CC BY
54
УДК 577.152.3
ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СТАБИЛЬНОСТИ ПАПАИНА
В РАЗЛИЧНЫХ МИЦЕЛЛЯРНЫХ СИСТЕМАХ
Л.Ю. Филатова, Е.С. Оксенойт, К.С. Яковлева, Н.И. Иванова, Н.Л. Клячко
(кафедра химической энзимологии, кафедра химии природных соединений, кафедра коллоидной химии; e-mail: [email protected])
Изучен гидролиз PyrPheAlaPNa, катализируемый папаином в обращенных мицеллах ионо-генного ПАВ, Аэрозоля ОТ в октане, в отсутствие и в присутствии НПАВ различной природы. Обнаружено, что в обращенных мицеллах АОТ- зависимость активности папаина от степени гидратации ПАВ имеет два максимума, соответствующих проявлению активности мономерной и олигомерной формами фермента. Установлено, что добавление НПАВ различной природы к Аэрозолю ОТ в октане приводит к изменению каталитических свойств фермента, в частности к его активации в присутствии Плюроника L61. Созданы и охарактеризованы наноэмульсии из нетоксичных НПАВ и органических растворителей, лецитина и Твина в эвкалиптовом масле; методом фотон-корреляционной спектроскопии показано, что размеры частиц таких наноэмульсий находятся в диапазоне от 34 до 266 нм в зависимости от содержания воды, природы и концентрации компонентов системы, а значения коэффициента формы лежат в интервале 20-30, что предполагает наличие частиц палочкообразной формы. Важно отметить, что в таких системах, пригодных для использования в медицине и косметологии, обнаружена активность папаина.
Ключевые слова: папаин, обращенные мицеллы, микроэмульсии, наноэмулъсии, АОТ, НПАВ, лецитин, эвкалиптовое масло.
Список сокращений: PyrPheAlaPNa - паранитроанилин пироглутамил-фенилаланил-аланина; АОТ, Аэрозоль ОТ - натриевая соль ди-(2-этил)-гексилового эфира сульфо-янтарной кислоты; Wo - степень гидратации; ДМСО - диметилсульфоксид; ЭДТА -этилендиаминтетраацетат; ДТТ - дитиотреитол; V - скорость ферментативной реакции, отн.ед./мин; Кин - константа инактивации, мин ; ^акс - максимальная скорость реакции, отн. ед./мин; КМ - константа Михаэлиса, мМ; VH3 - скорость реакции в изолированной мицелле, отн. ед./мин.
Введение
Папани (КФ 3.4.22.2) - один из протеолитических ферментов, относящихся к классу гидролаз и подклассу цистеиновык протеаз (гидролиз белков, пептидов, амидов, сложнык эфиров). Его молекула состоит из одной полипептидной цепи, содержит 212 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 23,5 кДа. Интерес к этому ферменту в последние годы связан с возможностями его использования в медицине (подавление воспалительных процессов) и косметологии (компонент средств для депиляции) [1].
Включение ферментов в обратные наноэмульсии (микроэмульсии, обращенные мицеллы) типа вода-масло является одним из эффективных способов регуляции каталитической эффективности и стабильности биокатализаторов [2-4]. Литературныгс данныгс о
функционировании папаина в мицеллярных системах немного. Авторы работ [1, 5] исследовали гидролиз пара-нитроанилина ^а-бензоил-Ь-аргинина, катализируемый папаином в обращенных мицеллах АОТ в октане, а также влияние добавок неионогенных ПАВ (Твин 20 и Твин 80) на этот процесс. Однако изучению оптимальных условий (концентрация ПАВ, степень гидратации, рН, состав буфера), при которых проявляется каталитическая активность папаина, в этих работах уделено мало внимания.
Цель данной работы - вышвить оптимальные условия функционирования папаина в системах обращенных мицелл ПАВ различной природы, в частности при модификации обращенных мицелл ионогенного АОТ в октане молекулами неионогенного ПАВ (НПАВ). В качестве исходной мы выбрали хорошо изученную тройную систему АОТ-вода-октан, по-
скольку она имеет обширную область существования обращенных мицелл (обратных микроэмульсий) с узким распределением частиц по размерам [6, 7], что позволяет четко определить оптимальные условия функционирования различных ферментов, как мономерных, так и олигомерных [8-10]. Кроме того, описаны примеры использования АОТ для медицинских целей, например, в работе [11] изучено включение антибиотиков тетрациклина и доксорубицина в обращенные мицеллы, построенные из молекул АОТ.
Экспериментальная часть
Материалы
Для приготовления растворов обращенных мицелл (наноэмульсий) использовали АОТ ("Sigma", США) без дополнительной очистки; н-октан, "ч.д.а." ("Реа-хим", Россия); НПАВ (Плюроники L61, L101, F108, L64, Бриджи 30, 52, 96, Спаны 20, 65 - все фирмы "Serva"), лецитин (ООО "Протеин", Россия), Твин 80 и Твин 20 ("FeraK", США), эвкалиптовое масло ("Мосхимфармпрепараты", Россия).
Папаин ("Sigma", США) растворяли в водном буферном растворе, содержащем фосфат натрия, "ос.ч." ("Реахим", Россия); ЭДТА и ДТТ ("Sigma", США).
Субстрат PyrPheA№Na был синтезирован по методике [12]; в работе использовали его раствор в диметилсульфоксиде, ДМСО ("Sigma", США). Для приготовления растворов использовали дистиллированную воду.
Приготовление растворов
Для приготовления раствора 0,1 М АОТ в октане к 100 мл октана добавляли 4,46 г Аэрозоля ОТ. Полученный раствор перемешивали не менее 12 ч при комнатной температуре до полного растворения ПАВ. Для приготовления раствора 0,1 М АОТ/0,6% Плюроника L61 в октане к 100 мл 0,1 М АОТ добавляли 1,2 г Плюроника L61. Полученную смесь перемешивали не менее 12 ч при комнатной температуре до полного растворения ПАВ. Для приготовления раствора фермента к 1 мл буфера, содержащего 20 мМ фосфата натрия, 0,1-5,0 мМ ЭДТА (этиленди-аминтетраацетата), 3-10 мМ ДТТ (дитиотреитола), добавляли 5 мг папаина. Для приготовления раствора субстрата 7,8 мг PyrPheA№Na растворяли в 1 мл
дмсо.
Для включения фермента в обращенные мицеллы с заданной степенью гидратации (w0 = [Н20]/[ПАВ]) к
1 мл мицеллярного 0,05-0,30 М раствора АОТ в октане добавляли 10-200 мкл водного буферного раствора (рН 7,5), содержащего 20 мМ фосфата натрия и переменные количества ЭДТА и ДТТ. Полученную смесь энергично встряхивали до образования гомогенного оптически прозрачного раствора. Затем добавляли раствор фермента (5 мкл, 5 мг/мл) в том же буфере и снова встряхивали до образования гомогенного оптически прозрачного раствора. Для определения каталитической активности фермента, включенного в обращенные мицеллы, добавляли рассчитанное количество раствора субстрата в ДМСО (2 мкл, 0,1 М), встряхивали, следя за тем, чтобы раствор оставался прозрачным.
Спектрофотометрические измерения
Ход реакции контролировали спектрофотометричес-ки, используя спектрофотометр "Ultrospec 2100" с термостатируемым кюветным отделением, при 25°С. За реакцией гидролиза следили по накоплению продукта реакции (шра-нитроанилина) при длине волны поглощения X = 400 нм в кварцевой кювете объемом 1 мл и длиной оптического пути 10 мм.
Определение размеров частиц
Для определения размеров частиц в обратных микроэмульсиях применяли метод динамического рассеяния света. Измерения проводили в неполяризованном свете с помощью фотонного корреляционного спектрометра, состоящего из Не-№-лазера с длиной волны падающего излучения 632,8 нм, гониометра, 72-ка-нального коррелометра "ФотоКорр-М" и компьютера. Использовали цилиндрические кварцевые кюветы с внутренним диаметром 1 см и объемом 5 см3. Образцы очищали от пыли, пропуская через фильтры фирмы "ЫИИроге" (0,45 нм) непосредственно в измерительную кювету.
Угол рассеяния при измерении составлял 90°. Анализ автокорреляционной функции флуктуации интенсивности производили методом кумулянтов [13] и регуляризации [14]. Значения среднего гидродинамического радиуса частиц вычисляли по уравнению Стокса-Эйнштейна [15]
Як = кТ/6Б0пц, (1)
где п - вязкость растворителя, Б0 - коэффициент диффузии рассеивающих частиц, к - постоянная Больцмана.
С х е м а
Измерение вязкости
Для измерения вязкости и определения формы частиц обращенных мицелл использовали капиллярный вискозиметр ВПЖ-24. Коэффициент формы частиц рассчитывали по уравнению Эйнштейна [15]
(П о - П )/П о = к Ф >
(2)
где п - вязкость раствора, п0 - вязкость растворителя, к - коэффициент формы, ф - объемная доля частиц дисперсной фазы.
Результаты и их обсуждение
Гидролиз РугРИеЛ1аРКа, катализируемый папаи-ном, представлен на схеме. Следует отметить, что катализ многими ферментами в обращенных мицеллах АОТ в октане подчиняется схеме Михаэлиса-Ментен [16]: зависимость скорости реакции от концентрации фермента (Е0) при 50 >> Е0 имеет линейный вид, а от концентрации субстрата (50) - вид кривой с насыщением в соответствии с гиперболическим видом уравнения:
У = Умакс 5/(5 + Км),
характеризуется наличием двух оптимумов каталитической активности: при = 13 и = 25. Первый из них отвечает тому случаю, когда размер внутренней полости мицеллы практически равен размеру молекулы фермента, что обеспечивает поддержание активной конформации молекулы папаина (принцип геометрического соответствия) [8]. Изменяя степень гидратации ПАВ, можно варьировать в широком диапазоне размеры внутренней полости обращенных мицелл. Это означает, что если белок (фермент) имеет тенденцию к образованию надмолекулярных ассоциа-тов и способен функционировать в виде таких ассо-циатов, то их образование и функционирование будет отмечаться появлением дополнительных оптимумов на зависимости каталитической активности фермента от степени гидратации [8-9, 16-17]. На основании уравнений
г = 0,7 Ъ<Й [8, 16],
Гм = 1,5 ^0 + 4 [6, 7],
(4)
(5)
(3)
где Умакс - максимальная скорость реакции, равная ккат Е0; ккат - число оборотов фермента, т.е. число молекул субстрата, превращаемых реакционным центром молекулы фермента в единицу времени, Е0 -концентрация фермента, Км - константа Михаэлиса; 5 - концентрация субстрата.
Катализ папаином в обращенных мицеллах 0,1 М АОТ в октане подчиняется тем же закономерностям. Нами выявлена линейная зависимость начальной скорости реакции гидролиза РугРИеЛ1аР№ от концентрации фермента и зависимость с насыщением от концентрации субстрата.
Зависимость каталитической активности (У/[Е], где У - скорость химической реакции при данной концентрации фермента, [Е] - концентрация фермента) папаина от степени гидратации ПАВ (^0) для обращенных мицелл 0,1 М АОТ в октане приведена на рис. 1. На рисунке показано, что данная зависимость
Рис. 1. Зависимость каталитической активности папаина от степени гидратации ПАВ: 1 - 0,1 М АОТ в октане; 2 - 0,1 М АОТ/ 0,6% Плюроника Ь61 в октане. Концентрация фермента в кювете 1x10-6 М, субстрата - 2х10-4 М
где гБ и гМ - радиусы молекулы белка и внутренней полости мицеллы (нм или А), М - молекулярная масса белка (кДа), - степень гидратации, можно заключить, что гБ белка с молекулярной массой 23,5 кДа будет равен 20 А, мицелла с таким радиусом создается при степени гидратации, равной 11. При = 24 радиус внутренней полости мицеллы увеличится до 40 А, т.е. можно предположить, что появление второго оптимума на кривой зависимости каталитической активности папаина от степени гидратации отражает функционирование фермента в виде димера. Более точную информацию об олигомерном составе фермента, функционирующего при степени гидратации 25, можно будет получить по данным скоростной седиментации [9-10, 16].
Для выяснения влияния добавок НПАВ на каталитическую активность папаина к раствору 0,1 М АОТ в октане добавляли от 0,1 до 10% (от молярной концентрации) НПАВ (Плюроники Ь61, Ы01, Б108, Ь64, Бриджи 30, 52, 96, Спаны 20, 65, экспериментальные данные не приведены). Эти неионогенные ПАВ нетоксичны и биоразлагаемы, поэтому могут быть использованы в препаратах медицинского и косметического назначения. Модифицируя ими систему АОТ-вода-октан, мы как бы «приближаем» состав данных микроэмульсий к составу препаратов, используемых на практике. Увеличение активности папаина наблюдалось только при использовании Плюроника Ь61 (рис. 1), причем наибольший эффект достигался при содержании данного НПАВ 0,6% по молям. Поэтому именно эту систему мы выбрали в качестве объекта для изучения каталитических свойств папаина и их сравнения со свойствами данного фермента в обращенных мицеллах индивидуального АОТ в октане.
Сразу же следует заметить, что при добавлении 0,6% Плюроника Ь61 к 0,1 М АОТ в октане зависимость активности фермента от степени гидратации имеет колоколообразный вид с одним максимумом при w0 = 20 (это может быть связано с тем, что данная система характеризуется более широким, чем АОТ, распределением частиц по размерам).
При изучении зависимости активности фермента от рН было установлено, что оптимальным является значение рН 7,5. Это относится как к обращенным мицеллам АОТ в октане = 13 и w0 = 25), так и к мицеллам АОТ/0,6% Плюроника Ь61 = 20). Следует отметить, что авторы работ [1, 5] получили такую же величину оптимального значения рН. Поскольку тиольная группа имеет высокую способность к окислению, реакции с участием папаина проводят в присутствии активаторов тиол-дисульфидного обмена. В роли активаторов могут выступать различные низкомолекулярные тиолы, цианиды и ряд других веществ, обладающих свойствами восстановителей, например цистеин, глютатион, тиогликолевая кислота, тиосульфат и боргидрид натрия [18-19].
Для получения максимальной активности папаина необходимо одновременное присутствие не только восстановителя, но и веществ, способных связывать ионы металлов [19]. Это можно объяснить тем, что тиольная группа цистеина в активном центре фермента является эффективным комплексообразователем ионов металлов, примеси которых могут попасть в раствор фермента с компонентами буфера и будут способствовать инактивации фермента. В качестве хелатирующе-го соединения часто используется ЭДТА.
В данной работе в качестве активаторов мы взяли ДТТ и ЭДТА. С целью выявления оптимальных условий функционирования данного фермента в системе
5
а
Рис. 2. Зависимость активности папаина от концентрации ЭДТА и ДТТ в буферном растворе, содержащем фермент (помимо этих компонентов буфер содержал 20 мМ фосфата натрия, рН 7,5): а - в 0,1 М АОТ в октане при w0 = 25; б - в 0,1 М АОТ/0,6% Плюроника Ь61 в октане при w0 = 20. Концентрация фермента в кювете - 1х 10-6 М,
субстрата - 2х 10-4 М
обращенных мицелл 0,1 М АОТ в октане концентрации активаторов в водной фазе варьировались в широких пределах: от 0,1 до 5,0 мМ (ЭДТА) и от 1 до 10 мМ (ДТТ). Дальнейшее увеличение концентраций ЭДТА (больше 5 мМ) и ДТТ (больше 10 мМ) невозможно, так как образуются мутные растворы. Как показано на рис. 2, а, каталитическая активность папаина в обращенных мицеллах АОТ пропорциональна концентрации активаторов. По-видимому, это связано с тем, что подобные соединения расходуются также на окисление различных примесей, содержащихся в ПАВ.
Иная картина наблюдается в системе АОТ/0,6% Плюроника Ь61 в октане: здесь оптимум каталитической активности наблюдается при достаточно низких концентрациях активаторов 0,1 мМ ЭДТА и 3 мМ ДТТ (рис. 2, б) при прочих равных условиях. Это связано с тем, что мицеллы с НПАВ менее устойчивы к разрушающему действию на них этилен-диаминтетраацетата и дитиотреитола. В связи с этим для сравнения свойств папаина в мицеллах АОТ и в мицеллах АОТ/0,6 % Плюроника Ь61 в октане был подобран следующий состав добавляе-
Т а б л и ц а 1
Кинетические параметры в оптимумах каталитической активности папаина, экстраполированные к одной изолированной мицелле, и термодинамические значения констант инактивации для различных систем. Концентрация фермента в кювете 1х10-6 М, субстрата - 2х10-4 М
Система ^0 Уиз, у из, отн. ед./мин Уиз/[Е], мин-1 Кин, мин-1
0,1 М АОТ в октане 13 2х10-3 500 1,2х10-2
25 2,3х10-3 575 7х10-3
М АОТ/0,6% Плюроника Ь61 в октане 20 1,7х10-3 425 1х10-1
мого буфера: 20 мМ фосфат; 0,1 мМ ЭДТА; 3 мМ ДТТ при рН 7,5.
Варьирование концентрации ПАВ при постоянной степени гидратации приводит к изменению концентрации мицелл в системе, размеры мицелл при этом не меняются. При концентрации ПАВ, стремящейся к нулю, мы получаем "истинную" активность фермента, проявляемую им в единственной мицелле. Зависимость активности фермента от концентрации ПАВ является тестом на мембраноактивность фермента. Активность мембранонезависимых ферментов не зависит и от концентрации ПАВ [16].
Если построить зависимость обратной скорости реакции гидролиза пептида, катализируемого папаи-ном, от концентрации ПАВ, то можно получить скорость реакции в одной изолированной мицелле (Уиз)
Рис. 3. Зависимость каталитической активности папаина от концентрации ПАВ (экстраполяция к активности фермента в изолированной мицелле) при постоянной (оптимальной) степени гидратации: 1 - АОТ в октане (^0 = 13), 2 - АОТ/0,6% Плюроника Ь61 в октане (^0 = 20). Концентрация фермента в кювете 1х 10-6 М, субстрата - 2х10-4 М
Рис. 4. Зависимость остаточной активности папаина при его инкубации в системах: 1 - 0,1 М АОТ в октане, = 25, 2 - 0,1 М АОТ в октане (^0 = 13), 3 - 0,1 М АОТ/0,6% Плюроника Ь61 в октане (^0 = 25). Концентрация фермента в кювете 1 х 10-6 М, субстрата - 2х10-4 М
по отрезку, отсекаемому на оси ординат (рис. 3). Результаты расчета кинетических параметров (Уиз и V /[£]) для изолированной мицеллы приведены в табл. 1. Видно, что наилучшие параметры (наибольшие значения Гиз и Гиз/[£]) наблюдаются для системы АОТ-вода-октан при w0 = 25.
Для изучения стабильности папаина в системах обращенных мицелл была построена зависимость логарифма остаточной активности фермента от времени его инкубации. Как показано на рис. 4, зависимость имеет вид прямой линии для обеих систем, что свидетельствует о том, что инактивация фермента подчиняется кинетике первого порядка, т.е. основной вклад в этот процесс вносит денатурация (и/или кон-формационные изменения в молекуле фермента).
Константа скорости инактивации может быть вычислена по тангенсу угла наклона зависимости. На рис. 4 видно, что добавление Плюроника Ь61 вносит существенный вклад в инактивацию фермента. Это связано, вероятно, с усилением мембранотропных свойств (влияние столкновений мицелл на активность и стабильность фермента).
Далее в работе была предпринята попытка получения наноэмульсий, более «близких» по составу к препаратам медицинского назначения, чем исследованные ранее Аэрозоль ОТ в октане и смесь Аэрозоль ОТ/Плюроник Ь61 в октане. Кроме того, ис-
следовалась активность папаина в полученных композициях.
Проведено исследование максимальной солюбили-зационной емкости систем, содержащих 1-9% лецитина и 1-4% Твина 20 (или Твина 80) в эвкалиптовом масле. Значение этой величины составило 0,5-1,5% буфера (20 мМ фосфат натрия, 0,1 мМ ЭДТА, 3 мМ ДТТ рН 7,6) в данной области концентраций лецитина и Твинов. Методом фотон-корреляционной спектроскопии установлено, что размеры частиц в таких системах меняются в пределах от 34 до 266 нм в зависимости от содержания воды, природы и концентрации компонентов системы, а значения коэффициента формы лежат в интервале 20-30. Таким образом, в данных наноэмульсиях присутствуют достаточно крупные частицы палочкообразной формы. Результаты этих исследований приведены в табл. 2. Зависимость каталитической активности папаина от содержания буферного раствора имеет колоколооб-разную форму с максимумом, соответствующим равенству размеров мицелл и молекул фермента (рис. 5). Значения активностей папаина в смешанных мицеллах лецитин-Твин 20 более высокие, чем в мицеллах АОТ. Диапазон концентраций субстрата, необходимых для измерений, также более широкий, что позволяет оценить такие параметры, как Гмакс и КМ (табл. 2) Изучение стабильности фермента в
Т а б л и ц а 2
Характеристика размеров и формы смешанных мицелл лецитина и Твинов 20 и 80 в эвкалиптовом масле и кинетические параметры функционирования папаина. Концентрация фермента в кювете 1х10-6 М, субстрата - 2х10-4 М
Содержание ПАВ Содержание буферного раствора, % Размер частиц, нм Коэффициент формы Кт, мМ ^^максх10 , отн. ед/мин
метод кумулянтов метод регуляризации
Лецитин (5%) 0,5 206 266 21 0,07 24,2
Твин 20 (1,5%) 0,7 262 266 23 - -
Лецитин (9%) 0,5 123 133 25 0,15 13,8
Твин 20 (1%) 0,7 150 133 24 - -
Лецитин (5%) 0,5 34 67 24 - -
Твин 80 (4%) 1 35 44 22 - -
Твин 80 (4%) 1,5 239 266 27 - -
Рис. 5. Зависимость каталитической активности папаина от содержания буфера (20 мМ фосфат натрия, 0,1 мМ ЭДТА, 3мМ ДТТ, рН 7,5) в смешанных обращенных мицеллах лецитина и Твина 20 в эвкалиптовом масле: 1 - 5% лецитина, 1% Твина 20, 2 - 5% лецитина, 1,5% Твина 20. Концентрация фермента в кювете 1х10-6 М, субстрата - 2х10-4 М
данных эмульсионных композициях, выявление рН оптимумов каталитической активности папаина, выяснение влияния концентрации ПАВ на активность фермента будет являться предметом дальнейших исследований.
Выводы
В данной работе проведено исследование влияния добавок различных НПАВ на каталитическую активность папаина в обращенных мицеллах АОТ в октане. Установлено, что добавление Плюроника
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. VicenetL. C., Aires-Barros R., Empis J.M.A // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1994. 60. P. 291.
2. Klyachko N.L., Levashov A.V. // Curr. Opin. Colloid Int. Sci. 2003. 8. P. 179.
3. Sarker D.K. // Curr. Drug Deliv. 2005. 2. P. 319.
4. BiasuttiM.A., Abuin E.B., Silber J.J., CorreaN.M., Lissi E.A. / / Adv. Colloid Interface Sci. 2008. 136 (1-2). P. 1.
5. Fan Ke-Ke, Ouyang Pingkai, WuXijun, Lu Zuhong // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2001. 76. P. 27.
6. EickeH.-F., Rehak J. // Helvetiva Chim. Acta. 1976. 59. P. 2883.
7. Kohling R., Woenckhaus J., Klyachko N.L., Winter R. // Langmuir. 2002. 18. P. 8626.
8. Клячко Н.Л., Пшежецкий A.B., Кабанов A.B., Вакула С.В., Мартинек К., Левашов A.B. // Биол. мембраны. 1990. 7. C. 467.
Ь61 увеличивает каталитическую активность данного фермента. Выявлены оптимумы функционирования и сравнены активности папаина в мицеллах 0,1 М АОТ в октане и в этой же системе, содержащей 0,6% Плюроника Ь61. Кроме того, получены и охарактеризованы микроэмульсионные системы, содержащие нетоксичные НПАВ (лецитин и Тви-ны) в эвкалиптовом масле. Показано, что подобные наноэмульсии являются более благоприятной средой для ферментативного катализа, чем система АОТ-вода-октан.
9. Kabanov A.V., Klyachko N.L., Nametkin S.N., Merker S., Zaroza A. V., Bunik V.I., Ivanov M. V., Levashov A.V. // Protein Eng. 1991. 4. P. 1009.
10. Klyachko N.L., Shchedrina V.A., Efimov A. V., Kazakov S. V., Gazaryan I.G., Kristal B.S., Brown A.M. // J.Biol.Chem. 280. P. 16106.
11. Chavanpatil M.D., Khdair A., Panyam J. // Pharmaceutical Res. 24. P. 803.
12. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N., Vasil'evaL.I., Krest'anova I.N., Khodova O.M., Bartoshevitch Y.E. // Int. J. Biochem. 1986. 18. P. 369.
13. Koppel D.E. // J. Chem. Phys. 1972. 57. P. 4814.
14. Stanley M.E. // Introduction to Phase Transition and Critical phenomena. London: Oxford University Press. 1971. P. 40.
15. Hiemenz Р. // Principles of Colloid and Surface Chemistry. N.Y.; M.; Dekker. 1986. P. 86.
16. Левашов А. В., Клячко H. Л. // Изв. АН. Сер. хим. 2001. № 10. С. 1638.
17. LaithyE. I. // AAPS Pharm. Sci. Tech. 2003. 4. article 11. P. 567.
18. Егорова E. M., Ревина А. А., Ростовщикова Т. H., Киселева О. И. // Вести. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2001. 42. С. 322.
19. Kurganov B.I., Chebotareva N.A. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1999. 47. P. 319.
Поступила в редакцию 25.09.08
INVESTIGATION OF ACTIVITY AND STABILITY OF PAPAIN IN DIFFERENT MICELLAR SYSTEMS
L.Yu. Filatova, Ye.S. Oxenoyt, K.S. Yakovleva, N.I. Ivanova, N.L. Klyachko
(Division of Chemical Enzymology, Division of Chemistry of Natural Compounds)
Research of hydrolysis of substrate PyrPheAlaPNa by papain in reverse micelles of Aerosol OT in octane was made. Optimal conditions of the enzyme functioning in this system were found. It was established, that in reverse micelles of AOT in octane dependence of activity of papain on hydration number had two optimums, which corresponded to activity of monomolecular and oligomeric papain. As found, addition of nonionic surfactants to Aerosol OT in octane led to change of catalytic properties of the enzyme. As applied aspect of work microemulsions consisting of nontoxic.
Key words: Papain, reverse micelles, Aerosol OT, Pluronic L61, lecithin, Tween-20.
Сведения об авторах: Филатова Любовь Юрьевна - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ ([email protected]); Яковлева Ксения Сергеевна — студентка 5 курса химического факультета МГУ ([email protected]); Оксенойт Елена Семеновна — науч. сотр. лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ, канд. хим. наук ([email protected]); Иванова Нина Ивановна — доцент кафедры коллоидной химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук; Клячко Наталья Львовна - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук ([email protected]. msu.ru).
