CC BY
51
№ 6 - 2012 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 612.35:612.12]:612.233.12-092.9
ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ДОЗОЗАВИСИМЫХ ЭФФЕКТОВ ОЗОНА В ОТНОШЕНИИ ПРОЦЕССОВ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ КРОВИ И ПЕЧЕНИ КРЫС
С. П. Перетягин1, С. Ю. Большухин2, А. А. Мартусевич1, А. К. Мартусевич1
1ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздравсоцразвития России (г. Нижний Новгород)
2ГБОУВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития
России (г. Киров)
Целью данной работы послужило исследование характера влияния различных доз озона на интенсивность процессов липопероксидации (ЛПО) крови и гомогенатов печени здоровых крыс. Материалом исследования служили кровь и гомогенаты печени крыс. Интенсивность процессов ЛПО оценивали методом индуцированной биохемилюминесценции, на основании определения уровня малонового диальдегида и диеновых конъюгатов. На основании проведенных исследований подтвержден тезис о дозозависимом характере реакции процессов перекисного окисления липидов на системное применение озона в широком диапазоне его концентраций. Данная закономерность реализуется не только в крови, но и в печени животных, что верифицировано не только на основании данных биохемилюминесценции, но и изучения уровня промежуточных и конечных продуктов ЛПО. Установлено, что низкие и средние дозы озона (1 и 10 мкг/кг массы тела животного) умеренно стимулируют перекисное окисление, причем в последнем случае увеличиваются и антиоксидантные резервы крови (по уровню церулоплазмина).
Ключевые слова: озон, перекисное окисление липидов, кровь, печень.
Перетягин Сергей Петрович — доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения экспериментальной медицины ФГБУ «Нижегородский научноисследовательский институт травматологии и ортопедии», рабочий телефон: 8 (831) 436 -25-31, e-mail: [email protected]
Большухин Сергей Юрьевич — заочный аспирант кафедры медицинской биологии и генетики ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития, e-mail: [email protected]
Мартусевич Анастасия Анатольевна — младший научный сотрудник отделения экспериментальной медицины ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии», рабочий телефон: 8 (831) 436-25-31. e-mail: [email protected]
Мартусевич Андрей Кимович — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отделения экспериментальной медицины ФГБУ «Нижегородский научноисследовательский институт травматологии и ортопедии», рабочий телефон: 8 (831) 436 -25-31, e-mail: [email protected]
Введение. В последние годы интенсивно изучаются вопросы применения озонотерапии в комплексном лечении различных патологических состояний, что обуславливает необходимость дальнейшего подробного изучения механизмов системного и локального действия озона [1, 6, 8]. Следует подчеркнуть, что применение окислительных методов терапии неразрывно связано с изучением процессов липопероксидации (ЛПО) [4, 7-11]. Известно, что изменение активности ЛПО является одним из диагностических критериев тяжести патологического состояния, а также эффективности и безопасности озонотерапии [2, 3, 12]. Следовательно, мониторинг состояния про- и антиоксидантных систем позволяет не только исследовать механизмы формирования и прогрессирования окислительного стресса как значимого компонента многих заболеваний [4, 5, 7, 11], но и контролировать особенности их течения и эффективность озонотерапии, оптимизируя исход лечения [8].
Важно отметить, что большинство экспериментальных и клинических исследований посвящены оценке действия только тех доз медицинского озона, которые непосредственно применяются для коррекции изучаемой патологии [1, 6, 8], что не позволяет получить достаточно полное представление о дозозависимых эффектах соединения в широком диапазоне концентраций. Это, в свою очередь, значимо в аспекте изучения биобезопасности озона как лекарственного средства, обладающего многочисленными эффектами.
Целью данной работы послужило исследование характера влияния различных доз озона на интенсивность процессов ЛПО крови и гомогенатов печени здоровых крыс.
Материал и методы исследования. Эксперименты были проведены на 48-ми белых крысах линии Wistar массой 180-250 г. Сформировано 5 групп животных: интактная (n = 12), с которой не проводили никаких манипуляций; контрольная плацебо-группа (n = 6), которой внутрибрюшинно ежедневно (в течение 10-ти дней) вводили по 1,0 мл физиологического раствора; 3 опытных группы по 6 животных, которым по той же схеме осуществляли введение свежеприготовленного озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 1, 10 и 100 мкг/кг массы животного соответственно. На 11-е сутки наблюдения крыс выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом. Материалом исследования служили кровь и гомогенаты печени крыс.
Интенсивность процессов ЛПО оценивали методом индуцированной биохемилюминесценции, на основании определения уровня малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК). МДА выделяли из эритроцитарных мембран изопропиловым спиртом. Липидную фракцию для определения ДК в эритроцитах крови и гомогенатах печени экстрагировали гептан-изопропаноловой смесью по методу, модифицированному П.И. Цапок с соавт. (1999). Определение первичных продуктов
перекисного окисления производили путём измерения интенсивности общей хемилюминесценции (ХЛ) ^) в плазме крови и гомогенате печени, а также по интенсивности максимальной фотовспышки (1тах) на хемилюминометре ЕММТЕ EL 1105. Результаты обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение. На основании проведенных исследований изучено влияние курсового введения озонированного физиологического раствора в дозах 1, 10 и 100 мкг/кг массы тела на активность процессов ЛПО в плазме, эритроцитах крови и гомогенате печени здоровых крыс (рис. 1). Прежде всего, следует подчеркнуть, что у животных контрольной (плацебо) группы статистически значимых сдвигов уровня МДА и ДК не выявлено.
При изучении интенсивности перекисного окисления липидов в исследуемых биосубстратах по содержанию ДК и МДА установлено, что по данным показателям регистрируется разнонаправленная динамика. Так, минимальная доза озона (1 мкг/кг) не способствовала сдвигу содержания ДК в плазме крови, но вызвала его значимое нарастание в эритроцитах и гомогенате печени (на 39 и 25,4 % соответственно; р < 0,05). В плазме крови крыс, которым осуществляли введение озона в дозе 10 мкг/кг массы тела, наблюдали снижение концентрации ДК на 33,4 % по сравнению с интактными животными (р < 0,05). В эритроцитах крови данный показатель уменьшался на 34 % (р < 0,05), а в гомогенате печени крыс — на 31,9 % (р < 0,05). Наряду с этим, в эритроцитах крови и гомогенате печени животных этой группы содержание ДК снижалось на 32 и 3,7 % соответственно по отношению к уровню контрольной и интактной групп (р < 0,05). Максимальная использованная доза озона (100 мкг/кг) обуславливала также падение уровня рассматриваемого промежуточного продукта ЛПО в плазме крови и гомогенате печени (на 38,9 и 21,1 % соответственно; р < 0,05) Корреляционный анализ выявил обратную зависимость средней степени между содержанием ДК в плазме крови и дозой вводимого озона (г = —0,49).
Содержание МДА в плазме крови крыс опытных групп по отношению к контрольному уровню не менялось, но имело тенденцию к повышению с увеличением дозы озона (рис. 1).
%
2Б0
2СО
ДК гл. ДК эр. ДКгоы. МДА пл. МДА эр. МДА гои. Иерулогшазиин
□Интактные ■ Контроль СЗДоза1 мкг/кг О До за 10 мкг/кг ■ Доза 100 мкг/кг
Рис. 1. Изменение показателей ЛПО крови и гомогенатов печени крыс в зависимости
от дозы вводимого озона
Установлено, что только минимальные дозы озона (1 мкг/кг) не вызывали повышение уровня МДА в эритроцитах, тогда как более высокие концентрации данной активной формы кислорода обуславливали его дозозависимое повышение. При введении озона в дозах 10 и 100 мкг/кг наблюдается увеличение содержания МДА в эритроцитах на 34,7 и 60,6 % по отношению к интактным животным и на 43,2 и 70,7 % — по сравнению с показателями, характерными для контрольной группы соответственно (р < 0,05). Корреляционный анализ выявил прямую зависимость высокой силы между содержанием МДА в эритроцитах крови крыс и дозой вводимого озона (г = +0,72). Установлено, что введение озона в дозе 100 мкг/кг вызывает увеличение уровня МДА в гомогенате печени крыс на 56,3 % по отношению к интактным животным (р < 0,05) и на 58,3 % — по отношению к контрольному уровню (р < 0,05). При этом, как и в отношении эритроцитов, выявлена сильная прямая зависимость между содержанием МДА и дозой вводимого озона (г = +0,80). В остальных случаях достоверных изменений содержания МДА в эритроцитах крови и гомогенате печени крыс не выявлено.
Также выявлено, что введение озона здоровым животным не вызывает статистически значимых изменений содержания церулоплазмина в плазме крови крыс большинства опытных групп. Лишь при применении дозы 10 мкг/кг наблюдали умеренное увеличение данного показателя, свидетельствующее о повышении антиоксидантных резервов крови.
Изменение активности процессов ЛПО под влиянием озонотерапии также оценивали по изменению интенсивности показателей ХЛ плазмы крови и гомогената печени крыс (рис. 2). Установлено, что введение озона не вызывает значимых изменений интенсивности максимальной вспышки ХЛ в плазме крови животных всех опытных групп. В то же время использование 1 мкг/кг озона вызывает увеличение интенсивности общей светосуммы ХЛ на 57,6 % по отношению к интактным животным (р < 0,05) и на 52,3 % — по сравнению с показателем контрольной группы (р < 0,05). Введение озона в дозах 10 и 100 мкг/кг не приводит к сдвигу общей светосуммы ХЛ. В целом в плазме крови крыс отмечается обратная зависимость средней степени между интенсивностью общей ХЛ и дозой вводимого озона (г = —0,47).
%
180
160
1 ■ 1 плах плазмы Б плазмы I плах гомогената печени Г I 5 гомогената печени
П ИНТЭКТНЫ“ ■Контроль эа э 1 м кг/кг ВД|ЭЭ9 10 мкг/кг ■ Доза 100 мкг/кг
Рис. 2. Изменение активности показателей ХЛ крови и гомогенатов печени крыс в зависимости от дозы вводимого озона (Imax — максимальная вспышка ХЛ; S —
светосумма ХЛ)
В гомогенате печени крыс лишь введение озона в дозе 10 мкг/кг вызывает значимое увеличение интенсивности максимальной фотовспышки ХЛ на 38,1 % по отношению к интактным животным (р < 0,05). При этом значимых изменений интенсивности общей ХЛ в гомогенате печени крыс, получавших озон в дозе 10 мкг/кг, не выявлено. Применение других доз озона (1 и 100 мкг/кг) не способствует изменению интенсивности перекисного окисления липидов в гомогенате печени по показателям ХЛ как по отношению к интактным животным, так и к контрольной группе.
Заключение. Таким образом, в широком диапазоне концентраций озона подтвержден тезис о дозозависимом характере реакции процессов перекисного окисления липидов на системное применение озона. Следует отметить, что указанная закономерность реализуется не только в крови, но и в печени животных, что верифицировано не только на основании данных биохемилюминесценции, но и изучения уровня промежуточных и конечных продуктов ЛПО. Установлено, что низкие и средние дозы озона (1 и 10 мкг/кг массы тела животного) умеренно стимулируют перекисное окисление, причем в последнем случае увеличиваются и антиоксидантные резервы крови (по уровню церулоплазмина).
Список литературы
1. Алехина С. П. Озонотерапия: клинические и экспериментальные аспекты / С. П. Алехина, Т. Г. Щербатюк. — Н. Новгород : Издательство «Литера», 2003. — 240 с.
2. Арутюнян А. В. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма / А. В. Арутюнян, Е. Е. Дубинина, Н. Н. Зыбина. — СПб. : ИКФ «Фолиант», 2000. — 104 с.
3. Болдырев А. А. Биомембранология / А. А. Болдырев, Е. И. Кяйвряйнен, В. А. Илюха. — Петрозаводск : Изд-во Кар НЦ РАН, 2006. — 226 с.
4. Буеверов А. О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени / А. О. Буеверов // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2002.
— № 4. — С. 21-25.
5. Дубинина Е. Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состоянии окислительного стресса / Е. Е. Дубинина // Вопр. мед. химии — 2001. — Т. 47, № 6. — С. 561-581.
6. Конторщикова К. Н. Влияние озона на состояние печени при экспериментальном хроническом гепатите / К. Н. Конторщикова, И. М. Солопаева, С. П. Перетягин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1996. — Т. 122, № 8. — С. 238-240.
7. Логинов А. С. Внутриклеточная активация кислорода и молекулярные механизмы автоокислительного повреждения печени / А. С. Логинов, Б. Н. Матюшин // Вестн. РАМН. — 1994. — № 4. — С. 3-7.
8. Разваляева О. В. Некоторые аспекты применения озонотерапии в гепатологиии /
О. В. Разваляева, В. В. Скворцов // Гепатология. — 2003. — № 3. — С. 14-16.
9. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия / В. К. Казимирко [и др.]. — К. : Морион, 2004. — 160 с.
10. Droge W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function / W. Droge // Physiological Reviews. — 2002. — Vol. 82, N 1. — Р. 47-95.
11. Loguercio C. Oxidative stress in viral and alcoholic hepatitis / C. Loguercio, A. Federico // Free Radic. Biol. Med. — 2003. — Vol. 34, N 1. — P. 1-10.
12. Travagli V. A realistic evaluation of the action of ozone on whole human blood / V. Travagli, I. Zanardi, V. Bocci // International Biological Macromolecules. — 2006. — Vol. 39. — P. 317-320.
STUDYING OF SOME OZONE DOSE-
DEPENDENT EFFECTS CONCERNING LIPID PEROXIDATION PROCESSES AND ANTIOXIDANT SYSTEM OF BLOOD AND
LIVER AT RATS
12 1 1
S. P. Peretyagin , S. Y. Bolshukhin , А. А. Martusevich , А. К. Martusevich
1FSBE «Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Traumatology and Orthopedics Minhealthsocdevelopment» (Nizhny Novgorod c.)
SEIHPE «Kirov State Medical Academy Minhealthsocdevelopment» (Kirov c.)
The objective of the work is research of influence of various ozone doses on intensity of processes of lipoperoksidation (LPO) of blood and homogenates of liver at healthy rats. The material of the research was the blood and homogenates of rats’ liver. The intensity of LPO processes was estimated by a method of induced biochemicoluminescence, on the basis of definition of the level malonic dialdehyde and diene conjugates. The thesis about dose-dependent feature of reaction of LPO processes on systemic application of ozone in the wide range of its concentration is presented on the basis of the conducted researches. This law is realized not only in blood, but also in liver of animals that is verified not only by data form biochemicoluminescence, but also by studying the level of intermediate and final LPO products. It is established that low and average ozone doses (1 and 10 mkg/kg of body mass of an animal) moderately stimulate peroxidation, and in the latter case antioxidant blood reserves (ceruloplasmin level) also increase.
Keywords: ozone, peroxidation of lipids, blood, liver.
About authors:
Peretyagin Sergey Petrovich — doctor of medical sciences, professor, head of experimental medicine office at FSBE «Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Traumatology and OrthopedicsMinhealthsocdevelopment», office phone: 8 (831) 436-25-31, e-mail: [email protected]
Bolshukhin Sergey Yuryevich — correspondence post-graduate student of medical biology and genetics chair at SEI HPE «Kirov State Medical Academy Minhealthsocdevelopment», an email: [email protected]
Martusevich Anastasia Anatolyevna — junior research associate of experimental medicine office at FSBE «Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Traumatology and OrthopedicsMinhealthsocdevelopment», office phone: 8 (831) 436-25-31. e-mail:
Martusevich Andrey Kimovich — candidate of medical sciences, senior research associate of experimental medicine office of FSBE «Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of
Traumatology and OrthopedicsMinhealthsocdevelopment», office phone: 8 (831) 436-25-31, email: [email protected]
List of the Literature:
1. Alekhin S. P. Ozonotherapy: clinical and experimental aspects / S. P. Alekhin,
T. G. Shcherbatyuk. — N. Novgorod: Litera publishing house, 2003. — 240 P.
2. Arutyunyan A. V. Methods of assessment of free radical oxidation and antioxidant system of organism / A. V. Arutyunyan, E. E. Dubinin, N. N. Zybina. — SPb. : RCC «Volume», 2000. — 104 P.
3. Boldyrev A. A. Biomembranology / A. A. Boldyrev, E. I. Kyayvryaynen, V. A. Ilyukha.
— Petrozavodsk: Publishing house of Carat of SC RAS, 2006. — 226 P.
4. Buyeverov A. O. Oxidative stress and its role in liver damage / A. O. Buyeverov // Rus. journal gastroenterology, hepatology, coloproctology. — 2002 . — № 4. — P. 21-25.
5. Dubinin E. E. Role of active forms of oxygen as alarm molecules in metabolism
of fabrics at oxidizing stress state / E. E. Dubinin // Quest. medical chemistry — 2001. — V. 47, № 6. — P. 561-581.
6. Kontorshchikova K. N. Influence of ozone on liver at experimental chronic hepatitis / K. N. Kontorshchikova, I. M. Solopayeva, S. P. Peretyagin//Bulletin of experimental biology and medicine. — 1996 . — V. 122, № 8. — P. 238-240.
7. Loginov A.S. Intracellular activation of oxygen and molecular mechanisms
of autooxidizing liver damage / A. S. Loginov, B. N. Matyushin // Bull. of RAMS. —
1994. — № 4. — P. 3-7.
8. Razvalyaeva O. V. Some aspects of application of ozonotherapy in hepatology / O. V. Razvalyaeva, V. V. Skvortsov // Hepatology. — 2003. — № 3. — P. 14-16.
9. Free radical oxidation and antioxidant therapy / V. K. Kazimirko [etc.]. — K. : Morion, 2004. — 160 P.
10. Droge W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function / W. Droge // Physiological Reviews. — 2002. — Vol. 82, N 1. — P. 47-95.
11. Loguercio C. Oxidative stress in viral and alcoholic hepatitis / C. Loguercio, A. Federico // Free Radic. Biol. Med. — 2003. — Vol. 34, N 1. — P. 1-10.
12. Travagli V. A realistic evaluation of the action of ozone on whole human blood / V. Travagli, I. Zanardi, V. Bocci // International Biological Macromolecules. — 2006. — Vol. 39. — P. 317-320.
