 0,25 ± 0,06 0,19 ± 0,02
Предварительное выдерживание в растворе кадмия привело в том числе и к снижению количества лейкоцитов в крови карпа до 19,25 ± 2,68 тыс. шт./мкл. Во время воспалительной реакции количество лейкоцитов у рыб контрольной группы увеличилось на 23 %, а у отравленных -на 42 %, хотя в абсолютном выражении у рыб контрольной группы увеличение количества лейкоцитов было больше. Следует отметить, что у рыб, у которых отторжение чешуи не произошло, увеличение количества лейкоцитов в крови было незначительным и недостоверным (приблизительно на 10 %).
У рыб, отравленных медью (0,50 мг/л), до трансплантации количество лейкоцитов в периферической крови составляло 25,4 ± 0,78 тыс. шт./мкл. Начало воспалительной реакции сопровождалось существенным увеличением этого показателя. Затем произошло уменьшение количества лейкоцитов практически до первоначального уровня.
Воздействие кадмия (еще до пересадки чешуи) привело к увеличению содержания иммуноглобулинов в крови до 0,48 ± 0,13 г%. Пересадка чешуи у отравленных рыб, в отличие от рыб контрольной группы, не вызвала повышения уровня содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови. Обращает на себя внимание то, что динамика иммуноглобулинов в крови рыб, подвергшихся интоксикации, сходна как при пересадке чешуи, так и при содержании в чистой воде без пересадки аллотрансплантата. Вполне вероятно, что после воздействия кадмия организм реципиента в значительной степени теряет способность реагировать на антигены склеропекти-на, а изменение уровня иммуноглобулинов происходило в связи с теми процессами, которые имели место при токсическом влиянии ионов кадмия.
Предварительное выдерживание рыб в растворе меди привело к тому, что при реакции отторжения наблюдалось весьма незначительное увеличение концентрации иммуноглобулинов.
Таким образом, после пересадки первичного чешуйного аллотрансплантата происходит типичная реакция отторжения чужеродной ткани. Воздействие аллотрансплантата находит свое отражение в изменении как клеточной, так и гуморальной составляющих иммунитета. По нашему мнению, основной механизм отторжения чешуйного аллотрансплантата - нарушение кровообращения, приводящее к недостаточному питанию трансплантата и, как следствие, к его гибели и отторжению. В пользу этого предположения свидетельствуют данные патогистологического анализа прилегающих к трансплантату тканей.
Токсическое действие меди и кадмия приводило к снижению иммунной реактивности карпа, что проявилось в увеличении времени выживания первичного аллотрансплантата более чем в 2 раза.
Реакция отторжения аллотрансплантата может быть применена в ихтиотоксикологиче-ских экспериментах для оценки степени угнетения иммунной реактивности рыб.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Medavar P. B. The behavior and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits // J. Anat. - 78. -P. 176-199.
2. Hildeman W. H. Scale homotransplantations in goldfish (Carassius auratus) // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1957. -64, N 5. - P. 775.
3. Балахнин И. А. Опыт применения реакции преципитации для выявления родственных связей рыб // Вопросы ихтиологии. - 1964. - Т. 4, вып. 3. - С. 595-598.
4. Закс М. Г., Соколова М. М. Иммуно-серологические различия между отдельными стадами нерки // Вопросы ихтиологии. - 1961. - Вып. 4. - С. 707-715.
5. Добринская Л. А. Иммунологическая дифференциация видов и популяций рыб // Тр. Ин-та экологии растений и животных Урал. филиала АН СССР. - 1973. - Вып. 86. - С. 95-106.
6. Абраменко М. И. Опыт применения трансплантации тканей для исследования особенностей размножения у серебряного карася и его гибридов с карпом // Генетика. - 1984. - Т. 20, № 6. - С. 1036-1042.
7. Абраменко М. И. Закономерности функционирования популяций однополо-двуполого комплекса серебряного карася (Carassius auratus gibelio) Азовского бассейна: дис. ... д-ра биол. наук. - Астрахань, 2008. - 462 с.
8. Балахнин И. А., Неборачек И. С. Влияние интенсивности освещения на процесс отторжения аллотрансплантатов чешуи у годовиков карпа // 8 науч. конф. по экол. физиол. и биохимии рыб: тез. докл. - Петрозаводск, 1992. - С. 19-20.
9. Балахнин И. А., Неборачек И. С. Трансплантационные реакции у рыб. Критический анализ // Экология. - 1992. - № 6. - С. 62-66.
10. Крючков В. Н., Хади М. С., Алиновская Ю. Б. Реакция отторжения аллотрансплантата рыб при интоксикации // Материалы Междунар. конф., посвященной 70-летию АГТУ. - Астрахань, 2000. - С. 255-258.
11. Воловенко М. А. Определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови новорожденных телят // Ветеринария. - 1975. - № 4. - С. 100-104.
12. Иванова Н. Т. Атлас клеток крови рыб. - М.: Легкая и пищ. пром-сть, 1982. - 184 с.
13. Купер Э. Сравнительная иммунология. - М.: Мир, 1980. - 422 с.
14. Патологическая анатомия и физиология / М. К. Недзьведь, Е. Д. Черствой, А. А. Кривчик, Е. В. Леонова: учеб. пособие. - Минск: Вышэйш. шк., 1997. - 208 с.
15. Петров Р. В. Иммунология. - М.: Медицина, 1987. - 415 с.
Статья поступила в редакцию 30.09.2009
STUDYING OF THE PROCESSES OF REJECTION OF FISH GRAFTS IN NORMAL CONDITIONS AND DURING TOXICOSIS
V. N. Kruchkov, D. A. Dremkova, Yu. S. Pokazeeva
The features of the process of scaly allograft rejection of a crucian and a carp in usual conditions and after intoxication have been studied. Changes of cellular structure of peripheral blood at initial allograft rejection are shown. It is proved that as a result of antigenic influence of the transplanted scales concentration of immunoglobulin increases. Toxic action of copper and cadmium led to decrease of immune reaction of a carp that resulted in increase in survival time of initial allograft more than twice. Allograft rejection can be applied in ich-thyotoxicological experiments to estimate the degree of depression of fish immune reaction.
Key words: initial allograft, rejection, toxicant.
