CC BY
39
УДК 636.5:591.463.1
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГО-МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЯИЦ ТРАНСГЕННЫХ КУР С КОНСТИТУТИВНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ИНТЕГРИРОВАННЫХ ГЕНОВ
Л.А. ВОЛКОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: [email protected]) А.Н. ВЕТОХ, младший научный сотрудник Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, руководитель лаборатории
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, доктор биологических наук, академик РАН, директор
Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
Резюме. Цель исследований - изучение влияния экспрессии интегрированныхрекомбинантных генов на морфологические и морфометрические показатели яиц трансгенных кур, в сравнении с нетрансгенными особями. Работу проводили на базе ВИЖим. Л.К. Эрнста в 2017 г. Объектом исследований служили трансгенные куры, полученные на основе кросса Хайсекс Уайт с использованием лентивирусных векторов, содержащих маркерный ген eGFP под контролем конститутивных промоторов RSV (n=9) и CAG (n=12). Использовали яйца от экспериментальной птицы, со сроком хранения не более 2 дней после снесения. Определяли массу яйца и его составных частей, большой и малый диаметры, индекс формы, толщину скорлупы, высоту и диаметр белка и желтка. Для характеристики качества белка и желтка рассчитывали единицы Хау, индекс белка и индекс желтка. У трансгенных кур, по сравнению с контролем, наблюдали достоверное увеличение массы яиц до 18 % (Р>0,99), обусловленное повышением массы составных частей яйца - скорлупы, плотного белка и желтка до 19, 7 и 31 % (Р>0,99) соответственно, что может быть связано с изменением состава яиц, обусловленным экспрессией реком-бинантного белка в яйцо. Показатели качества яиц - индексы белка, желтка и единицы Хау у трансгенных кур, по сравнению с контролем, были ниже на 23, 8-13 и 9 %, соответственно (Р>0,99). Однако эти отклонения оставались в пределах нормы. Наиболее выраженные изменения по изучаемым показателям установлены у трансгеных кур с интегрированным геном еGFP под контролем промотора CAG. Ключевые слова: трансгенная птица, морфология яйца, желток, белок.
Для цитирования: Изучение морфолого-морфометрических показателей яиц трансгенных кур с конститутивной экспрессией интегрированных генов/Л.А. Волкова, А.Н. Ветох, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева //Достижения науки и техники АПК. 2017. Т. 31. №. 6. С. 65-67.
Создание генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы, продуцирующей с яйцом рекомбинантные белки фармакологического назначения, - интенсивно развивающееся в последние годы направление биотехнологии. На сегодняшний день достигнуты определенные успехи в этой области: созданы эффективные системы доставки рекомбинантной ДНК в эмбриональные клетки кур, отработаны методические подходы по введению генных конструкций в эмбрионы. Экспрессия рекомбинантных генов в организме сельскохозяйственной птицы может иметь как конститутивный, так и тканеспецифичный характер, то есть они могут экспрессироваться во всех клетках и тканях организма или только в клетках отдельных органов, например, яйцеводе [1-7]. Во втором случае возможно получение рекомбинантных протеинов с бел-
ком яйца, что имеет ряд потенциальных преимуществ перед другими системами синтеза рекомбинантных продуктов. Вместе с тем, генетическая модификация сельскохозяйственной птицы, направленная на получение дополнительных рекомбинантных продуктов с белком яйца, может влиять на морфометрические и морфологические показатели, химический состав яиц, снижая их качество и, как следствие, результативность получения потомства от трансгенных особей. Степень такого влияния зависит от характера выражения интегрированных генов и недостаточно изученна. Исходя из этого, цель исследований - изучение морфометриче-ских и морфологических показателей яиц, полученных от трансгенных кур с конститутивной экспрессией интегрированных генов.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2017 г. Материалом служили яйца от трансгенных кур и их нетранс-генных аналогов кросса Хайсекс Уайт (Hisex White). Трансгенные птицы были получены с использованием лентивирусных векторов, обеспечивающих конститутивную экспрессию маркерного гена eGFP. Для этого использовали промотор вируса саркомы Рауса (RSV) и гибридный промотор CAG.
Было сформировано 2 опытные группы: I группа -трансгенные куры с конститутивной экспрессией eGFP под контролем промотора RSV (n=9), II группа - трансгенные куры с конститутивной экспрессией eGFP под контролем промотора CAG (n=12). В качестве контроля использовали нетрансгенных кур, отобранных по принципу аналогов с учетом возраста и породы.
Отбор яиц от кур опытных и контрольной групп проводили в соответствии с требованиями к инкубационным яйцам [8]. Срок хранения отобранных яиц составлял не более 2 дней после снесения. Проводили морфологический и морфометрический анализ яиц кур опытных и контрольной групп [9]. Массу яйца измеряли на весах Ohaus PA413C с точностью до 0,001 г, большой и малый диаметры, а также индекс формы яйца - с помощью индексомера ИМ-1.
После вскрытия яйца определяли качественные показатели: толщину скорлупы с использованием микрометра часового типа; высоту белка и желтка - с помощью микрометра типа «паук» и нивелирного столика; диаметр белка и желтка - штангенциркулем, с точностью измерения 0,1 мм; массу скорлупы, белка и желтка - на весах Ohaus PA413C.
Качество белка определяли в единицах Хау (Haugh, 1937):
единица Хау = 100log (H - 1,7 W0-37 + 7,57), (1) где H - высота плотного белка, мм и W - масса яйца, г;
и расчетом индекса белка по формуле: 1б = H/D, (2)
где H - высота плотного белка, мм; D - диаметр плотного белка, мм;
качество желтка - расчетом индекса желтка по формуле:
Таблица 1. Морфометрические показатели яиц
Показатель Группа Нормативы по ОСТ
контроль I опытная 1 II опытная
Возраст кур, мес. 11 11 11
Масса яйца, г 61,4±0,8 67,8±0,9** 72,1±1,0** 50-65
Индекс формы яйца, % 79,8±0,7 74,8±0,4** 75,3±0,4** 76-80
Большой диаметр яйца, мм 55,8±0,4 60,5±0,3** 61,2±0,3** -
Малый диаметр яйца, мм 44,3±0,2 45,1±0,2** 46,1±0,3** -
Малый диаметр плотного белка, мм 62,8±0,8 68,8±1,1** 70,8±0,7**
Больший диаметр плотного белка, мм 80,6±1,1 95,4±1,9** 98,0±1,5**
Диаметр желтка, мм 37,3±0,3 41,3±0,4** 42,6±0,3**
Толщина скорлупы, мм 0,43±0,01 0,38±0,01** 0,40±0,01* не менее
0,33
*- Р>0,95, **- Р>0,99, по сравнению с контролем 1ж = h/d, (3)
где h - высота плотного желтка, мм; d - диаметр плотного желтка, мм.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel 2013.
Результаты и обсуждение. Внешний осмотр яиц от кур контрольной и опытных групп, не выявил отклонений от нормативных требований, предъявляемых к соответствующим показателям качества яиц, что свидетельствует об отсутствии нарушений в системе кормления птицы, условиях её содержания и физиологическом состоянии.
Таблица 2. Весовые показатели составных частей
I опытной группе на 6 и 12 %, во II опытной группе -на 5 и 7 % (Р>0,95) соответственно. Низкая величина индекса формы яйца свидетельствует об ухудшении их инкубационных качеств и связана с соотношением фракций белка и повреждаемостью яиц. У округлых яиц относительно меньше наружного жидкого и больше плотного белка.
Анализ весовых характеристик составных частей яиц трансгенных и нетрансгенных кур также выявил различия по изученным показателям (табл. 2). Трансгенные куры превосходили своих нетрансгенных аналогов по массе скорлупы, желтка и плотного белка. яиц
Группа Масса
плотный белок желток скорлупа
г % г 1 % г 1 %
Контроль 31,5±0,9 65,1 13,8±0,2 22,4 7,7±0,2 12,5
I опытная 30,0±0,9 62,7 17,3±0,3* 25,5 8,1±0,1 11,8
II опытная 33,7±0,7 62,7 18,1±0,3* 25,0 9,2±0,1* 12,3
Норматив по ОСТ - 53,1-68,9 - 24,0-35,5 - 7,8-13,6
*- Р>0,99, по сравнению с контролем
Вместе с тем, были установлены некоторые различия по ряду морфометрических показателей (табл. 1). В частности, яйца кур опытных групп, имели, по сравнению с контролем, более высокие значения массы и большого диаметра на 11-18 и 9 % соответственно (Р>0,99). При этом индекс формы яйца и толщина скорлупы у трансгенных кур были меньше в
Различия по величинам этих показателей достигали 19, 7 и 31 % соответственно.
Процентное соотношение составных частей яйца определяет его инкубационные качества. Отклонения от установленных нормативов по величинам этих показателей [8] отрицательно влияют как на выводимость, так и на качество молодняка. Яйца от трансгенных кур
%
35 1
30
25
20 ■
15 10 5 1 ■
г 1 П h ri
0 масса масса яйца скорлупы i i i i масса масса единицы индекс белка желтка Хау белка Показатели качества яиц 1 1 индекс желтка
Рисунок. Различия по морфолого-морфометрическим показателям яиц трансгенных кур, выраженные в процентах к контролю: I группа - трансгенные куры с конститутивной экспрессией eGFPпод контролем промотора ЯБУ; II группа - трансгенные куры с конститутивной экспрессией eGFP под контролем промотора CAG: П - I группа; □ - II группа.
Таблица 3. Показатели качества яиц
Группа I Единицы Хау I Индекс белка Индекс желтка
Контроль 96,3±1,7 0,13±0,01 0,52±0,01
I опытная 87,1±1,6* 0,10±0,01* 0,48±0,01**
II опытная 87,4±1,5* 0,10±0,01* 0,45±0,01*
Норматив по ОСТ 78 - 90 0,43 - 0,50
* - Р>0,99, по сравнению с контролем
имели более высокое, по сравнению с контролем, процентное содержание желтка и более низкий процент белка. Однако различия были в пределах нормативных требований, предъявляемых к инкубационным яйцам.
Объективными показателями качества яиц служат индексы белка (2), желтка (3) и единицы Хау (1). У трансгенных кур, по сравнению с контролем, отмечено их достоверное снижение на 23, 8-13 и 9 % соответственно (Р>0,99). Вместе с тем, показатели единиц Хау и индекса желтка у трансгенных кур были более близки к нормативным, чем аналогичные у нетрансгенной птицы (табл. 3).
Сопоставляя результаты морфолого-метрического анализа яиц трансгенных кур, следует отметить более выраженные, в сравнении с контролем, различия по изучаемым показателям у трансгенной птицы с интегрированным геном еGFP под контролем промотора CAG (см. рисунок).
Выводы. Анализ морфометрических и морфологических показателей яиц кур опытных и контрольной
групп выявил достоверные различия по отдельным показателям. У трансгенных кур, по сравнению с контролем, установлено достоверное увеличение массы и диаметра яиц до 18 и 9 % соответственно (Р>0,99), при этом индекс формы яйца и толщина скорлупы у трансгенных кур были меньше в I опытной группе на 6 и 12 %, во II опытной группе - на 5 и 7 % (Р>0,95) соответственно. Увеличение массы яиц у трансгенных кур было обусловлено повышением массы составных частей яйца - скорлупы, повышением белка и желтка до 19, 7 и 31 % (Р>0,99) соответственно, что может быть связано с изменением состава яиц, обусловленного экспрессией рекомбинантного белка. При этом показатели качества яиц - индексы белка, желтка и единицы Хау у трансгенных кур, по сравнению с контролем, были ниже на 23, 8-13 и 9 % (Р>0,99) соответственно. Наиболее выраженные изменения были установлены у трансгеных кур с интегрированным геном еGFP под контролем промотора CAG.
Литература.
1. Трансгенные сельскохозяйственные животные: современное состояние исследований и перспективы / Н.А. Зиновьева, Н.А. Волкова, В.А. Багиров, Г. Брем// Экологическая генетика. 2015. Т. 13. № 2. С. 58-76.
2. Chicken oviduct-specific expression of transgene by a hybrid ovalbumin enhancer and the Tet expression system / D. Kodama, D. Nishimiya, K. Nishijima, Y. Okino, Y. Inayoshi, Y. Kojima, K.-I. Ono, M. Motono, K. Miyake, Y. Kawabe et al.// Journal of Bioscience and Bioengineering. 2012. Vol. 113 (2). Pp. 146-153.
3. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase / P.E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D.W. McCoy, J.N. Petitte//Dev. Dyn. 2003. Vol. 226. Pp. 439-445.
4. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens / S.G. Lillico, M.J. Sherman, C.D. McGrew, C.D. Robertson, J. Smith, C. Haslam, P. Barnard, P.A. Radcliffe, K.A. Mitrophanous, E.A. Elliot et al. // PNAS. 2007. Vol. 104 (6). Pp. 1771-1776.
5. Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white / S.C. Kwon, J.W. Choi, H.J. Jang, S.S. Shin, S.K. Lee, T.S. Park, I.Y. Choi, G.S. Lee, G. Song, J.Y. Han // Biology of Reproduction. 2010. Vol. 82. Pp. 1057-1064.
6. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens / S.J. Byun, S.W. Kim, K.W. Kim, J.S. Kim, I.-S. Hwang, H.K. Chung, I.S. Kan, I.-S. Jeon, W.-K. Chang, S.-B. Park, J.G. Yoo // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011. Vol. 75 (4). Pp. 646-649.
7. Applications of avian transgenesis / B.B. Scott, T.A. Velho, S. Sim, C. Lois // ILAR J. 2010. Vol. 51 (4). Pp. 353-361.
8. ОСТ 10 321 - 2003 «Яйца куриные инкубационные. Технические условия». Сергиев Посад: Минсельхоз России, 2003. 20 С.
9. Куликов Л.В. Практикум по птицеводству. М.: Изд-во РУДН, 2002. 235 с.
STUDY OF MORPHOLOGICAL AND MORPHOMETRIC PARAMETERS OF EGGS OF TRANSGENIC HENS WITH CONSTITUTIVE EXPRESSION OF INTEGRATED GENES
L.A. Volkova, A.N. Vetokh, N.A. Volkova, N.A. Zinovieva
L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation
Abstract. The aim of the research was to study the effect of expression of integrated recombinant genes on the morphological and morphometric parameters of eggs of transgenic hens in comparison with non-transgenic birds. The studies were carried out in the L.K. Ernst Institute of Animal Husbandry in 2017. The object of the study was transgenic hens obtained on the basis of Hisex White cross with the use of lentiviral vectors, which contained the marker gene eGFP under the control of constitutive promoters RSV (n = 9) and CAG (n = 12). Eggs from experimental chickens were used for research. Egg storage time was no more than 2 days after egg-laying. We examined the weight of an egg and its constituent parts, the large and small diameters, the egg shape index, the thickness of the shell, the height and diameter of the egg-white and yolk. Hau units, egg-white and yolk indices were calculated to characterize the quality of egg-white and yolk. In transgenic chickens, in comparison with the control ones, a significant increase up to 18 % in the weight of eggs was observed (P is more or equal to 0.99). This was due to the increase in the mass of the component parts of eggs: shell, dense egg-white and yolk up to 19, 7 and 31 % (P is more or equal to 0.99), respectively, which can be connected with the change in the composition of eggs due to the expression of additional (recombinant) egg-white in the egg. The egg quality indices: egg-white and yolk indices, Hau unit in transgenic hens were lower by 23, 8-13 and 9 %, respectively, compared to the control ones (P is more or equal to 0.99). However, these deviations were within the normative parameters. The most expressed changes in the studied indicators were found in transgenic hens with the integrated eGFP gene under the control of the CAG promoter. Keywords: transgenic poultry, morphology of eggs, yolk, egg-white.
Author Details: L.A. Volkova, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: [email protected]); A.N. Vetokh, junior research fellow; N.A. Volkova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory; N.A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director. For citation: Volkova L.A., Vetokh A.N., Volkova N.A., Zinovieva N.A. Study of Morphological and Morphometric Parameters of Eggs of Transgenic Hens with Constitutive Expression of Integrated Genes. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2017. Vol. 31. No. 6. Pp. 65-67 (in Russ.).
