CC BY
141
№ 4 - 2012 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 615.244:616.36-001-092.9
ИЗУЧЕНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ
12 2 11 1 1 О.Н. Потеряева ’ , Г.С. Русских , В.В. Иванова , О.Р. Грек , В.И. Шарапов , М.Г. Ханина ,
3 1
М.М. Геворгян , В.В. Величко
1ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития (г. Новосибирск)
2ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН (г. Новосибирск)
3ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН (г. Новосибирск)
Сравнительное исследование гепатопротекторного действия карсила и сухих экстрактов из надземной части репешка волосистого, листьев и корней лопуха войлочного и бересты березы повислой в условиях экспериментального токсического повреждения печени крыс парацетамолом показало, что введение исследуемых растительных экстрактов приводило к снижению активности аланиновой трансаминазы, подавлению активности матриксных металлопротеиназ, содержание альбуминов сохранялось в норме.
Ключевые слова: растительные экстракты, парацетамол, повреждение печени, матриксные металлопротеиназы.
Потеряева Ольга Николаевна — доцент, доктор медицинских наук, исполняющая обязанности заведующего кафедрой медицинской химии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: [email protected]
Русских Галина Сергеевна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, телефон рабочий: 8 (383) 333-54-81, email: [email protected]
Грек Олег Рувимович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 236-09-02, e-mail: [email protected]
Иванова Виктория Валерьевна — соискатель кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», врач УЗ-диагностики, email: [email protected]
Шарапов Виктор Иванович — доктор медицинских наук, профессор кафедры медицинской химии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 226 65 41
Ханина Марина Георгиевна — аспирант кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-07-13, e-mail: [email protected]
Геворгян Маргарита Маиловна — кандидат биологических наук, заведущий клиникобиохимической лаборатории клиника ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН, е-mail:
Величко Виктория Владимировна — кандидат фармацевтических наук, преподаватель кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-07-13, е-mail:
Введение. Отравления парацетамолом в связи с его доступностью и относительно высокой токсичностью остаются наиболее распространенными в мире причинами поражений печени [1, 3]. Развивающаяся печеночная недостаточность, связанная с интенсификацией процессов перекисного окисления, продукцией и накоплением высокотоксичного метаболита парацетамола (N-ацетил-р-бензохинонимин), приводит к некрозу гепатоцитов и фиброзу печени [4]. В последние годы исследователей привлекают природные соединения, полученные из растительного сырья. Интерес к растительным экстрактам связан с низкой токсичностью и комплексным действием биологически активных веществ (БАВ). Гепатопротективное действие растительных экстрактов обеспечивается присутствием в их составе группы фенольных соединений, полисахаридов, сапонинов, обладающих широким спектром биологической активности [2]. В связи с этим изучение гепатопротекторного действия экстрактов, полученных из растительного сырья, является актуальной задачей.
Цель исследования. Изучить показатели белкового обмена, билирубин, мочевину и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и матриксных металлопротеиназ (ММП-2,7) в сыворотке крови крыс в условиях экспериментального токсического повреждения печени, вызванного внутрижелудочным введением парацетамола, и сравнить гепатопротекторное действие карсила и сухих экстрактов из надземной части репейничка волосистого — Agrimonia pilosa (сем. Rosaceae), листьев и корней лопуха войлочного — Arctium tomentosum (сем. Asteraceae) и бересты березы повислой — Betula pubescens (сем. Betulaceae).
Материалы и методы. Эксперименты выполнялись на самцах крыс Вистар массой 200250 г (n = 45), полученных из вивария НГМУ. Протокол исследования соответствовал правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 и приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003). Экстракты из воздушно сухого сырья получали этанолом различной концентрации исчерпывающей экстракцией при нагревании на водяной бане. Экстрагент удаляли при щадящем температурном режиме. Парацетамол («Верофарм») вводили внутрижелудочно в крахмальной слизи двукратно в дозе 2 г/кг массы тела животного. Контрольной группе животных вместо парацетамола вводили крахмальную слизь. Сухие экстракты в крахмальной слизи вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в течение трех дней предварительно перед введением парацетамола. В качестве препарата сравнения использовали карсил («Sopharma»), который вводили животным внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в течение трех дней предварительно перед введением парацетамола. Материал для исследования забирали через сутки после введения парацетамола.
Исследования проводили в сыворотке крови крыс. Белковые фракции оценивали методом электрофореза на ацетат-целлюлозных пленках, содержание общего белка определяли биуретовым методом. Концентрацию общего и прямого билирубина, мочевины и активность АлТ определяли с использованием наборов (PLIVA-Lachema Diagnosticum, Чехия), активность ММП-2,7 — по методу Nagase et al. [5] с использованием флуоресцентного субстрата (Calbiochem, США).
Печень экспериментальных животных фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Для гистологической обработки вырезали из большой доли печени образцы толщиной 3-5 мм, забранные образцы подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе MICROM («Карл Цейс», Германия). Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и 10 % раствором эозина. В печени подсчитывали объемную плотность, количество дистрофически и некротически измененных гепатоцитов, инфильтратов, численную плотность двуядерных гепатоцитов.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием пакета программ «Statistica,ver. 6.0». Определяли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (m); различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и считали значимыми при p < 0,05.
Результаты. Сухие экстракты из травы р. волосистого (ЭР), листьев (ЭЛЛ) и корней (ЭКЛ) л. войлочного представляют собой кристаллические порошки зеленого и коричневого цветов с приятным травяным запахом и горьковатым вкусом. Экстракт из бересты (ЭБ) представляет собой аморфный порошок светло-коричневого цвета без запаха, горьковатого вкуса. Экстракты растворяются в воде, лучше при нагревании. Доминирующими группами БАВ в экстракте р. волосистого являются фенольные соединения (флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, окисляемые полифенольные соединения), в экстрактах л. войлочного — полисахариды и гидроксикоричные кислоты, в экстракте бересты — тритерпеновые сапонины и фенольные соединения. Введение парацетамола сопровождалось морфологическими изменениями в печени: отмечена перипортальная и ацинарная локализация некротических изменений, некрозы преимущественно локализовались в центролобулярной зоне. В зоне некрозов наблюдалась полинуклеарная инфильтрация, гепатоциты в пограничной зоне некрозов находились в состоянии дистрофии. Полученные гистологические данные подтверждают наличие у крыс острого токсического гепатита.
Исследование белковых фракций показало, что при введении парацетамола снижается процентное содержание альбуминов, возрастает доля a1-, a2-, Ь2-глобулинов и снижается доля g-глобулинов по сравнению с контрольной группой животных (табл. 1).
Таблица 1
Содержание белковых фракций в сыворотке крови крыс при введении парацетамола, карсила и растительных экстрактов
Г руппы Альбумины, % Глобулины, %
ai а2 bi b2 g
1. Интактные (n = 20) 48,8 ± 0,97 11,3 ± 0,54 5,5 ± 0,31 5,9 ± 0,33 15,3 ± 0,33 13,2 ± 0,57
2. Парацетамол (n = 6) 41,8 ± 0,87 P1-2 < 0,001 16,6 ± 0,88 P1-2 < 0,001 7,5 ± 0,81 P 1-2< 0,05 6,1 ± 0,6 17,3 ± 0,74 P1-2 < 0,05 10,7 ± 0,58 P1-2 < 0,01
3. Парацетамол + карсил (п = 6) 46,1 ± 0,93 Р2-3 < 0,01 15,1 ± 1,25 Р1-3 < 0,01 7,7 ± 0.55 Р1-3 < 0,01 8,4 ± 1,2 Р1-3 < 0,05 14,0 ± 0,92 Р2-3 < 0,05 9,9 ± 0,55 Р1-3 < 0,001
4. Парацетамол +ЭБ (п = 6) 44,2 ± 0,8 Р1-4 < 0,01 14,3 ± 1,07 Р1-4 < 0,05 6,8 ± 0,46 Р1-4 < 0,05 6,2 ± 0,94 17,4 ± 1,14 11,1 ± 0,79 Р1-4 < 0,05
5. Парацетамол + ЭР (п = 7) 46,8 ± 1,53 Р2-5 < 0,01 13,5 ± 0,86 Р1-5 < 0,05 Р2-5 < 0,05 9,2 ± 0,53 Р1-5 < 0,001 6,6 ± 0,47 14,9 ± 0,82 Р2-5 < 0,05 9,3 ± 0,61 Р1-5 < 0,001
6. Парацетамол + ЭЛЛ (п = 9) 50,1 ± 0,59 Р2-6 < 0,001 12,6 ± 0,36 Р2-6 < 0,001 8,6 ± 0,62 Р1-6 < 0,001 5,0 ± 0,19 Р1-6 < 0,05 14,1 ± 0,47 Р2-6 < 0,01 9,7 ± 0,49 Р1-6 < 0,001
7. Парацетамол + ЭЛК (п = 9) 46,0 ± 1,2 Р2-7 < 0,01 13,2 ± 0,54 Р1-7 < 0,05 Р2-7 < 0,01 8,2 ± 0,79 Р1-7 < 0,01 5,9 ± 0,31 16,2 ± 0,83 10,5 ± 0,99 Р1-7 < 0,05
Примечание: ЭР — экстракт травы р. волосистого, ЭЛЛ — экстракт листьев л. войлочного, ЭКЛ — экстракт корней л. войлочного, ЭБ — экстракт бересты
Предварительное введение карсила сохраняло содержание альбуминов в норме, при этом Я1-, а2-, Ь1-глобулины оставались повышенными. Введение ЭБ достоверно не меняло картину действия парацетамола, но отмечалась тенденция к повышению альбуминов и снижению а1-, а2-глобулинов по сравнению с группой 2. Введение ЭР сохраняло долю альбуминов и Ь2-глобулинов в норме. Однако, а1-, а2-глобулины остались повышенными по отношению к интактным животным. Предварительное введение ЭЛЛ и ЭКЛ сохраняло процентное содержание альбуминов на уровне нормальных значений. Было отмечено, что ни карсил, ни один из растительных экстрактов не снимал действия парацетамола на §-глобулины, они оставались сниженными по отношению к интактным животным.
Введение парацетамола повышало активность АлТ в сыворотке в 4,2 раза по сравнению с контрольной группой (2,31 ± 0,29 и 0,55 ± 0,05 ммоль/л/ч, р < 0,05 соответственно); при этом увеличивалась концентрация прямого билирубина от 2,46 ± 0,22 до 4,01 ± 0,71 мкмоль/л. На фоне предварительного введения карсила активность АлТ в сыворотке крови составила 1,05 ± 0,16 ммоль/л/ч, что в два раза ниже (р < 0,05) по сравнению с группой, получавшей парацетамол. Подобным действием обладали ЭБ и ЭЛЛ (1,03 ± 0,25 и 1,39 ± 0,21 ммоль/л/ч, р < 0,05 соответственно). Кроме того, для ЭБ отмечали снижение прямого билирубина до контрольного уровня (1,18 ± 0,53 мкмоль/л), что не наблюдалось при введении всех остальных экстрактов и карсила. Морфологические изменения в структуре печени были значительно менее выражены при профилактическом введении исследуемых экстрактов. Уменьшались площади некрозов: через сутки после введения парацетамола зоны некроза занимали 30-40 % площади дольки, при профилактическом введении ЭБ — 10-15 % , карсила — 15-25 %; при этом отсутствовали массивные очаги некрозов.
При предварительном введении ЭР и ЭКЛ активность АлТ оставалась на высоком уровне (2,08 ± 0,19 и 2,12 ± 0,21 ммоль/ч/л соответственно); концентрация общего билирубина выросла за счет прямого билирубина по сравнению с контрольными значениями (7,12 ±
0,82; 9,12 ± 2,17 и 2,46 ± 0,22 мкмоль/л, р < 0,05 соответственно). Определение мочевины в сыворотке крови не выявило достоверных изменений в исследуемых группах животных.
Активность ММП контрольной группы составила 190,4 ± 11,35 мкмоль МСА/л/ч. Введение парацетамола сопровождалось повышением активности ферментов (259,7 ± 14,46; р < 0,001). На фоне карсила активность ММП снижалась (180,9 ± 7,22; р < 0,001).
Исследуемые сухие экстракты также приводили к достоверному снижению активности ММП (ЭБ — 171,0 ± 2,77; ЭР — 189,0 ± 3,23; ЭЛЛ — 181,7 ± 2,10; ЭКЛ — 184,5 ± 2,73). Активность изучаемых ферментов под действием ЭБ по сравнению с другими экстрактами была достоверно ниже (р < 0,005).
Обсуждение результатов. Установлено, что в условиях токсического повреждения печени, вызванного парацетамолом, происходит нарушение проницаемости мембран гепатоцитов (увеличение активности цитоплазматического фермента АЛТ), белок-синтетической функции печени (снижение общего белка, за счет альбуминов), секреции билирубина в желчь (увеличение прямого билирубина), структуры межклеточного матрикса (увеличение активности ММП); подавление функции иммунокомпетентных клеток (снижение g-глобулинов). Нарастание активности ММП идет параллельно с экспрессией белков острой фазы. Через 24 ч после введения парацетамола усиление активности ММП сопровождалось развитием выраженных деструктивных процессов во внеклеточном матриксе, подтвержденных морфологическими исследованиями печени.
Выводы. Через 24 ч после энтерального введения парацетамола в дозе 2 г/кг развивалась выраженная гипоальбуминемия и увеличивалась концентрация белков острой фазы (ai-, a2-, Ь2-глобулинов) в сыворотке крови крыс. Карсил и исследуемые растительные экстракты сохраняли нормальные показатели процентного содержания общего белка за счет альбуминов. Повышение доли а2-глобулинов и гипо^-глобулинемия, вызванные парацетамолом, сохранялись при введении карсила и других растительных экстрактов. В группе животных, получавших парацетамол, отмечали увеличение активности ММП. Карсил и сухие экстракты, улучшая состояние межклеточного матрикса, снижали активность ММП, наиболее выраженный эффект был отмечен у сухого ЭБ.
Список литературы
1. Шульпекова Ю. О. Лекарственные поражения печени / Ю. О. Шульпекова // Consilium medicum. — 2007. — № 1. — С. 16-25.
2. Hepatoprotective activity of Terminalia paniculata against paracetamol induced hepatocellular damage in Wistar albino rats / B. R. Eesha [et al.] // Asian. Pac. J. Trop. Med. — 2011. — Vol. 4, N 6. — P. 466-469.
3. Hawkins L. C. Impact of restricting paracetamol pack sizes on paracetamol poisoning in the United Kingdom / L. C. Hawkins, J. N. Edwards, P. I. Dargan // Drug safety ; an international J. Medical Toxicology and drug experience. — 2007. — Vol. 30, N 6. — P.465-479.
4. James L. P. Acetaminophen — induced hepatotoxicity / L. P. James, P. R. Mayeux, J. A. Hinson // Drug. Metab. Dispose. — 2003. — Vol. 31, N 12. — P. 1499-1506.
5. Nagase H. Design and characterization of a fluorogenic substrate selectively hydrolyzed by stromelysin 1 (matrix metalloproteinase-3) / Н. Nagase, С. G. Fields, G. В. Fields // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269, N 33. — P. 20952-20957.
INVESTIGATIONS OF HEPATOPROTECTIVE EFFECTS OF VEGETABLE EXTRACTS AT EXPERIMENTAL LIVER DAMAGE
O.N. Poteryaeva1'2, G.S. Russkikh2, V.V. Ivanova1, O.R. Grek1, V.I. Sharapov1, M.G. Khanina1,
M.M. Gevorgyan3, V.V. Velichko1
1SEIHPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment» (Novosibirsk c.)
2
FSBE «RI of biological chemistry» SB RAMS (Novosibirsk c.)
3FSBE «SCCEM» (Novosibirsk c.)
Comparative research of hepatoprotective action Carsil and dry extracts from above-ground part of hair-vein agrimony, leaves and roots of pannose burdock and birch bark of weeping birch in the conditions of experimental toxic liver damage of rats with paracetamol showed, that introduction of studied vegetative extracts led to depression of alanine transaminase activity, suppression of matrix metalproteinases activity; maintenance of albumins remained in norm.
Keywords: vegetative extracts, paracetamol, liver damage, matrix metalloproteinases.
About authors:
Poteryaeva Olga Nikolaevna — assistant professor, doctor of medical sciences, vice-head of medical chemistry chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», e-mail: [email protected]
Russkikh Galina Sergeevna — candidate of biological sciences, senior research associate at FSBE «RI of biological chemistry» SB RAMS, office phone: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Grek Oleg Ruvimovich — doctor of medical sciences, professor, head of pharmacology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», office phone: 8 (383) 236-09-02, e-mail: [email protected]
Ivanova Victoria Valerievna — degree-seeking student of pharmacology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», doctor of ultrasound diagnostics, e-mail: [email protected]
Sharapov Victor Ivanovich — doctor of medical sciences, professor of medical chemistry chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», office phone: 8 (383) 226 65 41
Khanina Marina Georgievna — post-graduate student of pharmacognosy and botany chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», work phone: 8 (383) 225-07-13, e-mail: [email protected]
Gevorgyan Margarita Mailovna — candidate of biological sciences, head of clinical biochemical laboratory at clinic of FSBE «SCCEM», e-mail: [email protected]
Velichko Victoria Vladimirovna — candidate of pharmaceutical sciences, teacher of pharmacognosy and botany chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment, work phone: 8 (з8з) 225-07-1з, е-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Shulpekova Y. O. Medicinal lesions of liver / Y. O. Shulpekova // Consilium medicum. — 2007. — № 1. — P. 16-25.
2. Hepatoprotective activity of Terminalia paniculata against paracetamol induced hepatocellular damage in Wistar albino rats / B. R. Eesha [et al.] // Asian. Pac. J. Trop. Med. — 2011. — Vol. 4, N 6. — P. 466-469.
3. Hawkins L. C. Impact of restricting paracetamol pack sizes on paracetamol poisoning in the United Kingdom / L. C. Hawkins, J. N. Edwards, P. I. Dargan // Drug safety ; an international J. Medical Toxicology and drug experience. — 2007. — Vol. з0, N 6. — P.465-479.
4. James L. P. Acetaminophen — induced hepatotoxicity / L. P. James, P. R. Mayeux, J. A. Hinson // Drug. Metab. Dispose. — 200з. — Vol. зі, N 12. — P. 1499-1506.
5. Nagase H. Design and characterization of a fluorogenic substrate selectively hydrolyzed by stromelysin 1 (matrix metalloproteinase-з) / Н. Nagase, С. G. Fields, G. В. Fields// J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269, N зз. — P. 20952-20957.
