CC BY
61
О.Н. Доброхотский1, Г. А. Зиновьев1, И. И. Воинцева2, О.Н. Скороходова2, Н.В. Негрий3, А.Л. Мазано в3, Р. В. Боровик3
ИЗУЧЕНИЕ БИОЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНТЕРПОЛИМЕРНОГО ПОКРЫТИЯ НА ОСНОВЕ ПОЛИГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНИДИНА
1 ФГУЗ Медико-санитарная часть №164 ФМБА России, Оболенск 2 ООО «Эвима-М», Москва 3 ФГУН Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов ФМБА России, Серпухов
О.Ы. Dobrokhotsky1, в.А. гупоуеу1,!.!. Vointseva2, O.N. Skorokhodova2, N.V. Negriy3, A.L. Mazanov3, R
STUDING OF BIOCIDAL ACTION OF INTERPOLYMERS POLYGUANIDINE-
BASED COATING
' FSHCEMD #164 FMBA of Russia, Obolensk 2 Evima-M Ltd., Moscow 3 SFES Research Center for
Toxicology and Hygienic Regulation of Biopreparations at FMBA of Russia, Serpukhov
Ключевые слова: полигуанидины, биоцидные покрытия, биопленка, обеззараживание воды. Key words: polyguanidines, biocidal coatings, biofilm, water disinfection.
Цель: Изучение эффективности и безопасности использования биоцидных покрытий на основе интерполимера полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ЛГМГхл) и хлорсульфиро- ванного полиэтилена (ХСПЭ) для обеззараживания и консервации питьевой воды, защиты оборудования от биообрастания.
Материалы и методы: Биоцидный лак, представляющий собой раствор интерполимера ПГМГхл и ХСПЭ в сольвенте, наносили на стальные загрунтованные пластины. После отверждения лака при 70°С получили образцы интерполимерных покрытий различного состава, содержащих от 9,5 до 30% связанного ПГМГхл.
Изучили водостойкость и другие физико-механические свойства образцов покрытий (адгезию, относительную твердость, разрывную прочность и эластичность). Отобрали 6 образцов покрытий, содержащих от 9,5 до 19% связанного ПГМГхл, которые обладают водостойкостью, и определили их эффективность в водной среде в отношении тест- культуры (E.Coli).
По результатам исследований выбрали образец интерполимерного покрытия оптимального состава, сочетающий водостойкость и биоцидное действие в отношении Е. Coli. Изучили эффективность покрытия в отношении Е. Coli при различной температуре и «водной нагрузке». Изучили эффективность покрытия оптимального состава для предотвращения биообрастания поверхностей и обеззараживания воды, контаминированной тест-культурами Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepaciae, Salmonella enteritidis, Bacillus globigii (бактерии и споры). Концентрацию тест-микроорганизмов в пробах воды и в смывах с поверхности определяли по стандарту РГИмедицинских и биологических препаратов им. JI.A. Тарасеви- ча(в трех повторностях с расчетом средних величин и доверительных интервалов).
V. Borovick
Изучили возможность консервации водопроводной воды над интерполимерным покрытием (срок наблюдения составил 420суток).
Токсикологические характеристики воды, контактирующей с биоцидным покрытием, определяли по данным химического анализа, а также с использованием биотестирования на дафниях. (Daphnia magna Straus).
Результаты: Определен оптимальный состав интерполимерного покрытия ПГМГхл/ ХСПЭ=19:81 мас.%, сочетающий водостойкость и эффективность в отношении тест- микроорганизмов. Показано, что в водной среде покрытие обладает сильным бактерицидным действием в отношении Е. Coli, Bacillus globigii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Pseudomonas cepaciae, а также слабым спороцидным действием в отношении спор Bacillus globigii.
Установлено, что покрытие, предотвращающее вторичное микробное обсеменение питьевой воды и биообрастание поверхностей, не представляет опасности при контакте с питьевой водой, так как в воде над покрытием свободный ПГМГхл не превышает ПДК (1 мг/л), что подтверждается результатами биопроб с дафниями.
Выводы: Интерполимерное покрытие ПГМГхл/ХСПЭ может быть использовано для борьбы с микробным обсеменением воды, а также для предотвращения образования биопленок и биообрастания поверхности оборудования, эксплуатирующегося в длительном контакте с водой.
The purpose: Studying of efficiency and safety of use biocidal coatings on a basis interpolymers polyguanidines hydrochloride (PHMGhl) and chlorine-containingpolymer (HSPE) for disinfecting and preservation of potable water, protection of the equipmentfrom biofouling.
Materials and methods: Biocidal a varnish representing a solution interpolymer PHMGhl and HSPE in solvent, rendered on steel plates. The ambassador a varnish at 70°C have received samples interpolymer coatings of the various structure containing from 9,5 up to 30 % connected PHMGhl. Have studied water resistance and other physicomechanical properties of samples of coatings (adhesion, relative hardness, explosive durability and elasticity). Have selected 6 samples of the coatings containing from 9,5 up to 19 % connected PHMGh. which possess water resistance, and have defined their efficiency in the water environment concerning test - culture (E. Coli).
By results of researches have chosen a sample interpolymer coatings of the optimum structure, combining water resistance and biocidal action in attitude E. Coli. Have studied efficiency of a covering in attitude E. Coli at various temperature and « water loading».
Have studied efficiency of a covering of optimum structure for prevention biofouling surfaces and disinfectingofwaterwith tests - cultures Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepaciae, Salmonella enteritidis, Bacillus globigii (bacteria and disputes). Concentration of tests - microorganisms in tests of water and in washouts from a surface defined under standard RSI of medical and biological preparations L.A. Tarasevich (in three with calculation of average sizes and confidential intervals). Have studied an opportunity ofpreservation of water above interpolymer coating (term of supervision has made 420 day). Toxicological characteristics of the water contacting with biocidal by a coating, defined according to the chemical analysis, and also with use of biotesting on daphnia.
Results: The optimum structure interpolymer coating PHMGhl/HSPE=19:81 mass %>, the combining water resistance and efficiency concerning tests - microorganisms. It is shown, that in the water environment the covering possesses strong bactericidal action in attitude E. Coli, Bacillus globigii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Pseudomonas cepaciae, and also biocidal action in attitude Bacillus globigii. The coating preventing secondary microbics ofpotable water and biofouling of surfaces is established, that, does not represent danger at contact to potable water as in water above a coveringfree PHMGhl does not exceed maximum concentration limit (1 mg/l) that proves to be true results of biotests with daphnia. Conclusions: Interpolymer coating PHMGhl/HSPE can be used for struggle with microbic pollution waters, and also for prevention offormation biofilms and biofouling surfaces of the equipment maintained in long contact to water.
В основу Руководства по контролю качества питьевой воды, изданного Всемирной организацией здравоохранения, заложены основные критерии, которые состоят в следующем: питьевая вода должна быть безопасна в эпидемическом отношении, безвредна по химическому составу и обладать благоприятными органолептическими
свойствами [6].
Вода из природных поверхностных источников все менее пригодна для непосредственного использования, так как может стать фактором передачи возбудителей многих бактериальных и вирусных инфекций. Кроме типичных патогенных бактерий в питьевой воде могут находиться условно-патогенные микроорганизмы, эпидемиологическое
значение которых в настоящее время существенно возросло (E.coli, P.aeruginosa, Salmonella spp. и др.).
Наибольшую опасность представляют микробные сообщества бактерий (биопленки): слой поверхностных экзополисахаридов и межклеточный матрикс в составе биопленки защищает бактерии от воздействия дезинфектантов [5]. Биопленки оккупируют внутренние поверхности водопроводных труб, часто располагаются в труднодоступных местах. Обработка дезинфицирующими средствами нарушает только верхний слой биопленки, поэтому жизнеспособные бактерии, находящиеся в глубине биопленки, выделяются в воду, что приводит к бактериальному загрязнению водопроводной воды [8].
Среди дезинфектантов для обеззараживания питьевой воды чаще всего используют хлор, который обладает серьезными недостатками: токсичностью, коррозионной активностью. Быстро улетучиваясь из воды, хлор оставляет в ней свыше 300 токсичных хлорорганических соединений, обладающих кумулятивным и канцерогенным действием. Хлор в водопроводной воде не должен превышать предельно допустимую
концентрацию, а при таких концентрациях уничтожаются далеко не
все находящиеся в воде микроорганизмы: некоторые споры бактерий, а также цисты простейших и яйца гельминтов устойчивы к реагенту. Поэтому хлорирование питьевой воды не всегда гарантирует предупреждение водных вспышек инфекционных заболеваний, особенно в период паводка или массового развития сине-зеленых водорослей («цветение» воды).
Важнейшими задачами в области дезинфектологии является разработка принципиально новых дезинфицирующих средств для обеззараживания воды, обладающих широким спектром и про-лонгированностью биоцидного действия, низкой токсичностью и безопасностью для окружающей среды. К такого рода дезинфектантам относятся полимерные биоцидные препараты — полигуанидины, главным представителем которых является полигексаметиленгуанидин гидрохлорид
(ПГМГхл):
~{сн 2\- NH - С - NH ~
II
т + А~ 1
где А--С1 ~ ,п =30—90.
ПГМГхл — твердое, термически стабильное вещество без цвета и запаха, легко растворяется в воде, обладает антимикробной, антивирусной, спороцидной, фунгицидной, альгицидной активностью, не вызывают коррозию оборудования; относится к III классу умерено опасных соединений при попадании в желудок и к IV классу малоопасных соединений при попадании на кожу (по ГОСТ 12.1.007-76), биоразлага- ем. Водные растворы ПГМГхл широко используется в дезинфекционной практике, а также в качестве биоцидной добавки в различные композиционные материалы [3].
Установлено, что при концентрации 0,5мг/л в воде ПГМГхл со 100%-ной эффективностью инактивирует бактерии E.coli, добавленные в воду в концентрации 105 КОЕ/мл [7]. ПГМГхл разрешен
для обеззараживания питьевой воды: в концентрации 1 мг/л он полностью обеззараживает воду и безопасен для использования (Гигиенический сертификат № 1В-П/897 от 29.07.1994г). Однако для предотвращения биообрастания оборудования требуются концентрации ПГМГхл от 3,0 до 75 мг/л, а в случае роста микрофлоры полное ее уничтожение достигается при добавлении реагента в концентрации 2x104 мг/л [3].
Поэтому, в некоторых случаях удобнее использовать ПГМГ в виде водостойкого биоцидного покрытия, нанесенного на поверхность оборудования, поскольку использование растворимого полимера требует постоянного контроля и Поддержания его концентрации на необходимом уровне.
С целью получения водостойкого биоцидного покрытия мы использовали способность гуанидиновых группировок ПГМГхл вступать в химическое взаимодействие с легко подвижными атомами хлора, содержащимися в пленкообразующем полимере — ХСПЭ [6]. Химическую реакцию между двумя полимерами проводили в сольвенте при комнатной температуре; образующийся раствор интерполимера представляет собой биоцидный лак для защиты поверхности. Способ получения биоцидного лака и подготовка поверхностей для его нанесения описаны нами в патенте [2]. Такой лак под названием «Ин- терцид» или «Септопаг» рекомендован для
пролонгированной дезинфекции помещений с большим скоплением и длительным пребыванием людей [1,9].
В данной работе изучена возможность использования интерполимерного лака для обеззараживания или консервации питьевой воды, для борьбы с биообрастанием поверхностей и предотвращением образования биопленок.
Состав биоцидного лака изменяли таким образом, чтобы интерполимерное покрытие содержало от 9,5 до 30 % химически связанного ПГМГхл. Для проведе
ния испытаний биоцидный лак наносили на стальные загрунтованные пластины площадью 25 см2 и отверждали 2 часа при 70°С. Полученные покрытия обладают хорошей адгезией к поверхности; являются каучуками с высоким модулем эластичности (как исходный ХСПЭ); относительная твердость 0,12—0,20 у.е., прочность при ударе — 50 см, эластичность при изгибе — 1 мм; покрытия выдерживают нагревание до 170°С.
Из полученных покрытий, водной экстракцией удаляли свободный ПГМГхл до тех пор, пока концентрация последнего в воде над покрытием стабилизировалась на уровне 0,1 — 0,2 мг/л. Концентрацию ПГМГхл в воде определяли по методике Ефимова K.M. с соавторами [4]. Затем образцы покрытий помещали в воду и определяли их водостойкость, а также эффективность и безопасность использования в контакте с питьевой водой.
Водостойкость покрытий, содержащих от 9,5 до 30% связанного ПГМГхл, изучали по ГОСТ 9.403-80 (метод 1) и установили, что водостойкостью обладают покрытия, содержащие от 9,5 до 19% связанного ПГМГхл; покрытия с более высоким содержанием ПГМГхл разрушаются в воде.
Для изучения биоцидной эффективности покрытий, содержащих от 9,5 до 19% связанного ПГМГхл, в качестве тест-культуры использовали E.coli, штамм 25922.
Пластины с интерполимерными покрытиями, а также загрунтованную пластину без покрытия (контроль) помещали в отдельные емкости с дехлорированной водопроводной водой; воду над пластинами контаминировали E.coli в концентрации 50-100 КОЕ/мл. Емкости хранили при комнатной температуре, периодически перемешивая воду и отбирая пробы воды для анализа, а также делали смывы с поверхности пластин. В пробах воды определяли концентрацию жизнеспособных клеток Е coli и концентрацию свободного ПГМГхл
Исследования показали, что интерполимерные покрытия, подобно свободному ПГМГхл, полностью инактивируют E.coli: В воде над пластинами с интерполимерными покрытиями концентрация бактерий E.coli быстро уменьшается, тогда как в контрольной воде наблюдается интенсивное размножение бактерий (Рис.1). Эффективность
обеззараживания воды над всеми интерполимерными покрытиями составляет 100% (Рис. 2). Этот эффект достигается тем быстрее, чем больше содержание связанного ПГМГхл в покрытии: при содержании 15 или 19% связанного ПГМГхл для полной инактивации E.coli требуются 1 сутки, а при содержании 9,5—13,0% связанного ПГМГ — 2—3 суток. На поверхности интерполимерных покрытий бактерии E.coli не были обнаружены, тогда как на поверхности контрольной пластины концентрация бактерий росла на протяжении всего эксперимента (Рис. Г).
Для дальнейших микробиологических и токсикологических исследований было выбрано интерполимерное покрытие оптимального состава, содержащее 19% связанного ПГМГхл и 81% ХСПЭ, которое сочетает наилучшие физикомеханические характеристики, водостойкость и эффективность в отношении E.coli. В результате исследований было установлено, что эффективность такого покрытия в отношении E.coli сохраняется при «водной нагрузке» на Покрытие от 20 до 120 мл/см2 в интервале температур от 5 до 40°С.
Для изучения спектра биоцидного действия интерполимерного покрытия нами были выбраны следующие тест-микроорганизмы: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepaciae, Salmonella enteritidis, Bacillus globigii.
Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) — условно патогенная, грамо-трицательная бактерия; обнаруживается при абсцессах и гнойных ранах, особенно
поражает людей с ослабленным иммунитетом. Длительная выживаемость и размножение этого микроорганизма в окружающей среде и высокая устойчивость к антибиотикам и хлорсодержащим дезинфектантам способствуют ее присутствию в воде бассейнов, баках-накопителях, бальнеосистемах и т.п.
Pseudomonas cepaciae (Burkholderia cepaciae) — условно патогенная бактерия. Вызывает пневмонию, инфекцию мочевых путей, менингит, перитонит, ожоговую и послеоперационную инфекцию, сепсис; с трудом поддается лечению, так как возбудитель устойчив к антибиотикам.
Salmonella enteritidis — грамотрица-тельная бактерия, вызывает тяжелое поражение желудочно-кишечного тракта (сальмонеллез). Заражение Salmonella enteritidis происходит, в основном, через пищевые продукты, а также через загрязненную воду при ее питье и купании. В водопроводной воде и в открытых водоемах Salmonella enteritidis сохраняются несколько месяцев, устойчива к неблагоприятным условиям окружающей среды, например, к низким температурам, а также к хлорсодержащим дезсредствам.
Bacillus globigii — грамотрицательная бактерия, в цикл развития которой входит спорообразование. Споры Bacillus globigii устойчивы к экстремальным температурам, высушиванию, ионизирующим излучениям, химическим агентам.
Установлено, что в воде над пластинами с интерполимерным покрытием клетки тест-микрорганизмов инактивируются со 100%-ной эффективностью через 1 сутки после начала эксперимента; на поверхности пластин с покрытием бактерии не были обнаружены. В отличие от этого в контрольном опыте в воде и на поверхности пластин концентрация тест-микроорганизмов быстро увеличивается, как показано на рисунке 3 на примере контрольного опыта с Pseudomonas aeruginosa.
Рис. 1. Изменение концентрации Е соЬ в воде над пласти
нами с интерполимерными покрытиями ПГМГхл/ХСПЭ и на контрольной пластине Содержание связанного ПГМГхл в покрытии: 1— 9.5%; 2 — 10.5%; 3 — 12.5%; 4 — 13.5%, 5 — вода над контрольной пластиной, 6 — поверхность контрольной пластины.
Рис 2. Эффективность действия интерполимерных покрытий ПГМГхл/ХСПЭ в воде, контаминированной Е сой Содержание связанного ПГМГхл в покрытии• 1 - 9.5%; 2 -10.5%, 3-12 5%; 4-13 5%; 5-15 0%. 6-19.0%.
Рис. 3. Изменение концентрации клеток Pseudomonas aeruginosa в контрольном опыте: 1 — вода над контрольной пластиной; 2 — поверхность контрольной пластины.
Рис 4 Изменение общего микробного числа в контрольном
сосуде при длительном хранении питьевой воды. 1 — вода над контрольной пластиной; 2 — поверхность контрольной пластины.
При контаминации воды бактериями и спорами Bacillus globigii наблюдение продолжали в течение 300 суток при температуре 20° и 40°С. В воде над интерполимерным покрытием бактерии Bacillus globigii инактивировались через 1 сутки. Концентрация спор Bacillus globigii постепенно уменьшалась; при увеличении
экспозиции более 40 суток споры Bacillus globigii в воде не обнаруживались. В контрольном оразце воды концентрация клеток росла, концентрация спор сохранялась на исходном уровне в течение 200 суток, а затем начала расти на поверхности контрольной пластины. Таким образом интерполимерное покрытие обладает
Рис. 5. Биоцидное действие интерполимерного покрытия в водопроводной воде (срок хранения 12месяцев), а — контрольный бетонный блок с биообрастанием; б — бетонный блок обработан интерполимерным покрытием и
не имеет признаков биообрастания.
сильным бактерицидным и слабым спо-роцидным действием.
Токсические свойства воды, хранящейся над интерполимерным покрытием оптимального состава, изучали с помощью химического анализа и методом биотестирования на дафниях.
Химический анализ проб воды из емкостей с экспериментальными пластинами показал, что концентрация свободного ПГМГхл в воде на протяжении всех экспериментов составляла 0.1—0.3 мг/л, то есть не превышала предельно допустимую концентрацию для питьевой воды (1,0 мг/л).
Биотестирование воды, выполненное на дафниях (Daphnia magna Straus) в соответствии с методическим руководством РД 11802.90, показало, что вода, контактирующая с биоцидным покрытием в течение 57 суток, не оказывает токсического действия на дафнии.
Известно, что при хранении водопроводной воды хлор быстро улетучивается и происходит вторичное микробное обсеменение воды за счет попадающих из воздуха и быстро размножающихся микроорганизмов.
В опытах по изучению консервации водопроводной воды пластину с интерполимерным покрытием, а также контрольную пластину помещали в дехлорированную водопроводную воду.
На рисунке 4 показано, что в воде над контрольной пластиной общее микробное число (ОМЧ) быстро увеличивается и через 5 суток во много раз превышает допустимое для питьевой воды значение. Одновременно происходит увеличение ОМЧ и в смывах с поверхности контрольной пластины.
В отличие от этого, в емкости с интерполимерным покрытием микроорганизмы не были обнаружены ни в воде, ни в смывах с поверхности пластины на протяжении всего срока наблюдения 405 суток.
Известно, что адгезия микроорганизмов на поверхности является первым шагом к ее биообрастанию. Адгезия микроорганизмов быстрее происходит в застойной воде, а также на пористых поверхностях. На рисунке 5 представлены результаты демонстрационного эксперимента после 12 месяцев экспозиции. В открытые сосуды с дехлорированной водопроводной водой были помещены при комнатной температуре два бетонных блока: обработанный интерполимерным покрытием оптимального состава (19% ПГМГхл) и необработанный блок. Наши исследования показали, что интерполимерное покрытие оптимального состава препятствует адгезии микроорганизмов на пористых поверхностях (бетон) в застойной воде при температуре +20±1°С в течение 12 месяцев наблюдения.
Выводы
Биоцидное покрытие ПГМГхл/ ХСПЭ, содержащее 19% связанного ПГМГхл, в течение суток полностью обеззараживает воду, контаминированную бактериями Е. coli, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepaciae, Bacillus globigii.
Биоцидное покрытие указанного состава, нанесенное на поверхность оборудования, контактирующего с водой, предохраняет питьевую воду от вторичного микробного обсеменения и может быть использовано для консервации питьевой воды, а также для защиты оборудования от биообрастания и биокоррозии (срок наблюдения 405 суток). Биоцидное покрытие эффективно при водной нагрузке от 20 до 120 мл/см2 при температуре от +5 до +40°С (изученные пределы).
Биоцидное покрытие безопасно для использования в контакте с питьевой водой, так как выделяет в воду свободный ПГМГхл не выше предельно допустимой концентрации.
Литература
1. Воинцева И.П., Скороходова О.Н., Казеннов И.В., Валецкий П.М.// Лак для биоцидных покрытий// ЛКМ ,
1999. №12. С.3-6
2. Воинцева И.И., Скороходова О.Н., Казакова О.М., Казеннов И.В., Доброхот- ский О.Н., Борзенкова Т.Х., Боровик Р.В.// Способ пролонгированной дезинфекции помещений, оборудования, консервации и обеззараживания воды// Пат. 2329286 РФ. 2008
3. Воинцева И.И., Гембицкий П.А. //По-лигуанидины —дезинфекционные средства и полифункциональные добавки в композиционные материалы//М.: Издательство «ЛКМ-пресс». 2009г. 303с.
4. Ефимов К.М, Данилина Н.И., Овчарен- ко Е.О., Дергачева Т.В.// Сп. количественного определения концентрации ПГМГхл в воде //Пат 2252413 РФ. 2005
5. Заславская Н. В., Артеменко Н. К., Чижевская М. М., Тец. В. В.//Особенности выживаемости бактерий в микробных сообществах//Клин. микробиол. антимикроб. Химиотер.- 2000.-Т.2.-С.2-19
6. Руководство по контролю качества питье -вой воды. Т. 1-3. Гигиенические критерии и другая релевантная информация.- ВОЗ.-Женева, 1994.-255 с.
7. Скороходова, Казеннов И.В., Казакова О.М., Воинцева И.И., Доброхотский
О.П, Негрий Н.В.//Интерполимерное лакокрасочное покрытие для консервации и обеззараживания питьевой воды//
Лакокрасочная промышленность. 2009. №8. С.20-23
8. Талаева Ю.Г., Артемова Т.З.// Современные методы оценки степени потенциальной эпидемической опасности питьевого водопользования// Гигиена и санитария, 1988, №8, с.8-11
9. Федорова Л.С., Цвирова И.М., Белова A.C., Соколова Н.Ф., Воинцева И.И.// Антимикробный лак Интерцид — новая перспективная форма дезинфицирующих средств//Гигиена и санитария. 2000.№5.С.17-19
