CC BY
32
УДК 544.12:543.429.23:544.165:544.353.3
ИЗУЧЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОГО СТРОЕНИЯ ГЛЮКОНАТА КАЛЬЦИЯ В ВОДНОМ РАСТВОРЕ
1АХМЕТОВ М. М., 2КОНЫГИН Г. Н., 2РЫБИН Д. С., 1 ПЕТУХОВ В. Ю., 1ГУМАРОВ Г. Г., 1КОНОВ А. Б.
1Казанский физико-технический институт им. Е.К. Завойского КазНЦ РАН, 420029, г. Казань, ул. Сибирский тракт, д. 10/7
Физико-технический институт Уральского отделения РАН, 426000, г. Ижевск, Кирова, 132
АННОТАЦИЯ. Проведено изучение пространственного строения глюконата кальция в водном растворе. Показано, что молекулы глюконата существуют в виде двух конформаций: зигзагообразной 1-Р и циклической 30+. Обнаружено образование межмолекулярных водородных связей и изменение пространственного строения молекул при увеличении концентрации раствора.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: молекулярное строение, ядерный магнитный резонанс, бионеорганические соединения.
ВВЕДЕНИЕ
Биохимические реакции, протекающие в живых организмах, являются стереоспецифичными: характер взаимодействия реагентов существенно определяется их пространственным молекулярным строением и возможностями их взаимной подстройки, в том числе, конформационной. Кинетика реакций в значительной степени лимитируется стереоорганизацией реагентов на стадии их взаимодействия в физиологических жидкостях. Таким образом, реакционная способность и биологическая активность многих органических соединений зависят от их конформационного состава и равновесия в растворах, изучение которых является одной из актуальных задач стереохимии. В частности, это утверждение справедливо для углеводов и их производных, таких как глюконовая кислота и ее соли [1], находящих применение в фармацевтике благодаря их малой токсичности и широкой вовлеченности в процессы метаболизма. Существует ряд работ, посвященных исследованию конформации альдоновых кислот с применением метода ЯМР [2]. В частности, в работе [3] приведены результаты исследований конформаций глюконовой кислоты в водном растворе.
Известно, что полигидроксикарбоксилаты изолируют ион кальция в растворе [4].
2+
В щелочной среде могут образовываться высокостабильные комплексы с Са [5, 6], при этом ион металла связывается с алкоголятной группой карбогидрата. Однако при промежуточных рН такого депротонирования не происходит. Поэтому стабильность кальциевого комплекса оказывается очень слабой.
Пространственное строение глюконата кальция в растворе не совсем ясно. Весьма
вероятно, что депротонированный карбоксилат включается в комплексообразование.
Однако, исходя из констант формирования, образование монодентантного комплекса
маловероятно, т.к. простые монокарбоксилаты в аналогичных условиях формируют более
2+
слабые комплексы с Са , чем анион глюконовой кислоты [7]. Весьма вероятен вклад спиртовой группы при С2 (пятичленное хелатное кольцо), C3 (шестичленное хелатное кольцо) или C6 в комплексообразование [3]. В настоящей работе приводятся результаты исследований стереоорганизации глюконата кальция в водном растворе методом ЯМР, которые могут быть полезны для понимания роли этого соединения в биологических системах.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
В качестве исходных были взяты образцы моногидрата глюконата кальция (рис. 1), подвергнутые предварительной форвакуумной сушке.
Образцы глюконата кальция взвешивались на электронных весах с точностью до 1 микрограмма с последующим растворением порошка в дейтерированной воде (чистота 99,9%, производство «ТатХимРеактивы») объёмом 600 мкл при комнатной температуре 295 К в полимерной колбе. Контроль температуры в резонаторе осуществлялся с помощью термопары с точностью до 0,1 К. Перемешивание проводилось до получения однородного прозрачного раствора в течение 5 минут. Далее раствор переливался в специальную ампулу диаметром 5 мм для проведения ЯМР-эксперимента. Таким способом были получены растворы с концентрациями 0,9; 0,45; 0,18 и 0,07 %.
H
НО
H H ОН н он
:/ / / -о
5 3,- XV
Л
но H
И он
H H
H он
H ОН
ч
о.
о
,Са
Н20
но
H он
н он
\
о
Рис. 1. Структурная формула моногидрата глюконата кальция
Спектры записывались с использованием специализированной импульсной последовательности, которая позволяет снизить интенсивность сигнала от протонов молекул воды. При этом сигнал от протонов воды не перекрывает полезные сигналы от интересующего нас вещества. Количество сканов составляло 64, и время эксперимента -порядка 8 минут. Время, затрачиваемое на один эксперимент с момента растворения и до окончания записи спектра, составляло порядка 15 минут.
Спектры ЯМР были получены на спектрометре AVANCE 400 фирмы BRUKER, магнитное поле которого составляет 9,395 Тл. Резонанс на ядрах 1Н в растворах глюконата кальция наблюдался при помощи РЧ-импульса с частотой ~ 400 МГц. Для установления связей между отдельными ядрами молекул использовалась импульсная последовательность гомоядерной корреляционной спектроскопии - 1H-1H COSY, позволяющая обнаружить ядра одного типа (в данном случае протонов), которые расположены недалеко друг от друга (на расстоянии нескольких химических связей).
Измерения проводились при комнатной температуре (295 К), в качестве эталона для калибровки 1Н ЯМР спектров использовался чистый бензол с известным значением химического сдвига 7,36 м.д.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1Н ЯМР спектры раствора глюконата кальция в D2O при концентрациях раствора 0,9; 0,45; 018; 0,07 % представлены на рис. 2. С уменьшением концентрации происходит как смещение линий, так и изменение их формы. Наиболее заметное изменение химического сдвига наблюдается для Н2 и Н3 (табл. 1).
5, ррт
Рис. 2. 1Н ЯМР спектры глюконата кальция в Б20 при различных концентрациях раствора
Таблица 1
Значения химических сдвигов, полученные в результате моделирования спектров 1Н ЯМР глюконата кальция для различных концентраций раствора
Концентрация раствора, % Химический сдвиг, м. д.
Ш Ю Ш Ш Ш Ш'
0,07 4,378 4,275 4,0 4,0 4,056 3,889
0,18 4,393 4,285 4,0 3,995 4,055 3,889
0,45 4,405 4,293 4,0 3,988 4,049 3,886
0,9 4,417 4,298 4,0 3,98 4,042 3,881
Известно, что концентрационная зависимость химического сдвига на протонах указывает на перераспределение системы водородных связей. В частности, на формирование водородных связей указывает смещение линий в область слабых полей [8]. В нашем случае линии Н2 и Н3 смещаются в область слабых полей с увеличением концентрации, что указывает на формирование межмолекулярных водородных связей между молекулами глюконата кальция.
Следует отметить, что водородные связи для протонов Н2 и Н3 типа С-Н-О являются относительно слабыми и имеют энергию связи порядка 4 - 6 кДж/моль (обычные водородные связи типа О-Н- О имеют энергию связи порядка 15 - 20 кДж/моль) [9]. На малость энергии образующихся водородных связей указывает также и относительно малый сдвиг линий с изменением концентрации. В то же время линии, соответствующие концевым протонам, незначительно сдвигаются в область сильных полей - соответствующие водородные связи рвутся с ростом концентрации раствора.
С другой стороны, в зависимости от концентрации меняется форма большинства линий, что указывает на изменение констант спин-спинового взаимодействия (КССВ). Значения КССВ, определённые в результате моделирования спектров с использованием программы Mnova NMR 11.0 (Mestrelab Research SL), приведены в табл. 2.
Таблица 2
Значения КССВ, полученные в результате моделирования спектров 1Н ЯМР глюконата кальция для различных концентраций раствора и соответствующие значения для глюконовой кислоты в соответствии с работой [2]
Концентрация раствора, % Значения КССВ, Гц
зт т23 3т т34 3т т45 3т т56 3т т56' 2т т66'
0,07 3,45 3,1 8,4 3,2 7,5 -12
0,18 3,45 3,1 8,4 3,2 7,5 -12
0,45 3,45 3,2 8,4 3,2 7,5 -12
0,9 3,45 3,2 7,9 3,2 6,6 -12
Гл. кислота 3,55 2,55 8,20 3,00 5,30 -1050
Подгонка модельных спектров к экспериментальным осуществлялась по расстоянию между компонентами линий, соответствующих различным группам протонов. Результат моделирования экспериментального ЯМР-спектра для концентрации раствора 0,9 % приведён на рис. 3.
4.45 4.40 4.35 4.30
4.05 4.00 3.95 3.90 3.85
8, ppm
Рис. 3. Модельный и экспериментальный 1Н ЯМР спектр при концентрации 0,9 %
Согласно кривой Карплуса [10], значения вицинальных КССВ связаны с величиной торсионных углов между направлениями связей атомов водорода и углерода. Как видно из табл. 2, при изменении концентрации от 0,45 до 0,9 % меняются вицинальные КССВ 145 и 3156', что указывает, в частности, на изменение торсионного угла между атомами водорода Н4-Н5 и Н5-Н6'. Обе пары этих протонов находятся в антипараллельной (транс) конфигурации, при этом торсионный угол при Н4-Н5 с ростом концентрации раствора приближается к идеальной транс конформации (8 Гц), а при Н5-Н6' отдаляется. Таким образом, конформация молекулы глюконата кальция зависит от концентрации раствора при больших ее значениях, что, вероятно, связано с образованием межмолекулярных водородных связей.
Значения констант спин-спинового взаимодействия (КССВ), полученные нами для глюконата кальция, незначительно отличаются от соответствующих величин для глюконовой кислоты (табл. 2), полученных в работе [2]. Это позволяет считать подобными конформации молекул глюконовой кислоты и глюконата кальция в водном растворе. При этом значения КССВ, полученные для глюконовой кислоты, интерпретированы в рамках динамического равновесия между двумя конформациями: зигзагообразной (1-Р) и циклической 30+. В зигзагообразной конформации углеродный скелет лежит в одной плоскости, и стабилизируется хорошо выраженными внутримолекулярными водородными связями -О(С4)Н-- О(С2) (гидроксильные группы при С2 и С4) и более слабыми связями -О(С2)Н-- О(С1). Циклическая 30+ форма образуется из планарной путем вращения по связи С3-С4 остатка углеродного скелета на 120о против часовой стрелки [11] (рис. 4). При этом предполагается, что равновесие сдвинуто в сторону зигзагообразной конформации. Следует отметить, что обе указанные конформации ранее были обнаружены для глюконата калия [12] в монокристаллическом состоянии методом трёхмерной рентгеновской дифракции и глюкаровой кислоты [13] в растворе в D2O методом 1Н ЯМР.
36+
Рис. 4. Конформации глюконата кальция в водном растворе: планарная (зигзагообразная) 1-Р (верхний рисунок) и циклическая 30+ (нижний рисунок).
Пунктиром обозначены водородные связи
Приведенная модель согласуется с нашими данными по изменению торсионных углов с изменением концентрации. Очевидно, что если существует внутримолекулярная водородная связь -О(С4)Н-- О(С2), то торсионные углы при С2-С3 и С3-С4 оказываются закрепленными. Появление дополнительных межмолекулярных связей при увеличении концентрации раствора приводит к изменению оставшихся относительно свободными торсионных углов на С4-С5 и С5-С6', что и наблюдается на эксперименте.
Как следует из табл. 1, наибольшие различия в КССВ для глюконата кальция и глюконовой кислоты обнаруживаются для протонов Н3-Н4 (+0,65), Н5-Н6' (+1,3) и Н6-Н6' (+1,5). С одной стороны, это заметное приближение торсионного угла при Н3-Н4 к «идеальной» гош-конфигурации (3 Гц) и угла при Н5-Н6' к идеальной транс-конфигурации. С другой стороны, эти изменения должны быть связаны с атомом кальция (заменой протона на ион кальция).
Одним из возможных объяснений может быть образование хелатных колец, в частности хелатного кольца Са-О(С6). Двумерные спектры ЯМР Са-Н указывают на то [3], что в водном растворе ион кальция взаимодействует с O(C2) и O(C3) с образованием двух типов равновесных хелатных структур: пятичленной и шестичленной. Квантово-химические расчеты не подтверждают формирование пятичленного хелатного кольца. Однако экспериментально установлено [3], что кальций действует как мультидентантный центр, причем энергетически более выгодно пятичленное кольцо.
Гомоядерный 2D спектр ЯМР глюконата кальция, снятый по методу COSY, приведен на рис. 5. Наблюдаются кросс пики разной интенсивности, указывающие на взаимодействие соответствующих протонов. Интенсивные кросс пики от соседних протонов в молекуле глюконата кальция указывают на преимущественно зигзагообразную конфигурацию молекулы. Относительно малая интенсивность кросс пика Н3-Н4, вероятно, связана с тем, что протоны Н3-Н4 в конформации 1-Р находятся в гош-положении, а в 3G+ - в транс. Как и в случае глюконовой кислоты, равновесие сильно сдвинуто в сторону зигзагообразной конфигурации.
4.50 4.3 5 4.20 4.0 5 3.90
t"2 (мд)
Рис. 5. 2D ЯМР спектр (COSY) раствора глюконата кальция
Наблюдается также относительно слабый кросс пик Н3-Н6', который не наблюдается на модельном 2Б ЯМР-спектре (рис. 6). Использованы значения химических сдвигов и КССВ, полученные для одномерного 1Н ЯМР спектра глюконата кальция при концентрации раствора 0,9 %. Данный кросс пик может указывать на присутствие циклической конформации, в частности, на хелатный комплекс, обусловленный взаимодействием кислорода гидроксильной группы О(С6) с атомом кальция.
ВЫВОДЫ
Методом 1Н ЯМР обнаружены конформационные превращения молекулы глюконата кальция, которые являются следствием формирования межмолекулярных водородных связей при увеличении концентрации водного раствора. Наблюдаемое концентрационное поведение конформации глюконата кальция указывает на наличие внутримолекулярной водородной связи -О(С4)Н- • О(С2), обнаруженной ранее для молекулы глюконовой кислоты.
Возможная циклизация обусловлена взаимодействием кислорода гидроксильной группы при концевом атоме углерода 0(С6) с атомом кальция, т.е. с формированием полидентантного центра. Однако основная конформация, как и в случае с глюконовой кислотой, зигзагообразная.
Исследование выполнено при финансовой поддержке ФАНО темы № АААА-А17-117022250038-7, №АААА-А17-117031710050-8 и частично в рамках научного проекта РФФИ № 16-03-01131.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Whitfield D. M., Stojkovsky S., Sarkar B. Metal coordination to carbohydrates. Structures and function // Coordination Chemistry Reviews, 1993, vol. 122, pp. 171-225. doi: 10.1016/0010-8545(93)80045-7
2. Horton D., Walaszek Z., Ekiel I. Conformational of D-gluconic, D-mannonic, and D-galactonic acids in solution, as determined by n.m.r. spectroscopy // Carbohydrate Research, 1983, vol. 119, pp. 263-268. doi: 10.1016/0008-6215(83)84063-4
3. Pallagi P., Sebok P., Forgo T., Jakusch I., Palinko P., Sipos S. Multinuclear NMR and molecular modeling investigations on the structure and equilibria of complexes that form in aqueous solutions of Ca2+ and gluconate // Carbohydrate Research, 2010, vol. 345, pp. 1856-1864. doi: 10.1016/j.carres.2010.05.009
4. Gyurcsik B., Nagy L. Carbohydrates as ligands: coordination equilibria and structure of the metal complexes // Coordination Chemistry Reviews, 2000, vol. 203, pp. 81-149. doi: 10.1016/S0010-8545(99)00183-6
5. Van Loon L. R., Glaus M. A., Vercammen K. Solubility products of calcium isosaccarinate and calcium gluconate // Acta Chemica Scandinavica, 1999, vol. 53, pp. 235-240. doi: 10.3891/acta.chem.scand.53-0235
6. Rhai D., Hess N. J., Xia Y., Rao L., Cho H. M., Moore R. C., Van Loon L. R. J. Comprehensive thermodynamic model applicable to highly acidic to basic conditions for isisaccarinate reactions with Ca(II) and Np(IV) // Journal of Solution Chemistry, 2003, vol. 32, pp. 665-689. doi: 10.1023/B:J0SL.0000002988.99769.cb
7. Martell A. E., Smith R. M. Critical Stability Constants. New York and London: Plenum Press, 1974. 469 p.
8. Марч Дж. Органическая химия. Реакции, механизмы и структура. В 4-х томах. Т. 1. Пер. с англ. M.: Мир, 1987. 381 c.
9. Иогансен А. В. Инфракрасная спектроскопия и спектральное определение энергии водородной связи // В сборнике статей «Водородная связь» / под ред. Н.Д. Соколова. М.: Наука, 1981. С. 112-155.
10. Karplus M. Vicinal Proton Coupling in Nuclear Magnetic Resonance // Journal of the American Chemical Society, 1963, vol. 85(18), pp. 2870-2871. doi: 10.1021/ja00901a059.
11. Horton D., Wander J. D. Conformation of Acyclic Derivaties of Sugars. XI. Conformations of the D-Aldopentose Diethyl and Diphenyl Dithioacetals in Solution // Journal of Organic Chemistry, 1974, vol. 39, pp. 13.
12. Jeffrey G. A., Fasiska E. J. Conformation and intramolecular hydrogen-bonding in the crystal structure of potassium D-gluconate monohydrate // Carbohydrate Research, 1972, vol. 21. pp. 187-199. doi: 10.1016/S0008-6215(00)82145-X
13. Horton D., Walaszek Z. Conformations of the D-glucarolactones and D-glucaric acid in solution // Carbohydrate Research, 1982, vol. 105, pp. 95-109. doi: 10.1016/S0008-6215(00)81857-1
THE STUDY OF SPATIAL STRUCTURE OF CALCIUM GLUCONATE IN AQUEOUS SOLUTIONS
1Akhmetov M. M., 2Konygin G. N., 2Rybin D. S., :Petukhov V. Yu., 1Gumarov G. G., 1Konov A. B.
:Zavoisky Physical-Technical Institute RAS, Kazan, Russia
2Physical-Technical Institute of the Ural Branch of RAS, Izhevsk, Russia
SUMMARY. Conformation transformations of calcium gluconate molecules, which are the consequence of the formation of intermolecular hydrogen bonds at the increase in the concentration of the aqueous solution were found by the M NMR method. The observed concentration behavior of the conformation of calcium gluconate indicates the presence of the intramolecular hydrogen bond -О(С4)Н•• О(С2) found earlier for molecules of gluconic acid. It was established that gluconate molecules exist in the form of two conformations: zigzag 1-F and cyclic 3G+. The main cross peaks on homonuclear 2D ^ NMR spectra indicate the preferably zigzag conformation, and the relatively weak cross peak ffi-TO' indicates the formation of the cyclic conformation. The possible cyclization is due to the interaction of oxygen of the hydroxyl group at the end carbon atom 0^6) with the calcium atom, i.e., to the formation of the polydentate center.
KEYWORDS: molecular structure, nuclear magnetic resonance, bio-inorganic compounds. REFERENCES
1. Whitfield D. M., Stojkovsky S., Sarkar B. Metal coordination to carbohydrates. Structures and function. Coordination Chemistry Reviews, 1993, vol. 122, pp. 171-225. doi: 10.1016/0010-8545(93)80045-7
2. Horton D., Walaszek Z., Ekiel I. Conformational of D-gluconic, D-mannonic, and D-galactonic acids in solution, as determined by n.m.r. spectroscopy. Carbohydrate Research, 1983, vol. 119, pp. 263-268. doi: 10.1016/0008-6215(83)84063-4
3. Pallagi P., Sebok P., Forgo T., Jakusch I., Palinko P., Sipos S. Multinuclear NMR and molecular modeling investigations on the structure and equilibria of complexes that form in aqueous solutions of Ca2+ and gluconate. Carbohydrate Research, 2010, vol. 345, pp. 1856-1864. doi: 10.1016/j.carres.2010.05.009
4. Gyurcsik B., Nagy L. Carbohydrates as ligands: coordination equilibria and structure of the metal complexes. Coordination Chemistry Reviews, 2000, vol. 203, pp. 81-149. doi: 10.1016/S0010-8545(99)00183-6
5. Van Loon L. R., Glaus M. A., Vercammen K. Solubility products of calcium isosaccarinate and calcium gluconate. Acta Chemica Scandinavica, 1999, vol. 53, pp. 235-240. doi: 10.3891/acta.chem.scand.53-0235
6. Rhai D., Hess N. J., Xia Y., Rao L., Cho H. M., Moore R. C., Van Loon L. R. J. Comprehensive thermodynamic model applicable to highly acidic to basic conditions for isisaccarinate reactions with Ca(II) and Np(IV). Journal of Solution Chemistry, 2003, vol. 32, pp. 665-689. doi: 10.1023/B:JOSL.0000002988.99769.cb
7. Martell A. E., Smith R. M. Critical Stability Constants. New York and London: Plenum Press, 1974. 469 p.
8. March J. Advanced Organic Chemistry. Reactions, mechanisms and structure. New York: John Wiley & Sons, Inc, 1985.
9. Iogansen A. V. Infrakrasnaya spektroskopiya i spektral'noe opredelenie energii vodorodnoy svyazi [Infrared spectroscopy and spectral definition of hydrogen bonding energy]. V sb. Vodorodnaya svyaz' [In Proc. Hydrogen bonding]. Pod red. N.D. Sokolova. Moscow: Nauka Publ., 1981, pp. 112-155.
10. Karplus M. Vicinal Proton Coupling in Nuclear Magnetic Resonance. Journal of the American Chemical Society, 1963, vol. 85(18), pp. 2870-2871. doi: 10.1021/ja00901a059.
11. Horton D., Wander J. D. Conformation of Acyclic Derivaties of Sugars. XI. Conformations of the D-Aldopentose Diethyl and Diphenyl Dithioacetals in Solution. Journal of Organic Chemistry, 1974, vol. 39, pp. 13.
12. Jeffrey G. A., Fasiska E. J. Conformation and intramolecular hydrogen-bonding in the crystal structure of potassium D-gluconate monohydrate. Carbohydrate Research, 1972, vol. 21. pp. 187-199. doi: 10.1016/S0008-6215(00)82145-X
13. Horton D., Walaszek Z. Conformations of the D-glucarolactones and D-glucaric acid in solution. Carbohydrate Research, 1982, vol. 105, pp. 95-109. doi: 10.1016/S0008-6215(00)81857-1
Ахметов Мансур Миннурович, младший научный сотрудник, лаборатория радиационной химии и радиобиологии КФТИКазНЦРАН, тел. +7-953-4846606, e-mail: [email protected]
Коныгин Григорий Николаевич, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией механоактивации органических систем ФТИ УрО РАН, тел. +7(3412) 72-87-75, e-mail: [email protected]
Рыбин Дмитрий Станиславович, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, лаборатория механоактивации органических систем ФТИ УрО РАН, e-mail: dsrybin@ftiudm. ru
Петухов Владимир Юрьевич, доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией радиационной химии и радиобиологии КФТИ КазНЦ РАН, тел. +7-903-3131359, e-mail: [email protected]
Гумаров Габдрауф Габдрашитович, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, лаборатория радиационной химии и радиобиологии КФТИ КазНЦ РАН, тел. + 7-953-4004218, e-mail: ifoggg@gmail. com
Конов Андрей Борисович, кандидат физико-математических наук, научный сотрудник, лаборатория спиновой физики и спиновой химии КФТИ КазНЦ РАН, тел. +7-927-2462450, e-mail: andrey654@,yandex. ru
