CC BY
48
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО... 53
УДК 615.37:612.017.1
В.В. Плетнев, Б.В. Пинегин, Т.Б. Мастернак, С.И. Елкина, М.Ф. Никонова, Т.Ю. Харченко ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ СЕЛЕКАРТЕНА
ГНЦ РФ Институт иммунологии, Москва
Контактная информация
Плетнев Владимир Владимирович, клинический интерн кафедры онкологии ФПДО МГМСУ Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24, корп. 2; тел. +7(495)324-16-44 e-mail: [email protected]
Статья поступила 28.11.2011, подписана в печать 18.01.2012.
Резюме
Цель настоящей работы - изучение иммуномодулирующей активности селекартена (СК) in vivo и in vitro. Изучение влияния СК на устойчивость к стафилококковой инфекции проведено на 48 мышах линии (CBAxBL)Fi, зараженных летальной дозой St. pyogenes. Для постановки реакции внутриклеточного киллинга использован St. aureus, меченный флюоресцеина изотиоцианатом. Влияние СК на гуморальный иммунный ответ оценивали по накоплению антителообразующих клеток в селезенках мышей по методу Каннингема. Показателем клеточного иммунного ответа послужила реакция гиперчувствительности замедленного типа. Хеми-люминесценцию измеряли при помощи хемилюминометра LUCY 1 (Австрия). Изучение влияния СК на продукцию фактора некроза опухолей-а мононуклеарными клетками периферической крови человека выполнено при помощи метода твердофазного иммуноферментного анализа. Таким образом, СК обладает иммуномодулирующим действием.
Ключевые слова: селекартен, гуморальный иммунитет, клеточный иммунитет, мононуклеарные клетки.
V.V. Pletnev, B.V. Pinegin, T.B. Masternak, S.I. Elkina, M.F. Nikonova, T.Y. Harchenko STUDYING OF IMMUNOMODULATING ACTION OF SELECARTEN
State Scientific Center, Immunology Institute, Moscow
Abstract
The purpose of the present work was studying of immunomodulating activity of Selecarten. Studying of influence of Selecarten on stability to Staphylococcus infection is spent on 48 mice infected with a lethal dose of Staphylococcus pyogenes. For statement of reaction endocellular killing it is used Staphylococcus marked with fluorescein-isotiocyanate. Influence of Selecarten on the humoral immune answer estimated on accumulation of antibodyforming cells in spleens of mice on Cunningham’s method. Reaction of hypersensitivity of the slowed down type has served as indicator of the cellular immune answer. Chemiluminescence measured with the help of chemiluminometr. Studying of influence of Selecarten on production of tumor necrosis factor-alpha by mononuclear cells of peripheral blood of the person is executed by means of a method of hardphase immunoferment analysis. Thus, Selecarten possesses immunomodulating action.
Key words: Selecarten, humoral immunity, cellular immunity, mononuclear cells.
Введение
Характерной чертой начала XXI века является существенный рост острых и хронических инфекционных заболеваний бактериальной, грибковой, протозойной и вирусной природы. Возвращаются заболевания, которые были частыми в XIX веке и почти исчезли в XX, например туберкулез, малярия, дифтерия и др., и появляются новые инфекционные процессы, например ВИЧ-инфекция. Наблюдается рост инфекционно-воспалительных заболеваний различной этиологии и локализации. Этиологическим фактором часто являются условно-патогенные или оппортунистические микробы, обладающие множественной устойчивостью к антибиотикам, с атипичными биологическими свойствами. Это является следствием снижения иммунологической реактивности всего населения планеты. На фоне снижения функций иммунной системы применение даже высокоэффективных антибиотиков последнего поколения не всегда дает хороший клинический эффект.
Важнейшей проблемой современной медицины является коррекция функций иммунной системы с помощью иммуномодулирующих средств.
Поэтому проблема создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием, является одной из основных научно-теоретических и научно-практических задач современной медицины. В настоящее время привлекает внимание исследователей роль микроэлементов и витаминов в нормальном функционировании иммунной системы. Установлено, что такие вещества как витамин А, бета-каротин, фолиевая кислота, витамин В12, витамин С, рибофлавин, железо, цинк и селен, обладают иммуномодулирующими свойствами и их недостаточность ведет к снижению иммунореактивности населения и повышению инфекционной заболеваемости [3; 4]. Многие из перечисленных веществ обладают выраженными антиоксидантны-ми свойствами, что очень важно при лечении многих тяжелых заболеваний человека (рак, атеросклероз, преждевременное старение, аутоиммунные страдания и др.). К таким веществам с иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами относится микроэлемент селен и его производные. Селеносодержащие вещества повышают иммунологическую реактивность, следствием чего является снижение инфекционной заболеваемости [8; 9].
При дефиците селена малопатогенный вирус Коксаки становится вирулентным и вызывает серьезные нарушения в работе сердца, вирус гриппа вызывает более тяжелые повреждения легочной ткани и у инфицированных людей начинается быстрое прогрессирование ВИЧ-инфекции [10]. Регулярное потребление селеносодержащих продуктов замедляет старение организма и снижает риск развития злокачественных заболеваний [9; 12; 13].
В настоящее время активно разрабатываются лекарственные средства, биологически активные добавки, содержащие селен - незаменимый микроэлемент, обладающий целым рядом свойств и известный своей высокой антиоксидантной активностью [5; 7; 11].
Важным является создание новых комплексных лекарственных препаратов, усиливающих положительное действие селена, и в то же время исключающих возможные отрицательные эффекты микроэлемента, поскольку установлено, что селен в больших дозах токсичен для организма [1].
Учитывая вышесказанное, важным является изучение полезных для организма человека свойств новой формы препарата, содержащего селен, -комплексного растительного препарата «селекар-тен» (СК). В эксперименте на кроликах с острой ишемией сетчатки, вызванной лазерной коагуляцией (Патент РФ на изобретение № 2313312 на «Способ моделирования ишемии сетчатки глаза» от 27.12.2007) Швецовой Н.Е. (2008) было показано, что СК обладает антиоксидантным, ангиопротек-торным, нейропротекторным и ретинопротекторным действием. Под влиянием СК происходит усиление компенсаторных механизмов, направленных на восстановление кровообращения в поврежденных тканях при ишемии и дистрофии сетчатки.
Тем не менее, иммунотропное действие СК не изучалось, а многообразие функций препарата делает актуальным исследование эффективности его применения в клинической иммунологии и в лечении внутренних и инфекционных заболеваний.
Материалы и методы
Исследование иммунотропного действия СК выполняли в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ от 2005 г. [2].
Изучение влияния различных доз СК на устойчивость к стафилококковой инфекции у животных проведено на 48 мышах линии (CBAxBL)F1.
После введения СК мышей заражали летальной дозой (1010 клеток/мышь) St. pyogenes (штамм Wood-46). Проводили учет количества выживших мышей.
Изучение влияния различных доз СК на бактерицидную активность клеток перитонеального экссудата животных проведено на 48 мышах линии (CBA*BL)F1. Для постановки реакции внутриклеточного киллинга был использован St. aureus, меченный флюоресцеина изотиоцианатом.
90 мкл клеток перитонеального экссудата смешивали с 90 мкл живых флюоресцеина изотио-цианат-меченых бактерий 10 млн/мл. Смесь инкубировали 20 мин при 37 °С, макрофаги осаждали центрифугированием при 200 g 1 мин при +4 °С и 2 раза отмывали фосфатно-солевым буфером (200 мкл на лунку) от несвязавшихся бактерий. Макрофаги ресуспендировали фосфатно-солевым буфером и инкубировали еще 2,5 ч при 37 °С. Затем клетки осаждали 200 g 1 мин при +4 °С и разруша-
ли 200 мкл 0,2 %-ного сапонина на 0,01М карбо-натно-бикарбонатном буфере с рН 9,5 в течение 5 мин. Высвободившиеся бактерии осаждали при угловой скорости 2000 g 10 мин.
Для разделения живого стафилококка от убитого в пробы добавляли иодид пропидиума (PI, Sigma, 2,5 мкг/мл), который окрашивал только мертвые клетки, и анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur. На DotPlot по параметрам переднего (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния выделяли облако стафилококка и анализировали флюоресценцию на каналах FL1(535 нм) и FL3 (585 нм). Оценивали процент клеток с двойной меткой (погибший стафилококк) по отношению к общему числу клеток.
Изучение влияния различных доз СК на накопление антителобразующих клеток и реакцию ГЗТ у животных проведено на 40 мышах линии (CBAxBL)F1. Были исследованы следующие дозы СК: 1; 10 и 100 мкг/кг. СК вводили за 3 ч до внут-рибрюшинной иммунизации субоптимальной дозой эритроцитов барана (3*107 клеток на мышь). Влияние СК на гуморальный иммунный ответ оценивали по накоплению АОК в селезенках мышей на 4-е сутки по методу Каннингема.
Лимфоидные клетки от иммунизированных мышей смешивали с эритроцитами и комплементом, инкубировали в виде монослоя в замкнутой камере в течение ночи.
В присутствии комплемента вокруг каждой АОК возникали зоны гемолиза, которые подсчитывали при помощи световой лупы.
Реакцию характеризовали числом АОК на селезенку или на 1 млн ядросодержащих клеток. Показателем клеточного иммунного ответа послужила реакция ГЗТ. Животных иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана в дозе 108 клеток на мышь. На 6-й день после сенсибилизации животным субплантарно вводили в левую заднюю лапу 108 эритроцитов барана, а в подушечку контрлатеральной лапы («контрольная лапа») - физиологический раствор.
Через 24 ч после разрешающей инъекции измеряли толщину опытной и контрольной лапки штангенциркулем. Рассчитали индекс ГЗТ - отношение толщины опытной лапки к контрольной.
Изучение влияния различных доз СК на лю-минолзависимую и люцигенинзависимую хемилю-минесценцию нейтрофилов человека выполнено на образцах венозной крови здоровых добровольцев. Забор крови производили утром натощак из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом, в качестве которого применяли гепарин в концентрации 10 Ед/мл. Обследовали 6 здоровых добровольцев в возрасте от 25 до 35 лет. Хемилюминесценцию измеряли при помощи хемилюминометра LUCY 1 (Австрия).
Изучение влияния различных доз селекарте-на на продукцию ФНО-a мононуклеарными клетками периферической крови человека выполнено на образцах венозной крови здоровых добровольцев. Забор крови производили утром натощак из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом, в качестве которого применяли гепарин в концентрации 10 Ед/мл. Обследовано 5 здоровых добровольцев в возрасте от 25 до 35 лет. Концентрацию цито-кинов в супернатантах определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью комерческих наборов ФHO-a-иммуноферментный анализ «Прокон» (Санкт-Петербург) в соответствии с прилагающимися к ним протоколами.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО... 55
Результаты и их обсуждение
Влияние различных доз СК на устойчивость
к стафилококковой инфекции у мышей Результаты представлены в табл. 1. Все исследованные дозы СК повышали устойчивость мышей к стафилококковой инфекции. Однако максимальный эффект отмечен при использовании 1 мкг/кг.
Таким образом, СК в дозах 1; 10 и 100 мкг/кг повышает устойчивость мышей к смертельной стафилококковой инфекции. Оптимальной защищающей дозой СК является 1 мкг/кг.
Влияние различных доз СК на бактерицидную активность клеток перитонеального экссудата мышей Результаты исследования бактерицидной активности клеток перитонеального экссудата мышей представлены в табл. 2. Бактерицидная активность была изменена под действием СК. Дозы 1 и 10 мкг/кг СК достоверно повышали способность клеток убивать 81. аигеш на 44 и 69 % соответственно. Доза СК 100 мкг/кг подавляла бактерицидность на 25 %.
Таким образом, СК в дозах 1 и 10 мкг/кг стимулирует бактерицидную активность клеток перитонеального экссудата мышей на 44 и 69 % соответственно, а доза 100 мкг/кг снижает этот показатель на 25 %.
Влияние различных доз СК на накопление
антителобразующих клеток и реакцию ГЧЗТу мышей Результаты оценки влияния СК на гуморальный иммунный ответ представлены в табл. 3, из которой следует, что СК в дозах 100 и 10 мкг/кг достоверно повышал число антителобразующих клеток, то есть стимулировал гуморальный иммунный ответ. Усиливающее действие проявлялось при пересчете числа антителобразующих клеток как на селезенку, так и на 1 млн кариоцитов селезенки. В дозе 1,0 мкг/кг СК не оказывал подобного действия.
В табл. 4 отражены результаты оценки влияния СК на клеточный иммунный ответ. Из данных, представленных в табл. 4 следует, что СК в дозах 100 и 10 мкг/кг усиливал выраженность реакции ГЧЗТ.
Таким образом, СК, вводимый подкожно в дозах 100 и 10 мкг/кг за 3 ч до иммунизации эритроцитами барана, стимулирует гуморальный ти-мусзависимый и клеточный иммунные ответы.
Влияние различных доз СК на люминолзависимую и люцигенинзависимую хемилюминесценцию лейкоцитов человека Результаты исследования хемилюминесцен-ции лейкоцитов человека представлены в табл. 5-8. СК в концентрации 100 мкг/мл достоверно подавлял все виды спонтанной и зимозаниндуцирован-ной хемилюминесценции в течение всего периода регистрации.
Таким образом, концентрации СК 1 и 10 мкг/мл при совместной инкубации с лейкоцитами периферической крови человека не оказывают значимого влияния на показатели хемилюминесцен-ции, а СК в концентрации 100 мкг/мл достоверно подавляет люминолзависимую и люцигенинзави-симую спонтанную и зимозаниндуцированную хе-милюминесценцию лейкоцитов человека.
Влияние различных доз СК на продукцию ФНО-а мононуклеарными клетками периферической крови человека
Результаты представлены в табл. 9. Обследовано 5 здоровых добровольцев в возрасте от 25 до 35 лет. Доноры проявили индивидуальную чувствительность к СК. Для 2 человек оптимальной стимулирующей концентрацией СК явился 1 мкг/мл, для остальных - 10 мкг/мл.
Таким образом, СК в концентрациях 1 и 10 мкг/мл имеет тенденцию к повышению продукции фактора некроза опухолей-а мононуклеарными клетками периферической крови человека.
Таблица 1
Определение устойчивости мышей линии СБЛ*БЬ к стафилококковой инфекции через 24 ч после введения СК
Препарат Доза препарата, мкг/кг Количество погибших мышей Выжившие мыши, % Продолжительность жизни, сутки Кратность увеличения продолжительности жизни
Физ. р-р (контрольная группа) - 10 16,0 1,4 -
СК 1 3 74,9 6,9 4,9
10 4 66,6 4,8 3,4
100 6 50 3,2 2,3
Таблица 2
Влияние различных доз СК на бактерицидную активность клеток перитонеального экссудата мышей, (М±т)
Дозы СК, мкг/кг Бактерицидная активность, %
0 21,5±3,0
1 31±6,2*
10 36,3±5,9*
100 16,7±3,1*
*р<0,05, достоверные различия по сравнению с контролем (0 мкг/кг)
Таблица 3
Влияние СК на показатели гуморального иммунного ответа у мышей, (М±т), где М - среднее значение, т -стандартное значение _____________________________________________________________________________
Препарат Доза препарата, мкг/кг Количество АОК на селезенку Количество кариоцитов в селезенке, х108 Количество АОК на 106 спленоцитов
СК 100 11000±1068* 1,18±0,43 93,22±8,3*
10 13 000±113 8 * 1,28±0,3 101,56±8,9*
1 5650±788 1,48±0,53 38,17±5,34
Эритроциты барана (контрольная группа) 108кл/мышь 6000±1672 1,2±0,26 50±13,5
*р<0,05
Таблица 4
Влияние СК на показатели клеточного иммунного ответа у мышей, (М±т)_________________________________
Препарат Доза препарата, мкг/кг Толщина опытной лапки, мм Толщина контрольной лапки, мм Индекс ГЗТ
СК 100 4,0±0,4 2,0±0,2 2*
10 3,64±0,3 2,3±0,23 1,58*
1 3,3±0,3 2,2±0,22 1,5
Эритроциты барана (контрольная группа) 0 3,3±0,3 2,2±0,23 1,5
*р<0,05
Таблица 5
Влияние СК на люминолзависимую хемилюминесценцию лейкоцитов человека без стимуляции зимозаном,
тУ/тіи (М±т), где М - среднее значение, т - стандартное значение
Время регистрации ХЛ, мин Контроль СК, мкг/мл
1 10 100
1 6,98±3,09 6,80±4,44 5,80±0,64 2,22±1,6*
7 9,42±4,44 8,57±5,38 7,83±4,74 3,1±1,7*
11 11,32±5,88 10,2±6,24 10,0±5,66 3,8±1,8*
15 14,32±5,63 12,3±7,75 11,5±6,19 4,3±1,87*
19 12,83±5,11 10,97±7,4 10,28±5,5 3,7±2,15*
*р<0,05, достоверные различия по сравнению с контролем (0 мкг/мл)
Таблица 6 Влияние СК на люцигенинзависимую хемилюминесценцию лейкоцитов человека без стимуляции зимозаном, тУ/тіи (М±т), где М - среднее значение, т - стандартное значение
Время регистрации ХЛ, мин Контроль СК, мкг/мл
1 10 100
1 1,02±0,66 1,03±0,71 0,93±0,63 0,58±0,1*
7 1,13±0,76 1,17±0,84 1,03±0,68 0,63±0,14*
11 1,25±0,82 1,33±0,92 1,18±0,84 0,67±0,19*
15 1,47±0,92 1,57±1,17 1,28±0,86 0,77±0,23*
19 1,28±0,91 1,28±0,06 1,12±0,71 0,67±0,2*
*р<0,05, достоверные различия по сравнению с контролем (0 мкг/мл)
Таблица 7 Влияние СК на люминолзависимую хемилюминесценцию лейкоцитов человека после стимуляции зимозаном, тУ/тіи (М±т), где М - среднее значение, т - стандартное значение
Время регистрации ХЛ, мин Контроль СК, мкг/мл
1 10 100
1 106,2±33,3 112,8±35,1 120,8±41,1 21,3±12,5*
7 131,3±41,6 144,5±46,6 146,3±40,7 24,0±12,7*
11 179,5±50,2 177,2±42,1 172,2±47,0 29,7±14,3*
15 229,3±53,0 227,2±72,0 211,2±68,1 34,6±17,2*
19 203,3±43,6 200,5±45,8 192,7±64,8 30,5±13,3*
*р<0,05, достоверные различия по сравнению с контрольной группой (0 мкг/мл)
Таблица 8 Влияние СК на люцигенинзависимую хемилюминесценцию лейкоцитов человека после стимуляции зимозаном, тУ/тш (М±т), где М - среднее значение, т - стандартное значение
Время регистрации ХЛ, мин СК, мкг/мл
Контроль 1 10 100
1 21,67±5,82 26,33±8,4 19,00±8,9 5,17±3,5*
7 27,33±6,8 31,33±9,5 21,00±9,4 6,20±3,5*
11 32,67±9,5 36,33±12,4 25,33±13,35 7,50±3,45*
15 38,83±6,88 42,83±10,4 28,67±15,0 9,00±3,2*
19 33,67±6,0 38,00±10,0 24,00±11,37 7,78±2,8*
*р<0,05, достоверные различия по сравнению с контролем (0 мкг/мл)
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО... 57
Таблица 9
Влияние различных концентраций СК на продукцию ФНО-а мононуклеарными клетками периферической крови человека
№ донора Концентрация фактої ра некроза опухолей-a, пг/мл
Спонтанная продукция СК, мкг/мл
1 10 100
1 25,53 31,28 34,87 0
2 25,08 55,56 29,48 0
3 21,93 33,08 9,69 0
4 10,24 1,60 43,87 0
5 24,18 18,69 46,57 0
M±m 23,8±8,5 31,8±29,5 40,4±24,2 0*
*р<0,05, достоверные различия по сравнению с контролем (Р<0,05)
Выводы
Селекартен обладает иммуномодулирующим действием.
In vivo СК повышает устойчивость мышей к смертельной стафилококковой инфекции, стимулирует бактерицидную активность клеток перитонеального экссудата мышей, стимулирует
гуморальный тимусзависимый и клеточный иммунные ответы.
In vitro СК подавляет люминолзависимую и люцигенинзависимую спонтанную и зимозанинду-цированную хемилюминесценцию лейкоцитов человека, а также имеет тенденцию к повышению продукции ФНО-a мононуклеарными клетками периферической крови человека.
Литература
1. Манаков А.М. Клиническая картина при остром и хроническом отравлении селеном. - Труды института экспериментальной медицины. - Свердловск, 1968. - 103 с.
2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/ Под общей редакцией член-корреспондента РАМН, профессора Р.У. Хабриева. - 2-изд. пере-раб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005 - 832 с.
3. Bhaskaram P. Micronutrient malnutrition, infection and immunity: an overview // Nutr Rev. - 2002. - 60(5 Pt 2). - P. 40-5.
4. Chandra R.K. Nutrition and the immune system from birth to old age // Eur J Clin Nutr. - 2002. - 56(Suppl 3). - P. 73-6.
5. Dolph L. Hatfield, Marla J., Berry and Vadim N. Gladyshev (Eds) Selenium, Second Edition. Its Molecular Biology and Role in Human Health. - Springer US, 2006.
6. Duchateau J. Immunosenescence and the lung // Rev Mal Respir. - 2003. - 20 (5 Pt 1). - P. 735-41.
7. Gladyshev V.N. Selenium in biology and human health: controversies and perspectives. - In Selenium: its molecular biology and role in human health / D.L. Hatfield et all. - Kluwer Academic Publishers, Norwell, Mass, 2001 - P. 313-7.
8. Huang K., Yang A. Inhibitory effect of selenium on Cryptosporidium parvum infection in vitro and in vivo // Biol Trace Elem Res. - 2002. - 90. - P. 261-72.
9. Langkamp-Henken B., Bender B.S., Gardner E.M. Nutritional formula enhanced immune function and reduced days of symptoms of upper respiratory tract infection in seniors // J Am Geriatr Soc. - 2004. - 52. -P. 3-12.
10. Rayman M.P. The argument for increasing selenium intake // Proc Nutr Soc. - 2002. - 61. - P. 203-15.
11. Tappel A., Caldwell K. Acceleration of sulfhydryl oxidations by selenocystine // Abstracts of 1nd Internat. Symp. (Oregon State University). - 1966. - P. 345.
12. WaylandM., Gilchrist H.G., Marchant T. Immune function, stress response, and body condition in arctic-breeding common eiders in relation to cadmium, mercury, and selenium concentrations // Environ Res. -2002. - 90. - P. 47-60.
13. WhangerP.D. Selenium and its relationship to cancer: an update dagger // Br J Nutr. - 2004. - 91. - P. 11-29.
