CC BY
40
Якупов Т.Р., Хазипов Н.З., Коксин В.П.* ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВЛКРС В ИММУНОХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ С АНТИГЕНАМИ ВИЧ
Казанская государственная академия ветеринарной медицины, г.Казань Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями М3 Республики Татарстан, г.Казань*
Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) - Bovine leukemia virus (BLV) относится к семейству Retroviridae. Вместе с вирусами Т- клеточного лейкоза человека (HTLV - 1 и 2), ВЛКРС относится к особой группе, обозначенной типом Е.
В структуре ВЛКРС обнаружено 6 основных белков с М.м. от 10 до 51 Кд. Четыре негликолизированных белка (р 10, р12, р 15, р24) составляют сердцевину вириона, причем белок р24 присутствует в наибольшем количестве. Два крупных белка являются гликопротеидами. Один из них (gp51) расположен на поверхности вириона, другой (gp30) -трансмембранный белок (Schmidt T. еіаі., 1984). Оболочка ВЛКРС содержит два основных белка: gp60 (гликопротеин поверхности вириона) и р30 (мембранный белок) (Schulz A.M. et. al., 1984).
ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью. В организме крупного рогатого скота антитела вырабатываются преимущественно на структурные белки вириона. У зараженных животных в крови циркулируют антитела к р24, р15, р12, р10, gp30 и gр51. Однако диагностическое значение имеют антитела против gр51 и р24 ВЛКРС. В настоящее время большинство серологических реакций, применяемых в диагностике лейкоза крупного рогатого скота, направлены на выявление анти^51 антител.
В ряде работ как отечественных, так и зарубежных исследователей отмечается генетическое и антигенное родство ВЛКРС с вирусами Т-клеточного лейкоза человека (HTLV-1 и 2). Известно, что пробы сыворотки крови крупного рогатого скота с антителами против р12, р15 и р24 ВЛКРС дают перекрестную реакцию в иммуноблоте с р24 HTLV-1 (Mariujama K. et al. ,1989). Установлена статистически достоверная гомология в первичной структуре между р24 ВЛКРС и р24 вируса Т-клеточного лейкоза человека (Москалин Р. и др., 1996). Обнаружена также высокая гомология трансмембранного белка р30 с таковыми ретровирусов В, С типов и HTLV-1 и 2. Однако наиболее близок к ретровирусам человека по генетической структуре провирус ВЛКРС (Сюрин В.Н. и др., 1998).
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) является ретровирусом, значительно отличающимся от вируса Т-клеточного лейкоза человека. По сравнению с HTLV-1 геном ВИЧ содержит несколько дополнительных генов. Считают, что главный белок сердцевины ВИЧ - р24 не имеет аналогов у других ретровирусов (Тарантул В.З., 2005). Установлено, что ВИЧ стоит ближе всего к лентивирусам, вызывающим тяжелые хронические инфекции у копытных животных.
Таблица
№ проб Результаты ИФА Результаты иммуноблота
Титры АТ на gp51 ВЛКРС Титры АТ регирующих с АГ ВИЧ р40 р55 р24 р34
1 1 9 1 8 +
2 1 9 1 8 +
3 1 9 1 64 +
4 1 27 1 32 + +
5 1 27 1 8 +
6 1 27 1 16 +
7 1 27 1 256 + +
8 1 81 1 64 + +
9 1 81 1 2 + +
10 1 243 1 64 + + +
11 1 729 1 64 + + +
12 1 729 1 256 + +
13 1 729 1 64 + + + +
14 1 729 1 256 + + +
15 1 729 1 64 + +
16 1 729 1 64 + +
Считают также, что ВЛКРС в большей степени, чем другие вирусы имеет генетические и биологические сходства с ВИЧ. Это сходство подтверждено и по характеристике образующегося синцития (I.Chi, 1985).
Учитывая высокую изменчивость и близко генетическое родство ретровирусов изучение антигенного родства ВЛКРС с вирусом иммунодефицита человека представляет научно-практический интерес.
Целью наших исследований являлось определение активности и спектра антител против ВЛКРС сывороток крови крупного рогатого скота в иммунохимических реакциях с антигенами ВИЧ.
В исследованиях были использованы пробы сывороток крови полученные от коров с положительной реакцией на лейкоз по реакции иммунной диффузии. Иммуноферментный анализ исследуемых проб сывороток крови проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС)» производства НПО «Нарвак». Всего исследовано 249 проб сывороток крови. Все пробы в иммуноферментном анализе показали положительные реакции на лейкоз. Учет результатов реакции проводили согласно инструкции диагностического набора.
На следующем этапе работы нами проведены исследования по изучению активности противолейкозных антител в пробах сывороток крови коров к антигенам ВИЧ-инфекции человека. Для этого методом случайной выборки отобрали 25 проб сыворотки крови коров. Иммуноферментный анализ проводили с использованием «Тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусам иммунодефицита человека 1 и 2 типов» производства ЗАО «Вектор-бест». 16 проб сывороток крови крупного рогатого скота показали положительную, а 9 проб - отрицательную реакции в тест-системе ИФА к ВИЧ. У положительно реагирующих сывороток титры антител к антигенам ВИЧ были в пределах 1:2 - 1:256. Титры специфических антител на gp51 ВЛКРС в ИФА на лейкоз этих же проб составляли от 1:9 до 1:729. На основании полученных результатов по ИФА на лейкоз сыворотки крови разделили на три группы: 1) с титрами специфических антител 1:9 - слабореагирующие, 2) среднереагирующие, титры в пределах 1:27 - 1:81 и 3) сильнореагирующие, с титрами антител - 1:243 - 1:729
Исходя из полученных результатов можно сказать, что между титрами антител против gр51 ВЛКРС и титрами антител реагирующих белками ВИЧ, в сыворотках крови коров больных лейкозом, закономерной взаимосвязи не просматривается. Более того, некоторые пробы из первой группы (с низкими титрами противолейкозных антител) обнаруживают более высокие титры антител в ИФА на ВИЧ антигены.
Изучение спектра антител в исследуемых пробах сывороток крови коров проводили методом иммуноблоттинга. Иммуноблоттинг проводили на тест-системе “New LAV BLOT” фирмы Bio Rad (США). Тест основан на принципе непрямого иммуноферментного анализа, выполняемого на нитроцеллюлозной мембране-стрипе, содержащей как структурные, так и неструктурные белки ВИЧ. Денситометрию
результатов иммуноблоттинга проводили в отраженном свете на сканере “Sharp Ix-330”. В анализе денситограмм была использована программа “Image
Master ID Prime” фирмы “Pharmacia Biotech”. (Таблица)
Как видно из таблицы во всех пробах сыворотки
крови обнаружены антитела реагирующие с белком предшественником структурных белков кора ВИЧ - р40.
В шести из семи наиболее сероактивных при ИФА на лейкоз пробах (№№ 10 - 16) обнаружены антитела к белку предшественнику ядерных белков гена gag - р55. Кроме того, в пятерых из них (№№ 10, 11, 13, 14, 16) содержатся антитела реагирующие с основным белком кора ВИЧ - р24. В одном случае (проба №13) выявлены антитела реагирующие с р34 ВИЧ.
Из проб второй группы (среднереагирующие в ИФА на лейкоз) в четырех случаях также обнаруживаются антитела реагирующие с р24 и ни одна проба не показывает положительные реакции с белками р55 и р34 ВИЧ. В пробах сывороток крови коров из первой группы детектированы только антитела реагирующие с белком р40 ВИЧ. На основании результатов исследований можно сказать, что в организме больных лейкозом коров происходит образование перекрестно-реагирующих антител с белками ВИЧ. Однако, следует отметить, что четкой зависимости между активностью противолейкозных антител в тест-системе ИФА на ВИЧ и спектром этих антител в иммуноблоте ВИЧ не отмечалось. Так, в пробах №3 и №13 титры антител реагирующих с антигенами ВИЧ одинаковые - 1:64. Однако по спектру антител они резко отличаются.
Обобщая полученные результаты можно сделать вывод о том, что, во- первых, увеличение титра антител против gр51 ВЛКРС в крови у больных лейкозом коров не всегда сопровождается увеличением титра противолейкозных антител к антигенам ВИЧ. Во-вторых, на разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител меняется. В третьих, антитела против антигенов ВЛКРС перекрестно реагируют с антигенами как неструктурных (р55, Р40), так и структурного (р24/25) белков гена gag ВИЧ в иммунохимической реакции.
