CC BY
22
УДК619:616.9-036.22;619:616.9
ИЗУЧЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ КРОВИ МОРСКИХ СВИНОК, СЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ ИНАКТИВИРОВАННЫМИ МИКОБАКТЕРИЯМИ M. BOVIS, ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ТУБЕРКУЛЁЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
МЯСОЕДОВ Ю.М.,
кандидат биологических наук, ФКП «Курская биофабрика»; e-mail: [email protected].
Реферат. Изучение патогенеза туберкулёза, оценка биологических свойств микобактерий, разработка противотуберкулёзных препаратов и рациональных схем терапии, стандартизирование диагностических методов определения туберкулёзной инфекции осуществляется с использованием лабораторных моделей туберкулёза. Моделирование туберкулёзной инфекции осуществляется при использовании патогенных, непатогенных или инактивиро-ванных микобактерий туберкулёза. Моделирование туберкулёзного процесса при использовании инактивирован-ных микобактерий эпидемиологически безопасно и позволяет осуществлять длительные исследования. Цель исследования: оценка динамики морфологических параметров крови морских свинок при моделировании туберкулёзной инфекции и изучение корреляционной зависимости параметров крови и интенсивности кожной реакции ПЧЗТ (повышенная чувствительность завышенного типа) морских свинок, сенсибилизированных инактивирован-ными микобактериями. Проведенные исследования продемонстрировали положительную зависимость между значением интенсивности кожной реакции ПЧЗТ и содержанием сегментоядерных нейтрофилов, а также отрицательную зависимость между интенсивностью кожной реакции ПЧЗТ и содержанием лимфоцитов. Показано достоверное снижение числа лейкоцитов, лимфоцитов и повышение количества сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов через 30 суток после сенсибилизации морских свинок инактивированными микобактериями M. bovis. Выявлено достоверное снижение количества лейкоцитов, лимфоцитов и увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов моноцитов и эозинофилов после постановки кожного туберкулинового теста. Таким образом, модель туберкулёзной инфекции, предполагающая введение морским свинкам инактивированных микобактерий M. bovis характеризуется развитием начальных стадий туберкулёзного процесса.
Ключевые слова: микобактерии, сенсибилизация, морские свинки, морфология крови.
PARAMETERS STUDYING OF GUINEA PIGS' BLOOD SENSITIZATION HEAT-KILLED MYCOBACTERIMS M. BOVIS AT MODELLING A TUBERCULAR INFECTION
MYASOEDOV Y.M.,
Candidate of Biology Sciences, Kursk biofactory; e-mail: [email protected].
Essay. Tuberculosis is disease studying, an estimation of biological mycobacterium properties, development of antitubercular preparations and rational circuits of therapy. Validation diagnostic methods of a tubercular infection definition is carried out with use of laboratory tuberculosis models. A tubercular infection modelling of is carried out pathogenic, nonpathogenic or heat-killed mycobacterium tuberculosis usage. Tubercular process modelling with heat-killed epidemiology also allows to carry out long researches. The purpose of research is the estimation of morphological dynamics parameters of guinea pigs' blood at the tubercular infection modelling and studying correlation dependence on parameters of blood and skin reaction intensity DTH (delayed-type hypersensitivity) of guinea pigs, sensitization of heat-killed mycobacterium. These researches have shown a positive dependence an value of skin reaction intensity DTH and the contents neutrophils, and negative dependence on intensity of skin reaction DTH and the contents leykocytes. In 30 days after a sensitization of guinea pigs heatkilled mycobacterium M. bovis shown that authentic number of leukocytes and neutrophils quantity, monocytes and eosinophils are increased. Authentic decrease of quantity of leukocytes, lymphocytes and increase of number neutrophils, monocytes and eosinophils after statement skin tuberculin the test is revealed. This is the model of a tubercular infection supposing introduction to guinea pigs of heat-killed mycobacterium M. bovis is characterized by development of initial stages of tubercular process.
Key words: mycobacterium, a sensitization, guinea pigs, morphology of blood
Введение. Изучение патогенеза туберкулёза, оценка биологических свойств микобактерий, разработка противотуберкулёзных препаратов и рациональных схем терапии, стандартизирование диагностических методов определения туберкулёзной инфекции проводится с использованием лабораторных моделей туберкулёза [2, 4]. Лабораторное воспроизведение туберкулёзной инфекции предполагает применение патогенных, непатогенных или инактивированных микобактерий туберкулёза разных видов [11]. Использование патогенных микобактерий ограничено коротким сроком жизни лабораторных животных (морские свинки), а также вероятностью инфицирования здоровых животных и персонала [3, 9]. В тоже время применение апатогенных микобактерий сопряжено с
вероятностью реверсии патогенных свойств [3]. Моделирование туберкулёзного процесса при использовании инактивированных микобактерий не представляет эпидемиологической опасности и позволяет осуществлять длительные исследования [8]. Динамика параметров крови при моделировании туберкулёзной инфекции с применением инактивированных микобактерий изучена не достаточно.
Принимая во внимание вышеизложенное целью исследования было: оценка динамики морфологических параметров крови морских свинок при моделировании туберкулёзной инфекции и изучении корреляционной зависимости параметров крови и интенсивности кожной
реакции ПЧЗТ морских свинок, сенсибилизированных инактивированными микобактериями.
Материал и методика исследования. В исследовании были использованы 24 головы беспородных самок морских свинок альбиносов, массой 500 ±100 г., одновременно полученные из ФГБУ НЦБМТ РАМН Андреевка. Животные были разделены на три равные группы. Группа 1- не сенсибилизированные морские свинки; группа 2-сенсибилизированные морские свинки, через 30 суток, без постановки теста ПЧЗТ; группа 3- сенсибилизированные морские свинки, через 30 суток, животные были использованы для постановки теста ПЧЗТ
Оценку параметров крови осуществляли на гематологическом анализаторе Abacus junior В12 [1]и визуально в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимза [6].
Отбор крови для гематологического анализа на анализаторе Abacus junior у морских свинок осуществляли из сердца, делая прокол во втором межреберье слева на 1-1,5 см краниальнее processus xiphoides [5]. Пробы крови в количестве 200 мкл вносили в пробирки Microvette с ЭД-ТА.
При проведении исследований были использованы микобактерии бычьего вида - M. bovis штамм AN-5, которые выращивали на картофельной среде Павловского, в течение 25 суток, при температуре 37°С. После накопления бактериальной массы питательные среды с посевами инактивировали при температуре 121°С, а из бак. массы приготавливали суспензию на жидком парафине из расчёта мг/см3, после чего суспензию прогревали в течение 30 минут при температуре 100°С. Животных сенсибилизировали в дозе 0,5 см3 внутримышечно, в заднебедренную группу мышц. Через 30 дней после сенсибилизации животные были использованы в опытах.
В исследовании был использован туберкулин очищенный ППД для млекопитающих, сублимированная форма (ФКП «Курская биофабрика»), контрольная серия из которого на фосфатно - буферном растворе приготавливали разведением 20 и 2 МЕ.
Статистическую обработку результатов эксперимента проводили стандартными методами [7].
Результаты исследования. Параметры крови экспериментальных животных оценивали до сенсибилизации, через 30 суток после сенсибилизации, и после постановки
туберкулинового теста. Результаты исследования представлены в таблице 1.
В результате проведенных работ было установлено достоверное снижение числа лейкоцитов через 30 суток после сенсибилизации, и после постановки туберкулинового теста. В эти же сроки одновременно выявлено повышение количества сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов как через месяц после введения ми-кобактерий, так и после постановки аллергического теста.
Оценка интенсивности аллергической туберкулиновой реакции на сенсибилизированных морских свинках продемонстрировала следующие результаты: при использовании дозы 20 МЕ интенсивность составила 17,58 ± 0,57; при применении дозы 2 МЕ значение кожной реакции соответствовало 13,25 ± 0,54. Полученные результаты свидетельствуют об уровне развития сенсибилизации, соответствующем интенсивности моделям туберкулёзного процесса с использованием живых патогенных мико-бактерий [9].
Следующим этапом исследования было определение корреляционной зависимости между интенсивностью кожной реакции ПЧЗТ (суммарное значение доз) и параметрами крови сенсибилизированных морских свинок, через 24 часа после введения разведений ППД туберкулина для млекопитающих. Результаты анализа представлены в таблице 2.
Известно, что развитие туберкулёзной инфекции представляет многостадийный процесс: 1- инфицирование; 2 - начало инфекции; 3 - развитие иммунной реакции организма; 4 - казеация и ускоренное размножение мико-бактерий; 5 - выделение микобактерий в окружающую среду. Так на первом этапе, после проникновения мико-бактерий туберкулёза, бактериальными клетками поглощаются альвеолярными макрофагами. На втором этапе инфекции, фагоцитированные микобактерии реплицируются и разрушают альвеолярные макрофаги, что сопровождается привлечением новых макрофагов, захватом микобактерий и диссеминацией патогенна сначала во внутригрудные лимфатические узлы, а затем по всему организму. Третий этап туберкулёзной инфекции сопровождается снижением количества микобактерий, формированием антибактериальной устойчивости, а также развитием состояния ПЧЗТ [4].
Таблица 1 - Параметры крови морских свинок до сенсибилизации, через 30 дней после сенсибилизации, и после постановки туберкулинового теста__
№ п/п Наименование параметра крови Группа животных
1 (n=8) 2(n=8) 3(n=8)
M±m M±m M±m
1 Лейкоциты х 109/л 11,46±1,73 8,98±1,55* 9,75±0,71*
2 Эритроциты х 1012/л 5,76±0,21 4,94±0,12 5,46±0,14
3 Концентрация гемоглобина, г/л 145,0±5,42 131,0±2,61 143,33±2,01
4 Гематокрит, % 44,66±1,58 39,66±1,06 43,39±0,70
5 Средний объём эритроцитов, фл мкм3 77,50±0,72 80,40±0,60 79,50±0,96
6 Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг. 25,18±0,19 26,46±0,23 26,32±0,43
7 Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л. 324,83±2,24 330,4±3,03 330,67±1,98
8 Широта распределения популяции эритроцитов, % 14,75±0,63 13,8±0,30 13,25±0,23
9 Тромбоциты х 109/л 250±25,0 222,0±34,2 270,83±23,78
10 Тромбокрит, % 0,42±0,06 0,34±0,03 0,34±0,02
11 Средний объём тромбоцитов, фл 5,67±0,12 5,64±0,19 5,63±0,11
12 Широта распределения популяции тромбоцитов, % 35,13±0,19 35,1±0,77 34,58±0,25
13 Нейтрофилы палочкоядерные, % 0,5±0,22 1,4±0,51 0,5±0,34
14 Нейтрофилы сегметоядерные, % 40,67±6,63 50,4±3,25* 46,17±7,58*
15 Моноциты,% 7,33±2,09 10,0±1,41* 10,5±0,72*
16 Лимфоциты,% 50,0±6,66 30,8±4,44* 39,67±7,26*
17 Эозинофилы,% 1,50±0,43 7,4±2,89* 3,17±1,28*
Примечание: *разница достоверна при р<0,05
Таблица 2 - Корреляционная зависимость между интенсивностью кожной реакции ПЧЗТ и параметрами крови сенсибилизированных морских свинок после
Механизм развития ПЧЗТ связан с захватом мико-бактерий туберкулёза антиген презентирующими клетками (моноцитами, полиморфно ядерными нейтрофи-лами) с последующим контактом антиген презенти-рующих клеток с Тх1СБ 4+ клетками. При этом Тх1 клетки продуцируют ИЛ-2, у ИНФ являющиеся активаторами макрофагов, которые стимулируют продукцию Тх1 клеток. Данные процессы происходят в течение 30 суток. После введения микобактериальных антигенов (ППД туберкулина) в сенсибилизированный организм, происходит их фагоцитоз антиген представляющими клетками с последующим взаимодействием антигенов с Тх1 клеткам. Активированные Тх1 клетки продуцируют ИЛ-2, у ИНФ, ФНО-Р, МХФ, что сопровождается активацией макрофагов и притоком в зону попадания туберкулина фагоцитов, приводящих к развитию вос-
палительного процесса, и формированию туберкулиновой реакции [10].
Сопоставляя литературные данные с результатами, полученными в данном исследовании, видно, что моделирование туберкулёзного процесса на морских свинках с использованием инактивированных микобактерий сопровождается следующими этапами: 1 - инфицированием, 2-фагоцитированием тканевыми макрофагами микобакте-риальных частиц и 3 - развитием состояния ПЧЗТ. Так введение инактивированных микобактерий в составе адъюванта соотносится с этапом инфицирования (1 этап). Адъювант обеспечивает длительное поступление антигена в организм и привлечение фагоцитов, что сопровождается в месте введения образованием длительно не рассасывающегося инфильтрата и развитием каскада фагоцитарных реакций (2 этап). Вокруг места введения микобакте-рий формируется соединительнотканная капсула, развивается регионарный лимфаденит с развитием состояния ПЧЗТ в течение 30 суток, выявляемое в кожном тесте с ППД туберкулином для млекопитающих (3 этап). Интенсивность реакции на разные дозы свидетельствует о правильно подобранной дозировке инактивированных мико-бактерий, используемых для моделирования туберкулёзного процесса.
В целом полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что чем выше продукция сегмен-тоядерных нейтрофилов, тем больше интенсивность кожной реакции ПЧЗТ. Вместе с тем отрицательная зависимость, выявленная в отношении лимфоцитов означает, что чем больше супрессия Тх2, тем интенсивность кожной реакции ПЧЗТ выше.
Выводы. Выявлено достоверное снижение числа лейкоцитов, лимфоцитов и повышение количества сег-ментоядерных нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов через 30 суток после сенсибилизации морских свинок инактивированными микобактериями M. bovis. Показано достоверное снижение количества лейкоцитов, лимфоцитов и увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов моноцитов и эозинофилов после постановки кожного туберкулинового теста.
Показано, что интенсивность кожной туберкулиновой реакции ПЧЗТ характеризуется положительной зависимостью в отношении сегментоядерных нейтрофилов, и отрицательной зависимостью с содержанием лимфоцитов.
Модель туберкулёзной инфекции, предполагающая использование инактивированных микобактерий M. bovis в составе адъюванта, характеризуется развитием начальных стадий классического туберкулёзного процесса.
постановки туберкулинового теста
№ п/п Параметр крови r
1 Лейкоциты х 109/л 0,57
2 Эритроциты х 1012/л 0,28
3 Концентрация гемоглобина, г/л 0,58
4 Гематокрит, % 0,42
5 Средний объём эритроцитов, фл мкм3 -0,04
6 Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг. 0,08
7 Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л. 0,3
8 Широта распределения популяции эритроцитов, % -0,22
9 Тромбоциты х 109/л -0,24
10 Тромбокрит, % -0,06
11 Средний объём тромбоцитов, фл 0,57
12 Широта распределения популяции тромбоцитов, % 0,3
13 Нейтрофилы палочкоядерные 0,28
14 Нейтрофилы сегметоядерные 0,78*
15 Моноциты -0,24
16 Лимфоциты -0,75*
17 Эозинофилы -0,34
Примечание:* значение достоверно при р<0,05
Список использованных источников
1. Abacus junior Гематологический анализатор. Руководство пользователя версия 1.1. - 59 с.
2. Кассич Ю.Я. Туберкулез животных и меры борьбы с ним. - Киев: Урожай, 1990. - С. 63-65.
3. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36-й доклад. Серия технических докладов 745. ВОЗ. - Женева. - С. 43.
4. Кошечкин В.А., Иванова З.А. Туберкулёз: учебное пособие. - М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2007. - 303 с.
5. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И.П. Западнюк, В.И. Западнюк, Е.А. Захария, Б.В. Западнюк. - Киев.: Выща Школа, 1983. - С. 235.
6. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С. 15.
7. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.
8. Мясоедов Ю.М. Оценка методов контроля качества микобактериальных аллергенов изготавливаемых с использованием M. Bovis // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2015. - № 8. - С. 209-212.
9. Наставление по диагностике туберкулеза животных. - М., 2002. - 63 с.
10. Шевырев Н.С. Введение в ветеринарную иммунологию. - Курск: Изд-во Курск. гос. с.-х. ак., 1999. - С.193-
11. OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines, 2009. - P. 359-369.
List of sources used
1. Abacus junior Hematology Analyzer. User's manual version 1.1. - 59 p.
2. Kassich Y.Y. Tuberculosis of animals and measures to combat it .- Kiev: Harvest, 1990. - P.63-65.
3. WHO Expert Committee on Biological Standardization. 36th report. Series of Technical Reports 745. WHO.- Geneva. P. 43.
4. Koshechkin V.A., Ivanova Z.A. Tuberculosis: a study guide. - Moscow: GEOTAR-Media, 2007. - 303 p.
5. Laboratory animals. Dilution, content, use in the experiment / I.P. Zapadnyuk, V.I. Zapadnyuk, E.A. Zakharia, B.V. Zapadnyuk. - Kiev .: School Extension, 1983. - P. 235.
6. Laboratory methods of research in the clinic. Reference book / Ed. V.V. Menshikov. - M .: Meditsin, 1987. - P. 15.
7. Lakin G.F. Biometrics. - M .: High school. - 1990, 352 p.
8. Myasoedov Yu.M. Evaluation of quality control methods for mycobacterial allergens manufactured using M. Bovis // Bulletin of the Kursk State Agricultural Academy. - 2015. - No. 8. - P. 209-212.
9. Manual on the diagnosis of tuberculosis of animals. - M., 2002. - 63 p.
10. Shevyrev N.S. Introduction to veterinary immunology. - Kursk, Publishing House of Kursk: State. S.-. Ak., 1999. -P.193-195.
11. OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines, 2009. - P. 359-369.
