Изучение адсорбции на сорбенте СВ-1 ферментов-антиоксидантов, полученных из клубней картофеля Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 54-414

Т.В. Алыкова, Н.М. Алыков, Д.Р. Асанова

ИЗУЧЕНИЕ АДСОРБЦИИ НА СОРБЕНТЕ СВ-1 ФЕРМЕНТОВ-АНТИОКСИДАНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

(Астраханский государственный университет) e-mail: [email protected]

Изучена адсорбция на сорбенте СВ-1 ферментов-антиоксидантов, полученных из клубней картофеля. Сорбент СВ-1 получен путем нехимической переработки опок Астраханской области. Показана возможность практического применения продукта сорб-ционного концентрирования ферментов-антиоксидантов для обеспечения безопасности жизнедеятельности.

Ключевые слова: энтеросорбент, ферменты-антиоксиданты, опоки

Фармакологическая коррекция оксидатив-ного стресса осуществляется с помощью биологически-активных веществ, в частности, антиокси-дантов. Растворимые или нерастворимые антиок-сиданты - это необходимые вещества для защиты человека и животных при природных и техногенных катастрофах, военных действиях и в результате террористических актов.

Одним из способов защиты населения от различных оксидантов является использование энтеросорбентов, в состав которых входят и мощные биологические антиоксиданты.

Энтеросорбенты - антиоксиданты могут быть использованы для защиты желудочно-кишечного тракта человека и животных от самых разнообразных окислителей. Таковыми могут быть пероксид водорода, пероксиды металлов, гипероксиды, образующиеся при функционировании промышленных предприятий, работе транспорта с тепловыми двигателями, а также пороховые газы и газы, образующиеся при применении взрывчатых веществ.

Известно, что в водной вытяжке из сырого картофеля содержится значительное количество антиоксидантов, таких как пероксидаза, каталаза и витамин С. Адсорбцией этих антиоксидантов на сорбенте СВ-1, получаемом по специальной технологии из опок Астраханской области [1-3], создан энтеросорбент, названный нами СВ-1-АО.

В данной работе проведены исследования, целью которых было изучение адсорбции фермен-тов-антиоксидантов на сорбенте СВ-1 [4].

Содержание ферментов-антиоксидантов в клубнях картофеля

Нами было изучено содержание антиоксидантов с использованием метода А. Н. Баха и А.И. Опарина [5] в клубнях картофеля, выращенного в Астраханской области в летне-осенний период.

Содержание ферментов-антиоксидантов в клубнях картофеля непостоянно и зависит от кли-

матических условий, времени посадки и времени сбора урожая.

Порядок выполнение работы. Сырой картофель (2 г) растирали с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2-3 см3 воды. Для уменьшения кислой реакции добавляли на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносили в мерную колбу и доводили объем раствора водой до 100 см3. Через 30 мин в коническую колбу емкостью 200 см3 вносили 25 см3 0,1 н. раствора пероксида водорода и добавляли туда же 20 см3 картофельной вытяжки, а еще через 30 мин действие фермента прекращали прибавлением 5 см3 10%-ного раствора серной кислоты и титровали смесь 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Фиксировали количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося пероксида водорода. Одновременно ставили контроль с инактивиро-ванным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин 20 см3 картофельной вытяжки. К этому раствору после охлаждения добавляли 25 см3 0,1 н. пероксида водорода. Смесь оставляли на 30 мин, после чего добавляли 5 см3 10%-ного раствора серной кислоты и титровали смесь 0,1 н. раствором перманганата калия. Фиксировали количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося количества пероксида водорода. По разности между опытным и контрольным титрованием находили количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчет количества пероксида водорода, разложенного ферментом, вели в соответствии с уравнением реакции:

5Н2О2+2KMnO4+3H2SO4 = = 2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O

Согласно этому уравнению, 1 см3 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода. Это хорошо иллюстрируется следующим примером. Из 2 г картофеля приготовлена водная вытяжка объемом 100 см3. На титрование опытной пробы (20 см3 картофельной вытяжки) затрачено 5,8 см3, контрольной - 22,6 см3 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно 22,6 - 5,8 = 16,8 см3 0,1 н раствора пер-манганата калия и, следовательно, равно 28,56 мг пероксида водорода.

В 2 г сырого картофеля содержится количество ферментов-антиоксидантов, способное за 30 мин разложить (28,56-100)/(20-1)=142,8 мг пероксида водорода, а за 1 мин - 4,76 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 2 г картофеля содержится 140Е ферментов-антиоксидантов (или 70Е в 1 г картофеля).

Получение энтеросорбента Для получения энтеросорбента - антиок-сиданта 5 кг тонкоизмельченного картофеля вымачивали в 10 дм3 воды в течение 1 часа. Водная вытяжка содержит практически все ферменты -антиоксиданты. В водную вытяжку, освобожденную от картофеля, вносили 1000 г сорбента СВ-1. Выдерживали смесь при постоянном перемешивании 2 часа при температуре от 5 до 10°С, далее фильтровали через бязевые фильтры. Водную вытяжку отбрасывали, а полученный мокрый сорбент переносили на стеклянную поверхность так, чтобы стекло лежало с небольшим (4 - 5°) наклоном. При этом избыток влаги легко сходит с сорбента. Сорбент высушивали в токе воздуха при 20-25°С до влажности около 5%.

Измеренная активность ферментов в водной вытяжке после адсорбции из нее ферментов-антиоксидантов, составила 0,5Е. С учетом массы сорбента установлено, что 1 г его содержит 350Е ферментов-антиоксидантов.

Были проведены опыты по изучению статической и динамической сорбции суммы антиок-сидантов из водной вытяжки картофеля, среди которых подавляющее количество принадлежит пероксидазе. Так как каталаза и пероксидаза имеют сходные физико-химические характеристики, то сорбционные процессы были изучены без разделения этих веществ.

Изучение статической сорбции антиоксидантов на сорбенте СВ-1 Изотермы сорбции. В 30 конических колбочек емкостью 100 см3 вносили от 0 до 30 см3 картофельной вытяжки, от 30 до 0 см3 дистиллированной воды и по 1 г сорбента СВ-1. Встряхивали 1 час, давали отстояться, отбирали 10 см3 ос-

ветленной верхней части раствора в другие 30 конических колбочек емкостью 100 см3. В отобранные пробы вносили 1 см3 0,05 М раствора перокси-да водорода, 5 см3 1 %-ного раствора иодида калия, 2 см3 2 н серной кислоты, 2 капли 1%-ного раствора молибдата аммония и 3 капли 1%-ного раствора крахмала. Через 1 мин оттитровывали выделившийся йод 0,02 н. раствором тиосульфата натрия. Опыты проводили при температурах 278, 288 и 298 К. По результатам титрования строили изотермы сорбции, для чего на графиках по горизонтальной оси откладывали значения равновесных активностей [Е], по вертикальной - сорбцию Г (Е/г), которую рассчитывали по формуле / '= К - [£],

(1)

где У0 - объем тиосульфата натрия, пошедший на титрование водной вытяжки из картофеля до сорбции, см3; V, - объем тиосульфата натрия, пошедший на титрование водной вытяжки из картофеля после сорбции, см3; С - концентрация раствора тиосульфата натрия (0,02 н.); Увыт - исходный объем водной вытяжки из картофеля; т -масса сорбента (1 г), Е - исходная активность водной вытяжки.

На рис. 1 приведены изотермы адсорбции ферментов-антиоксидантов на сорбенте СВ-1.

Г Е/г

25

20

15

10

0,05

од

-1

ОД:

E]

Рис.1. Изотермы сорбции ферментов-антиоксидантов сорбентом СВ-1 из водной вытяжки картофеля : 1- 298 К, 2 - 288 К, 3 - 278 К

Fig. 1. Isotherms of enzymes-antioxidants sorption with the sorbent СВ-1 from a water extract of a potato: 1- 298 К, 2 -288 К, 3 - 278 К

Вид экспериментальных изотерм соответствует типу S-2, для которых применимо уравнение Фрумкина [5]:

BC =-exp С- 2а 8

1-9

(2)

где В - константа сорбции; С - равновесная концентрация сорбата в растворе, величина С нами заменена на величину [£]; 0 - степень заполнения поверхности сорбента, которая определяется из отношения Г/Г» при данной равновесной концентрации; а - аттракционная постоянная, характеризующая энергию взаимодействия между адсорбированными молекулами.

Константа а в уравнении (2) зависит от энергии взаимодействия между молекулами сор-бата (пероксидазы, ЕА-А), молекулами растворителя в адсорбционном слое (воды, Е3.3 ), и молекулами сорбата и растворителя (ЕА_5). Величину а можно рассчитать по формуле [6]:

а = - (6Еа s - 3Еа - а - 3Е8.8) (3)

В нашем случае пероксидаза и каталаза образуют между собой водородные связи. Это относится также к молекулам воды и соединениям воды и пероксидазы (каталазы). В таком случае, при подстановке в уравнение (3) численных величин Еа-а , Еа_3 и Е3_3 величина а равна нулю, а уравнение (2) становится более простым (уравнение Ленгмюра):

1

BC =

■; В |

(4)

Т, К Константы сорбции, В Г, Е/г - ЛН, кДж/моль - ЛО298, кДж/моль - ЛS298, Дж/моль-К

278 21,4 ± 2,1 24,0 25,1 ± 2,4 9,4 ± 0,9 52,8 ± 5,1

288 34,8 ± 3,4

298 44,5 ± 4,4

Как видно из табл. 1, сорбционная емкость СВ-1 по отношению к ферментам-антиоксидантам находится на высоком уровне. Термодинамиче-

ские характеристики сорбции убедительно свидетельствуют об образовании между сорбентом и сорбатом достаточно прочных связей.

Изучение кинетики сорбции антиоксидантов на сорбенте СВ-1 В прикладном плане изучение кинетики сорбции дает возможность судить о времени, при котором практически все сорбируемое вещество будет поглощено сорбентом.

Порядок выполнения работы. Изучение скорости сорбции антиоксидантов проводили при трех температурах. В колбу емк. 1000 см3 вносили 500 см3 картофельной вытяжки и 20 г сорбента СВ-1. Одновременно включали секундомер, содержимое колбы интенсивно перемешивали, отбирая по 10 см3 осветленной верхней части раствора в конические колбы емк. 250 см3. Пробы отбирали тотчас (до внесения энтеросорбента) и через 10,20,30, 60, 120, 240, 360 с. Определяли содержание ферментов антиоксидантов по методике, описанной в предыдущих опытах. Результаты опытов приведены на рис. 2.

1-6 " - 1-9

Изотермы на рис.1 действительно описываются уравнением Фрумкина (2) , но дело в том, что преобладающим видом связи между адсорбированными молекулами является водородная связь.

С использованием уравнения (4) были рассчитаны константы сорбции В для различных температур, по которым графическим методом рассчитано изменение энтальпии (ЛЯ), а с использованием уравнения ЛО = - RT^lnB рассчитаны величины свободной энергии (ЛО).

По уравнению ЛО = ЛН - ТЛ5" рассчитаны величины изменения энтропии сорбции для трех температур. Результаты расчетов приведены в табл. 1.

Таблица 1

Основные термодинамические характеристики сорбции ферментов-антиоксидантов на сорбенте

СВ-1(Р=0,9; ^ = 2,02; n= 6 ) Table 1. The basic thermodynamic characteristics of

ISO 240

x, с

Рис.2. Кинетика сорбции ферментов-антиоксидантов сорбентом СВ-1 из водной вытяжки картофеля : 1 - 278 К, 2- 288 K, 3 - 298 К

Fig. 2. Sorption kinetics of enzymes-antioxidants with the sorbent СВ-1 from a water extract of a potato: 1 - 278 К, 2- 288 K, 3 - 298 К

Процесс сорбции представляет собой бимолекулярную реакцию, которую, в связи с избытком одного из компонентов - сорбента, можно представить как односторонний процесс, подчиняющийся кинетическому уравнению первого порядка.

Константы скоростей сорбции рассчитывали по уравнению:

1 V

К = —In — , т. К.

1

где У0 - объем титранта до начала сорбции (п=0); V] - объем титранта, затраченного по истечении времени гi.

По результатам расчетов К, для каждой температуры находили среднюю величину константы скорости сорбции, далее с использованием графика Аррениуса рассчитывали энергию активации и предэкспоненциальный фактор в уравнении Аррениуса (Еакт, 1иР20). Для расчета изменения энтропии активации формирования активированного адсорбционного комплекса использовали уравнение, которое применимо как для газовых реакций, так и для растворов [7]:

АГ

lnPZ„ = 10,36 + \пТ + -

R

где lnPZ0 - предэкспоненциальный фактор в уравнении Аррениуса, AS - изменение энтропии активации формирования активированного комплекса, R - универсальная газовая постоянная, Т - температура.

Результаты расчетов приведены в табл. 2.

Таблица 2

Основные характеристики кинетики сорбции ферментов - антиоксидантов на сорбенте СВ-1 Table 2. The main characteristics of the sorption

Т, К Константы скоростей сорбции, K'102, с е ^акт, кДж/мольК lnPZ0 - ДS#298, Дж/моль^К

278 3,3 ± Q,3 24,2 ± 2,4 2,5 ± 0,2 116,2 ± 11,4

288 3,4 ± Q,3

298 б,7 ± Q,6

Как видно из рис. 2, для сорбционных процессов при различных температурах характерен достаточно крутой начальный участок изотермы кинетики сорбции, уже в течение первых 530 минут контакта сорбируется подавляющее количество ферментов-антиоксидантов.

Изменение энтропии активации формирования активированного адсорбционного комплекса меньше чем изменение энтропии сорбции для случая наступления равновесия. Это означает, что механизм сорбции включает в себя две стадии. Первая стадия — это стадия закрепления антиок-сиданта на сорбенте, согласно данным работы. Так как образуется прочное соединение, то можно считать, что присоединение антиоксидантов происходит к протонированному азоту, который захватывается комплексом силанольных и силокса-новых групп кластера сорбента, представляющего собой неорганический ионофор. Так как изменение энтропии для двух процессов отличается на

небольшую величину, то возможным вариантом более устойчивого соединения является присоединение других групп к такому же кластеру.

С практической точки зрения важнейшим результатом является то, что ферменты -антиокси-данты с сорбента не вымываются водой. Это, в свою очередь, обеспечивает длительное функционирование антиоксиданта, так как он прочно закреплен на достаточно крупных частицах сорбента. Это позволяет использовать комплекс сорбент-антиоксидант как энтеросорбент.

Энтеросорбент СВ-1-АО в воде и биологических жидкостях не растворяется, это твёрдый компонент, вероятно, его использование может ограничиваться защитой желудочно-кишечного тракта человека и животных от самых разнообразных пероксидов и окислителей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алыков Н.М., Алыкова Т.В., Асанова Д.Р. // Экологические системы и приборы. 2007. № 8. С. 42-45; Alykov N.M., Alykova T.V., Asanova D.R. // Ekologi-cheskie sistemy i pribory. 2007. N 8. Р. 42-45 (in Russian).

2. Алыков Н.М., Алыкова Т.В., Асанова Д.Р. //. Безопасность жизнедеятельности. 2009. № 4. С. 6 - 9; Alykov N.M., Alykova T.V., Asanova D.R. // Bezopasnoct Zhiznedeyatelnosti. 2009. N 4. Р. 6-9 (in Russian).

3. Алыков Н.М., Алыкова Т.В., Воронин Н.И., Кля-ев В.И., Алыков Е.Н., Пащенко К.П., Алыков Н.Н., Са-домцев К.Ю., Явороский Н.И. Опоки Астраханской области. Астрахань:.Изд. дом «Астрах. ун-т». 2005. 140 с.; А1у^ N.M., А1у^а T.V.,Voronin N.L, Klyaev V. L, Alykov E.N., Pashchenko K.P., Alykov N. N., Sadomtsev K.Yu., Yavorosky N.I. Molding boxes of Astrakhan region. Astrakhan: The publ.house «The Astrakhan state university». 2005. Р.140 (in Russian).

4. Алыков Н.М., Алыкова Т.В., Шачнева Е.Ю. // Изв. вузов. Химия и хим. технология . 2010. Т. 53. Вып. 8. С. 50 - 54;

А1у^ КМ.,А1у^а T.V., Shachneva E.Yu. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2010. V. 53. N. 8. Р. 50 - 54 (in Russian).

5. Филлипович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А.

Практикум по общей биохимии. М.: Просвещение.1975. 318 с.;

Fillipovich Yu.B., Egorova T.A., Sevastyanov G.A.

Practical work on the general biochemistry. М.: Prosve-shenie.1975. Р. 318 (in Russian).

6. Нечаев Е.А. Хемосорбция органических веществ на оксидах и металлах. Харьков: Высшая школа. Изд-во при Харьк. ун-те.1989.144 с.;

Nechaev E.A. Chemical sorption of organic substances on oxides and metals. Kharkov: Vysshaya Shkola. Kharkov University. 1989. P. 144 (in Russian).

7. Мельвин-Хьюз Э.А. Физическая химия. Кн.1. М.: Изд-во иностранной литературы.1962. 520 с. Melvin-Hughes E.A. Physical chemistry. Book 1. M.: Inostrannaya Literatura. 1962. P. 520. (in Russian).

Кафедра аналитической и физической химии