CC BY
68
УДК 637.5:636.295.042.6:547.96:543.5
Табл. 1. Ил. 3. Библ. 12.
ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ВЕРБЛЮДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОТЕОМНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
Манюхин Я.С.1, Чернуха И.М.1, чл.-корр. РАН, Вострикова Н.Л.1, канд. техн. наук, Ковалев Л.И.2, доктор биол. наук, Ковалева М.А.2, доктор биол. наук, Шишкин С.С.2, доктор биол. наук
1 ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
2 ФИЦ Биотехнологии РАН
THE STUDY OF MUSCLE PROTEINS OF CAMEL USING PROTEOMIC TECHNOLOGIES
Manyukhin Y. S.1, Chernukha I.M.1, Vostrikova N.L.1, Kovalyov L.I.2, Kovalyova M.A.2, Shishkin S.S.2
1The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute 2Research Center of Biotechnology RAS
Ключевые слова:
верблюжатина, протеомика, мышечные белки, 2D-злектрофорез, MALDI-TOF масс-спектрометрия
Реферат
По сравнению с другими широко используемыми видами мясного сырья (говядиной, свининой, бараниной), мясо верблюда обладает рядом положительных свойств, определяющих значительный интерес к протеомному изучению ее белков. В проведенном исследовании использовали следующие протеомные технологии: двумерный электрофорез по OTarrell с изоэлектрофокусированием в амфолиновом и им-мобилиновом градиентах pH; детекцию белков на двумерных электрофореграммах (ДЭ) окрашиванием Кумасси R-250 и азотнокислым серебром; редактирование цифровых изображений ДЭ в графическом редакторе ImageMaster 2D Platinum (версия 7, «GE Healthcare», Швейцария); масс-спектроме-трическую идентификацию белков методами MALDI-TOF MS и MS/MS. В результате при анализе образцов верблюжатины были выявлены белковые фракции, которые располагались на полученных ДЭ в широком диапазоне молекулярных масс и изоэлектрических точек. При этом большинство из выявленных белков обладали молекулярными массами от 10 до 100 кДа. В целом, было зарегистрировано порядка 170 белковых фракций, которые по общему распределению на электрофореграммах (протеомному профилю) оказались сходными с профилями других видов мясного сырья. Параллельно получены масс-спектрометрические характеристики 114 белков верблюда, в частности миозиновых легких цепей (МЛЦ) и тропомиозинов. Таким образом, применение протеомного подхода к исследованию белков скелетных мышц верблюда открывает пути к решению ряда общебиологических и прикладных вопросов, связанных с особенностями жизни этого рода млекопитающих и с использованием данных животных в сельскохозяйственных целях.
Keywords:
camel meat, proteomics, muscle proteins, 2D-electrophore-sis, MALDI-TOF mass spectrometry
Summary
The camel meat compared to other widely used types of raw meat (beef, pork, mutton) has some positive properties that define the significant interest to the proteomic study of its proteins. In the carried out research were used the following proteomic technologies: two-dimensional electrophoresis by O'Farrell's method with isoelectrofocusing in the pH gradients, formed by carrier ampholytes or immobilines; protein detection upon two-dimensional electrophoregram (2DE) by staining Coomassie R-250 and nitrate silver; the editing of the 2DE images with graphic editor ImageMaster 2D Platinum, version 7 (GE Healthcare, Switzerland); the mass-spectrometry identification of proteins by MALDI-TOF MS and MS/MS methods. As a result, at the analysis of camel samples were detected protein fractions, which were located on the obtained 2DE in a wide range of molecular masses and isoelectric points. The majority of the revealed proteins possessed the molecular masses from 10 to 100 kDa. In general, there were registered about 170 protein fractions, for which the common distribution upon electrophoregram (proteomic profile) was similar to the profiles of other types of raw meat. In parallel, it was obtained mass-spectrometric characteristics of 114 camel proteins, in particular, the myosin light chains (MLC) and the tropomyosin proteins. In conclusion, the use of proteomic approach to the study of camel skeletal muscle proteins opens the ways to the solution of the number of biological and applied issues related to the peculiarities of camel life and their use for agricultural purposes.
Введение
ясо верблюда используется в традиционном питании в таких регионах, как Северная Африка, Азия и Ближний Восток. Среди ближайших соседей Российской Федерации верблюжатину в пищу употребляют жители Казахстана, а в РФ верблюжатину употребляют в пищу в Калмыкии, Бурятии, Ставропольском крае и Астраханской области. По внешнему виду, вкусу и по ряду химических характеристик мясо верблюда сопоставимо с говядиной или телятиной [5, 7, 11]. По мнению ряда авторов при изготовлении некоторых мясных продуктов, включая функциональные мясные продукты, верблюжатина может даже рассматриваться как определенная альтернатива говядине [9].
Считается, что наиболее ценные свойства верблюжатины обусловлены специфичным химическим составом этого продукта, характеризующимся невысоким содержанием холестерина, повышенным — белка и почти полным отсутствием жиров. Вместе с наличием ряда биологически активных веществ, таких как витамины групп В1, B2, PP, B9, C, A и E, эта особенность делает мясо верблюда одним из самых лучших вариантов для включения в меню диетического питания. Кроме этого, оно богато калием, фосфором, магнием и цинком и отличается повышенным содержанием природных антиоксидантов.
Хотя с начала XXI века развернулись широкие исследования мышечных белков сельскохозяйственных животных [3], протеомные исследования белков скелетных мышц верблюда до сих пор нигде не выполнялись. Так, проведенный по набору ключевых слов («camel», «proteomic», «skeletal muscle») библиометрический анализ с использованием различных поисковых систем (Google, Яндекс) и баз данных, включая наиболее известную PubMed NCBI, не выявил ни одной соответствующей публикации.
Однако в мировой литературе были найдены единичные работы, в которых на протеомной платформе исследовались другие белки верблюда [4, 6, 8, 10, 12].
Материалы и методы
Образцы длиннейшей мышцы (m. Longissimus dorsi) двугорбого верблюда (Camelus bactrianus) были получены от Алматинского технологического университета.
В качестве основных протеомных технологий применяли двумерный электрофорез (ДЭФ) по О^Фарреллу с изо-электрофокусированием в амфолиновом (IEF-PAGE) или иммобилиновом (IPG-PAGE) градиентах pH, как описано ранее [1, 2]. Детекцию белков на двумерных электрофоре-граммах проводили окрашиванием Кумасси R-250 и азотнокислым серебром.
Для идентификации белков отдельные фракции вырезали из двумерных электрофореграмм (ДЭ), измельчали и осуществляли их трипсинолиз. Далее соответствующие наборы пептидов изучали методами MALDI-TOF MS и MS/MS масс-спектрометрии на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex («Bruker», Германия) с УФ-ла-зером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да с калибровкой их по известным пикам аутолиза трипсина.
Анализ полученных масс-спектров триптических пептидов выполняли с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint («Matrix Science», США), с точностью определения массы МН+ равной 0.01 %, осуществляя поиск по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI).
Результаты и обсуждение
Фракционирование двумя модификациями ДЭФ с изоэлектрофокусированием в амфолиновом (IEF-PAGE) или иммобилиновом (IPG-PAGE) градиентах pH белковых экстрактов из образцов скелетной мышцы верблюда обеспечило получение до 170 белковых фракций при окраске Кумасси R-250, количество которых автоматически определяли на цифровых изображениях с помощью программы ImageMaster 2D Platinum (рисунок 1 А и Б). При этом общее распределение на ДЭ выявленных белковых фракций было достаточно характерным и хорошо сравнимым с аналогичным распределением мышечных белков других исследованных животных [1, 2]. Особенно наглядно сходство обнаруживалось при сравнении мажорных фракций
А -
1 * 1 1 \ ___________ i _ ——- *—1
Б
___________ V
•
Act
1 ^КТрщ КК ■ р
Рисунок 1. Результаты фракционирования белков длиннейшей мышцы (m. Longissimus dorsi) верблюда двумерным электрофорезом в двух модификациях: А — IEF-PAGE; Б — IPG-PAGE; В — протеомный профиль говядины (модификация IEF-PAGE). ДЭ окрашены Кумасси R-250
в левом нижнем участке ДЭ, где располагался характерный паттерн из ряда главных мышечных белков актина, тропомиозинов и легких цепей миозина, которые ранее были идентифицированы в цитированных выше работах. Указанные паттерны выделены пунктирными прямоугольниками на ДЭ белков верблюда (рисунок 1 А и Б) и на ДЭ белков говядины (рисунок 1 В), которая представлена в качестве примера.
При окрашивании ДЭ белков скелетной мышцы верблюда нитратом серебра, общие закономерности распределения белковых фракций сохранялись, но выявлялось существенно большее их количество — до 400 (рисунок 2 А и Б).
В целом, как видно из рисунков 1 и 2, белковые фракции, которые детектрировались при электрофоре-тическом анализе образцов скелетной мышцы верблюда, располагались в широком диапазоне (10-200 кДа] молекулярных масс (Мм) и изоэлектрических (4,6-10,0] точек (pi). При этом большинство из обнаруживаемых белков обладали Мм со значениями в диапазоне от 10 до 100 кДа.
Из сравнения ДЭ, показанных на рисунках 1 и 2, следует, что модификация IPG-PAGE обеспечивает достаточно высокое разрешение при фракционировании белков с pi > 4,5 и < 8,70, включая белки с Мм > 170 кДа. В свою очередь модификация с IEF-PAGE позволяла выявлять не только белки с pi > 4,5, но и белки с pi > 8,70.
В соответствии с традиционной протеомной стратегией 114 белковых фракций, которые были получены с помощью ДЭФ (модификация IEF-PAGE) при изучении образцов скелетных мышц верблюда, были вырезаны из соответствующих ДЭ. Для представления обобщенных данных обо всех идентифицированных фракциях было создано синтетическое изображение ДЭ длиннейших мышц верблюда, основой которого стали ДЭ, окрашенные Кумасси R-250, с детализацией отдельных областей по результатам окрашивания нитратом серебра (рисунок 3).
Проводимые исследования включали проведение триптического ограниченного гидролиза каждой указанной фракции in situ, и получение в каждом случае спектра пептидов с помощью масс-спектрометрическх методов (MALDI-TOF MS, а также в некоторых случаях и MS/MS) с последующим биоинформационном анализом, как описано выше.
Некоторые результаты выполненного масс-спектроме-трического анализа белков актомиозинового комплекса верблюда представлены в таблице 1, где названия идентифицированных белков приводятся в оригинале на английском языке.
В большинстве случаев идентификация осуществлялась по «пептидному фингерпринту» (т.е. методом MAL-DI-TOF MS) на основе данных секвенирования соответствующих генов верблюдов и предсказанной аминокислотной последовательности кодируемого геном белка. В качестве основного критерия принимали значения показателя Score более 100 (примечания к таблице 1).
С учетом ограниченности сведений о белках верблюдов отбирался наилучший результат независимо от принадлежности к любому из трех основных видов (двугорбый одомашенный — Camelus bactrianus; двугорбый дикий —
1 t
Рисунок 2. Результаты фракционирования белков длиннейшей мышцы (m. Longissimus dorsi) верблюда двумерным электрофорезом в двух модификациях: А — IEF-PAGE; Б — IPG-PAGE. ДЭ окрашены нитратом серебра
1»
\
V
Рисунок 3. Синтетическое изображение ДЭ белков m. Lon-gissimus dorsi верблюда (Camelus dromedaries). (1-114) — фракции, идентифицированные масс-спектрометриче-скими методами
Camelus ferus и одногорбый — Camelus dromedarius). Обычно и в каждом итоговом отчете, полученном с помощью программы Mascot, подчеркивалось высокое сходство нуклеотидных последовательностей соответствующего гена у всех трех видов.
Таблица 1. Результаты масс-спектрометрической идентификации белковых фракций длиннейшей мышцы верблюда
№ Наименование белка; некоторые синонимы, (ссимвол гена) Номера в Protein NCBI S / M/ C* Мм/pI (эксп.)** Мм/pI (расчет.)**
1 myosin light chain 1/3, skeletal muscle isoform X2 [Camelus ferus] (MYL1)*****(1) + Acetyl (Protein N-term) 560928822 263/18/92 14,5/4,40 16,8/4,62
2 myosin regulatory light chain 2, skeletal muscle isoform type 2-like [Camelus ferus] (MYLPF)*""(l) 560910544 296/27/83 19,0/4,50 19,2/4,91
3 myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform X1 [Camelus ferus] (MYL2) 560903535 210/25/89 19,2/4,55 18,9/4,87
4 myosin light chain 1/3, skeletal muscle isoform X2 [Camelus ferus] (MYL1)*****(1) + Acetyl (Protein N-term) 56092822 116/19/86 14,7/4,53 16,8/4,62
5 myosin regulatory light chain 2, skeletal muscle isoform type 2-like [Camelus ferus] (MYLPF) 560910544 213/28/88 12,5/5,00 19,2/4,91
6 myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform X1 [Camelus ferus] (MYL2) + 2 Phospho (ST) 560903535 228/28/90 18,5/4,90 18,9/4,87
7 myosin light chain 1/3, skeletal muscle isoform isoform X1 [Camelus ferus] (MYL1) "" 560928820 216/21/75 22,0/5,40 21,5/5,04
8 myosin light polypeptide 3 isoform 1-like protein [Camelus ferus] (CB1_000112019)**** 528769738 172/25/69 25,2/5,30 25,04/5,09
9 myosin light chain 1/3, skeletal muscle isoform isoform X1 [Camelus ferus] (MYL1) "" 560928820 286/28/92 25,0/5,40 21,5/5,04
10 tropomyosin alpha-3 chain isoform X1 [Camelus ferus] (TPM3) *****(2) 560901747 633/51/89 32,5/4,80 32,9/4,68
11 tropomyosin beta chain isoform X1 [Camelus ferus] (TPM2) **** 560923507 617/43/85 34,0/4,75 33,0/4,66
* S / M/ C - традиционные показатели идентификации, принятые в англоязычной литературе: Score - показатель соответствия или «счет очков»; Match peptides - количество совпавших пептидов; Coverage - % покрытия полной аминокислотной последовательности белка выявленными пептидами.
** Мм/pI (эксп.) - полученные оценки по результатам электрофоретической подвижности на ДЭ; Мм/pI (расчет.) - расчетные оценки, сделанные из данных об аминокислотной последовательности с учетом удаления сигнального пептида, но без учета других постсинтетических модификаций с помощью программы ExPASy Compute pI/Mw tool.
*** Предсказаны по транскриптам или генам.
*** Охарактеризованы программой Mascot по аналогии с соответствующим белком, геном или транскриптом у другого вида млекопитающих (корова, верблюд дикий); в столбце «Номера в Protein NCBI» ссылки на сведения у соответствующего животного.
*** msms - указание на подтверждающую идентификацию с помощью тандемной масс-спектрометрии (в скобках указано количество секвенирован-ных триптических пептидов).
В некоторых случаях, если показатель Score был в диапазоне более 80 при значении показателя Coverage не менее 60, результат идентификации также мог быть принят. Как правило, в подобных ситуациях и ряде других случаев подтверждающая идентификация проводилась с помощью тандемной масс-спектрометрии.
В единичных случаях расшифровка в автоматическом режиме результатов масс-спектрометрического изучения отдельных белковых фракций на полученных ДЭ не позволяла установить принадлежность ее к какому-либо из белков верблюда. При этом программа Mascot проводила идентификацию по аналогии с соответствующим белком, геном или транскриптом у другого вида млекопитающих (обычно бык или коза). Причина таких результатов идентификации связана с недостаточной изученностью мышечных белков верблюда, которая проявилась при биоинформационном анализе.
В целом, накопленный в ходе проведенных исследований значительный информационный массив данных о результатах масс-спектрометрического изучения белков скелетных мышц верблюда содержит много интересных и новых сведений. В частности, удалось выявить ряд проявлений белкового полиморфизма. Так, у 16-ти идентифи-
цированных белковых фракций были установлены разные типы посттрансляционных модификаций, среди которых оказалось ацетилирование N-концевых аминокислот [+Acetyl (Protein N-term)], фосфорилирование по остаткам серина и треонина [+ Phospho (ST)] и т.д.
Надо отметить также, что в данном исследовании были идентифицированы 18 митохондриальных белков верблюда. Этот результат представляет значительный интерес, поскольку до настоящего времени прямые сведения о таких белках практически отсутствовали. Так, поиск по ключевым словам «camel mitochondrion protein level» в базе данных Uniprot обнаружил только четыре аннотации, из которых две относились к вирусным белкам, третья (R4JCK0 Uniprot) была сделана по материалам, полученным на транскрипционном уровне, и только четвертая (P68099 Uniprot) содержала прямые сведения о митохондриальном белке - цитохроме С одногорбого верблюда (Camelus dromedarius).
Вместе с тем, поиск по ключевым словам «camel mitochondrion» в БД Uniprot выявлял 666 аннотаций, которые содержали сведения, предсказанные по результатам секвенирования генов и/или транскриптов, кодирующих митохондриальные белки верблюдов. Именно подобные
сведения использовались программой Mascot при проведении идентификации соответствующих фракций.
© КОНТАКТЫ:
Заключение
Проведенные протеомные исследования белков мышечной ткани двугорбого верблюда [Свтв/ив Ьасхгюпив] с идентификацией 114 белковых фракций существенно расширило фронт прямых исследований мышечных белков данного вида.
Как следствие, можно сделать заключение, что применение протеомного подхода к исследованиям белков скелетных мышц верблюда открывает пути к решению ряда общебиологических и прикладных вопросов, связанных с особенностями жизни этого рода млекопитающих и с использованием данных животных в сельскохозяйственных целях. В
Манюхин Ярослав Сергеевич а [email protected]
Чернуха Ирина Михайловна а [email protected]
Вострикова Наталья Леонидовна а [email protected]
Ковалев Леонид Иванович а [email protected]
Ковалева Марина Анатольевна а [email protected]
Шишкин Сергей Сергеевич а [email protected]
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: REFERENCES:
1. Ковалев, Л.И. Протеомное изучение белков в образцах свинины и выработанных из нее мясных продуктах / Л.И. Ковалев, С.С. Шишкин, М.А. Ковалева и др. // Всё о мясе. - 2013. - № 3. -С. 32-34. Kovalev, L.I. Proteomnoe izuchenie belkov v obraztsah svininyi i vyirabotannyih iz nee myasnyih produktah [Proteomic research proteins in a sample of pork meat products] / L.I. Kovalev, S.S. Shishkin, M.A. Kovaleva i dr. // Vse o myase. - 2013. - №3. - S. 32-34.
2. Манюхин, Я.С. Изучение белков конины с помощью протеомных Manyuhin, Y.S. Izuchenie belkov koninyi s pomoschyu proteomnyih технологий / Я.С. Манюхин, И.М. Чернуха, Л.И. Ковалев и др. // tehnologiy [The study of horsemeat proteins by use proteomic Все о мясе. - 2014. - № 3. - С. 20-24. technologies] / Y.S. Manyuhin, I.M. Chernuha, L.I. Kovalev i dr. // Vse
o myase. - 2014. - №3. - S. 20-24.
Shishkin, S.S. Primenenie proteomnyih tehnologiy dlya analiza my-ishechnyih belkov selskohozyaystvennyih zhivotnyih, ispolzuemyih v myasnoy promyishlennosti (obzor) [The application of proteomic technologies for the analysis of muscle proteins of farm animals used in the meat industry (Review)] / S.S. Shishkin, L.I. Kovalev, M.A. Kovaleva i dr. // Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya. -2014. - № 5. - S. 453-465.
4. Alhaider, A.A. Survey of the camel urinary proteo-me by shotgun proteomics using a multiple database search strategy / A.A. Alhaider, N. Bayoumy, E. Argo, A.G. Gader, D.A. Stead // Proteomics. - 2012. - V. 12(22). - P. 3403-3406.
Шишкин, С.С. Применение протеомных технологий для анализа мышечных белков сельскохозяйственных животных, используемых в мясной промышленности [обзор] / С.С. Шишкин, Л.И. Ковалев, М.А. Ковалева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - № 5. - С. 453-465.
