CC BY
18
УДК 57.083.12-873.21
Ключевые слова: микобактерии, бактериологические исследования, генотипирование, 16S-23S рРНК
Keywords: Mycobacterium, bacteriological analysis, genotyping, 16S-23S rRNA
Тупота Н. Л., Ионина С. В., Терновой В. А., Тупота С. Г., Донченко Н. А.
ИЗУЧЕНИЕ MYCOBACTERIUM ARUPENSE, ВЫДЕЛЕННОГО НА ТЕРРИТОРИИ СИБИРСКОГО РЕГИОНА
THE STUDY OF MYCOBACTERIUM ARUPENSE ALLOCATED WITHIN THE TERRITORY OF THE SIBERIAN REGION
ТНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии» Адрес: 630501, Новосибирская область, пос.Краснообск, а/я 8. Тел. (383) 348-04-95 1 State Scientific Establishment Institute of Experimental Veterinary Science of Siberia and the Far East, Siberian Branch of the Russian Academy of Agricultural Sciences Address: 630501, Russia, Novosibirsk Region, Krasnoobsk, P. O. Box 8. Tel. +7 (383) 348-04-95 2Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Адрес: 630559, Новосибирская область, пос. Кольцово. Тел. (383) 363-48-25 2State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" Address: Russia, Novosibirsk Region, Koltsovo. Tel. +7 (383) 363-48-25
Тупота Наталья Леонидовна, к. б. н., ст. научн. сотрудник1
Tupota Natalya L., Ph.D., Senior Research Scientist1 Ионина Светлана Владимировна, к. б. н., ст. научн. сотрудник1 Ionina Svetlana V., Ph.D., Senior Research Scientist1 Терновой Владимир Александрович*, к. б. н., зав. лабораторией молекулярной эпидемиологии особо-опасных инфекций2 Ternovoi Vladimir A., Ph.D., Head of the Laboratory of Molecular Epidemiology of Highly Dangerous Infections2 Тупота Сергей Григорьевич, к. в. н., ст. научн. сотрудник1 Tupota Sergey G., Ph.D., Senior Research Scientist1 Донченко Николай Александрович, д. в. н., директор1 Donchenko Nikolay A., Doctor of Veterinary Science, Director1
Аннотация. Впервые на территории Новосибирской области получен изолят Mycobacterium arupense, изучен фрагмент межгенной последовательности 16S-23S рРНК, а также представлены его биологические и биохимические характеристики.
Summary. For the first time within the territory of the Novosibirsk Region the isolate of Mycobacterium arupense was received, the fragment of 16S-23S rRNA intergenic sequence was studied and also its biological and biochemical characteristics were presented.
Введение
В эпизоотологии микобактериальных инфекций проблема видового состава мико-бактерий и их региональных особенностей имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение, так как создает основу для дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий. Определение видовой принадлежности выделенных культур микобактерий из организма животных и сред их обитания позволяет определить ареал их распространения, источники инфицирования и патогенное воздействие на различные виды животных и человека [3].
Актуальность идентификации микобактерий диктуется необходимостью получения новых данных о возбудителях туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий, циркулирующих среди животных в современных условиях ведения животноводства. В большинстве ветеринарных лабораторий идентификация микобактерий осуществляется определением возбудителей туберкулеза и дифференциации нетуберкулезных мико-бактерий по группам Раньона (скотохромо-генные, фотохромогенные, нефотохромоген-ные и быстрорастущие микобактерии) [3]. Однако в настоящее время описано более 140 видов микобактерий, причем число ати-
пичных микобактерий постоянно растет [10, 14], что требует пересмотра и дополнения существующей классификации.
В зарубежной научной литературе появляются сообщения о распространении потенциально нового вида микобактерий -Mycobacterium arupense среди людей, грызунов и насекомых на территории Японии, Африки и Чехии [12, 9, 13]. Впервые он был выделен из образцов мокроты, полученной от пациента в 2006 году на территории США [8]. В том же году он был выделен на территории Японии от пациента со схожей симптоматикой [12]. В Тайване в 2008 году M. arupense обнаружен у пациента с тендова-гинитом, больного диабетом [15]. На территории Кореи данный вид микобактерий был обнаружен в пробах поверхностных вод [11]. Однако упоминаний о данном микроорганизме, циркулирующем на территории России в доступных нам источниках информации мы не обнаружили.
Cloud J. l., Meyer J. J. et al [8] классифицируют этот вид микобактерий как элемент M. terrae complex, включающий M. terrae, M. nonchromogenicum, M. hiberniae и M. triviale. Возможно, ранее микроорганизм не идентифицировали, а вызываемые им заболевания диагностировали неверно. Однако использование молекулярно-биологических методов исследования способствовало решению этой проблемы.
При исследовании биоматериала, полученного от свиньи в Новосибирской области, нами была выделена культура микобакте-рий, идентифицированная как микобактерии III группы по Раньону [7]. В дальнейшем было проведено молекулярно-генетическое изучение данного изолята.
Целью работы явилось изучение свойств выделенной культуры.
Материалы и методы
Лабораторные исследования по изоляции микобактерий, последующей их идентификации проводили согласно «Наставления по диагностике туберкулеза животных» [4]. Для обработки биоматериала использовали метод А. П. Аликаевой. Посев материала проводили на питательную среду Финн-2. С целью
дифференциации культуры накопленную бактериальную массу пересевали на различные питательные среды - яичную среду с салицилатом натрия, мясопептонный агар и мясопептонный бульон - и культивировали при различных температурных режимах: 20-22 °С, 37 °С и 45 °С. В качестве биохимических тестов использовали реакцию гидролиза твин-80 и тест на устойчивость к 5 % натрия хлориду, редукцию нитратов с ди-метиламинобензальдегидом и определение амидной активности с мочевиной.
Выделение суммарной ДНК из культур проводили, используя метод сорбции на си-ликагеле с применением набора ДНК-сорб-Б (ЦНИИЭ) согласно прилагаемой инструкции.
Полимеразная цепная реакция для выявления специфической ДНК Mycobacterium spp. проводилась с использованием пары праймеров на фрагмент межгенной последовательности 16S-23S рРНК: 5-ACCTCCTTTCTA AGGGCACC-3' и 5-GATGCTCGCAACCACTATTCA-3' [16].
Химический синтез праймеров был осуществлен в ООО «Лаборатория Меди-ген» (Новосибирск). Постановку ПЦР осуществляли на амплификаторе «Терцик» [6, 7], используя следующие параметры: 96 °С х 5 мин. (1 цикл), 94 °С х 30 сек, 60 °С х 30 сек., 72 °С х 1 мин. (35 циклов), 72 °С х 10 мин. [5].
Полученные в ПЦР фрагменты анализировали методом электрофореза в 1,5%-м агарозном геле в присутствии бромистого этидия. В качестве маркера использовали pUC19/Kzo9 I и pBluescript/Msp. Результаты электрофореза учитывали в УФ-свете на трансиллюминаторе с длиной волны 246 нм. Длина полученного в ПЦР специфического фрагмента составила 247 п. н.
Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР-фрагмента проводили на автоматическом секвенаторе "Beckman CEQ2000XL" (Beckman Coulter, Inc.) согласно инструкции производителя. Нуклеотидные последовательности для проведения филогенетического анализа были получены из базы данных GenBank. Обработка последовательностей проводилась с использованием специализированных
программных пакетов MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Inc., США).
Результаты и обсуждение
На вскрытии свиньи в лимфатических узлах были обнаружены очаги с кашеобразным содержимым размером с просяное зерно, наблюдались кровоизлияния и стертость между слоями органа. При микроскопии полученной культуры, окрашенной по Циль - Нильсену, микобактерии представляли собой короткие утолщенные зернистые кислотоустойчивые палочки красного цвета, имеющие изогнутую форму. Располагались скоплениями и образовывали нити. Бактерии не образовывали пигмент ни на свету, ни в темноте, но со временем могли приобретать желтую окраску. Наблюдали отсутствие роста микобактерий при 20-22 °С и 45 °С, при 37 °С рост был отмечен на 10-е сутки. Рост на мясопептонном агаре появился на 5-е сутки, на мясопептонном бульоне - на 2-е сутки. При пересеве культуры на 7-е сутки на среде Финн-2 появился сплошной рост колоний и представлял собой S-форму. Температурный оптимум составлял 37 °С.
При биохимическом тестировании наблюдалась положительная реакция гидролиза твин-80 (изменение окраски было отмечено на 2-е сутки) и было установлено, что культура не устойчива к 5 % натрия хлориду, обладает амидазной активностью, а способность восстанавливать нитраты проявляется на 60 %.
При посеве биоматериала на питательную среду Финн-II первичный рост колоний обнаружили на 20-й день после посева. Биопробу ставили, используя 1 кролика и 2 морских свинок, которым вводили суспензию биоматериала, содержащую 1 мг культуры в 1 мл физиологического раствора. При эвтаназии кролика, зараженного внутривенно 1 мл суспензии из биоматериала, изменений не обнаружено. Морские свинки, зараженные подкожно такой же дозой, пали через 2,5 месяца, изменений на вскрытии не обнаружено.
Полученной культурой также заражали беспородных белых мышей (20 голов). Для заражения использовали суспензию
3-недельной культуры (1 мг в 1 мл физиологического раствора), которую вводили по 1 мл внутривенно. Животных умерщвляли по 5 голов через каждые 7 дней в течение месяца. При вскрытии осматривали внутренние органы:
- эвтаназия через 7 дней: у одной мыши -увеличение селезенки, другие органы без изменений;
- эвтаназия через 14 дней: изменения в органах отсутствуют;
- эвтаназия через 21 день: у одной мыши -увеличение селезенки, другие органы без изменений;
- эвтаназия через 30 дней: у одной мыши -увеличение селезенки (плотная консистенция), другие органы без изменений. При этом наличие ДНК искомого микроорганизма в органах мышей наблюдалось как через 2, так и через 4 недели после заражения.
В результате изучения культурально-мор-фологических свойств выделенная культура была отнесена к атипичным микобактериям III группы по Раньону.
Так как фенотипические признаки бактерий могут широко варьировать в зависимости от условий культивирования и от аллельного состояния ответственных за экспрессию генов, было проведено молекуляр-но-генетическое исследование культуры. При этом праймеры были синтезированы на фрагмент межгенной последовательности 16S-23S рРНК. Учитывая что в отличие от фенотипических и биохимических особенностей 16S-23S рРНК является устойчивой характеристикой, специфической для микроорганизмов на уровне вида, нами были получены фрагменты ДНК, которые по результатам секвенирования были отнесены к потенциально новому виду микобактерий -M. arupense [6]. Сибирский вариант оказался генетически близок изоляту M. arupense, выделенному в 2006 году на территории Италии [8]. У изолята, полученного в Новосибирской области, имеются нуклеотидные замены, отличающие его от прототипных штаммов. При построении филогенетического дерева M. arupense образовал 3 кластера с прототипными штаммами, зарегистрированными ранее в GenBank, которые,
95
_DQ 523527 Италия 2006
JQ 029962 Новосибирск 2003 DQ 168663 США 2008 -AJ314868 Китай 2001
0.1
Рис. 1. Консенсусное ML-дерево последовательностей 16S-23S рРНК M. arupense.
в свою очередь, объединяют несколько мелких ветвей. Наибольшую гомологию этот вариант имеет со штаммом M. arupense, изолированным и описанным на территории Италии в 2006 году авторами Тортолли и Мариотини. При тестировании процедурой бутстрепа M. arupense образовал один клад с указанным изолятом, имея коэффициент подобия 95 % (рис. 1). Для сибирского варианта M. arupense характерны следующие аминокислотные замены в паттернах: NCQ^NRQ, GLF^GQL, PLC^PLW.
Заключение
Таким образом, проведенный комплекс микробиологических и молекулярно-гене-тических методов исследования позволил идентифицировать потенциально новый вид микобактерий - Mycobacterium arupense, который по совокупности описанных признаков был отнесен к нетуберкулезным (атипичным) микобактериям и впервые был выделен нами на территории России, и Новосибирской области в частности.
Необходимо отметить, что данный возбудитель был выделен из биоматериала, в котором были обнаружены изменения, характерные для типичной туберкулезной инфекции. Следовательно, идентифицированные мико-бактерии обладают достаточно выраженной патогенностью в отношении сельскохозяйственных животных и могут обладать потенциальной патогенностью для человека.
В настоящее время патология, вызываемая атипичными микобактериями, - ми-кобактериозы - широко распространена. При этом проблема нетуберкулезных мико-бактерий, а также возможное усиление их вирулентности, становится все более актуальной. Таким образом, выявление всех свойств
и характеристик атипичных микобактерий в различных регионах позволит наиболее эффективно разрабатывать методы лечения и дальнейшей ликвидации инфекции, вызываемой ими.
Список литературы
1. Вартапетян, А. Б. Полимеразная цепная реакция / А. Б. Вартапетян // Молекулярная биология. - 1991. -Т. 25. - Вып. 4. - С. 926-936.
2. Гришина, Т. Д. Идентификация возбудителя туберкулеза в клиническом материале с помощью метода полимеразной цепной реакции / Т. Д. Гришина [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1995. - № 1. - С. 36-38.
3. Касьянова, Е. А. Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий : Дис...канд. ветеринар. наук. - М., 2010. - 216 с.
4. Наставление по диагностике туберкулеза животных : офиц. текст. - М., 2002. - 69 с.
5. Першикова, Н. Л. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза / Н. Л. Першикова, Н. А. Донченко // Вестник КрасГАУ - 2007. - № 5. - С. 129-131.
6. Першикова, Н. Л. Полиморфизм ДНК мико-бактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных: автореф. дис.канд. биол. наук. - Новосибирск, 2008. - 21 с.
7. Першикова, Н. Л. Изучение фрагмента гена 16S-23S рРНК Mycobacterium arupense, впервые выделенного на территории Сибирского региона / Н. Л. Першикова, В. А. Терновой // Актуальные проблемы сельского хозяйства горных территорий: материалы II-й Международной научно-практической конференции. - Горно-Алтайск, 2010. - С. 115-117.
8. Cloud, J. L. Mycobacterium arupense sp. nov., a non-chromogenic bacterium isolated from clinical specimens / J. L. Cloud, J. J. Meyer, J. I. Pounder et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2006. - Vol. 56. - P. 1413-1418.
9. Durnez, L. First findings of mycobacteria in African rodents and insectivores using stratified pool screening / L. Durnez, M. Eddyani, G. F. Mgode et al. // Appl. Envirol. Microbiol. - 2007.
10. Kazda, J. The Ecology of Mycobacteria: Impact on Animal's and Human's Health / J. Kazda, I. Pavlik,
III J. O. Falkinham, K. Hruska (eds.) ; 1st ed. - Springer, 2009. - xviii+522 pp.
11. Lee, E. S. Occurrence and molecular differentiation of environmental mycobacteria in surface waters / E. S. Lee, M. Y. Lee, S. H. Han, J. O. Ka // Journal of Microbiology and Biotechnology. - 2008. - 18. -P. 1207-1215.
12. Masaki, T. Mycobacterium kumamotonense sp. Nov. Recovered from Clinical Specimen and the First Isolation Report Mycobacterium arupense in Japan: Novel Slawly Growing, Nonchromogenic Clinical Isolates Related to Mycobacterium terrae Complex / T. Masaki, K. Ohkusus, H. Hata et al. // Microbiol. Immunol. -2006. - Vol. 50. - P. 889-897.
13. Slany, M. Mycobacterium arupense among the isolates of non-tuberculous mycobacteria from
human, animal and environmental samples / M. Slany, J. Svobodova, A. Ettlova // Veterinarni Medicina. - 55, 2010 (8). - P. 369-376.
14. Tortoli, E. The new mycobacteria: an update /
E. Tortoli // FEMS Immunology and Medical Microbiology. - 2006. - 48. - P. 159-178.
15. Tsai, T. F. Tenosynovitis caused by Mycobacterium arupense in a patient with diabetes mellitus / T. F. Tsai, C. C. Lai, I. C. Tsai, C. H. Chang, C. H. Hsiao, P. R.Hsueh // Clin. Infect. Dis. - 2008. - V. 47. - P. 861-863.
16. Xiong, L. Use of PCR and Reverse Line Blot Hybridization Macroarray Based on 16S-23S rRNA Gene Internal Transcribed Spacer Sequences for Rapid Identification of 34 Mycobacterium Species / L. Xiong,
F. Kong, Y. Yang et al. // J. Clin. Microbiol. - 2006. -V. 44. - № 10. - P. 3544-3550.
