CC BY
55
УДК: 615.074:547.575
ИЗОЛИРОВАНИЕ ХЛОРАМБУЦИЛА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Курский государственный медицинский университет
В.К. ШОРМАНОВ М.Л. СТОЛЯРОВ
В качестве изолирующего агента для извлечения хлорамбу-цила из биологического материала предложен ацетон. Определены оптимальные условия изолирования хлорамбуцила из ткани печени трупа человека ацетоном и дана количественная оценка результатов изолирования.
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: хлорамбуцил, изолирование, судебно-
химический анализ, ТСХ, спектрофотометрия.
Хлорамбуцил (4-[пара-[бис-(в-хлорэтил)-амино]фенил]масляная кислота) - это противоопухолевое лекарственное средство из группы производных бис-(в-хлорэтил)-амина. Он является основным действующим веществом препаратов Лейкеран, С1окегап, Leukeran и др. Его фармакологические эффекты широко используются при лечении различных онкологических заболеваний (лимфолейкоз, лимфогранулематоз, лимфо- и ретикулосаркома, рак яичников и молочной железы, миеломная болезнь и др.). Такжехлорамбуцил может применяться в качестве иммуносупрессанта [2].
По физическим свойствам хлорамбуцил представляет собой белый кристаллический или зернистый порошок, хорошо растворимый в этаноле, ацетоне, хлороформе, эфире и практически нерастворимый в воде.
Хлорамбуцил обладает значительной токсичностью для теплокровных организмов. LD50 для крыс при внутрибрюшинном введении составляет 21-23 мг/кг. Пероральное введение дозы 40 мг/кг/сут вызывает гибель 50%крыс вистар в эксперименте [4].
В доступной литературе встречается описание случаев отравления людей хлорамбуци-лом. Он является канцерогеном, может вызывать развитие вторичных злокачественных опухолей. Нарушение функций жизненно важных органов вследствие приема препарата может привести к летальному исходу [1, 5].
Широкое применение хлорамбуцила в качестве лекарственного средства, его токсичность и наличие случаев отравления обусловливают необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении.
Вопросы химико-токсикологического анализа данного вещества изучены недостаточно. Существующие методики изолирования и определения хлорамбуцила и близких по структуре соединений в биологическом материале обладают недостаточно высокой экспрессностью и селективностью, отличаются трудоемкостью и сложностью применяемой аппаратуры [3].
Цель. Изучение изолирования хлорамбуцила из биологического материала изолирующими агентами различной природы и подбор оптимальных условий изолирования (объема изолирующего агента, времени и кратности настаивания).
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явилась субстанция хлорамбуцила фирмы «Sigma-Aldrich» с содержанием основного вещества не менее 99,5 %.
Изучали особенности изолирования хлорамбуцилаиз биологического материала растворителями различной химической природы: водой и водными растворами кислот и щелочей (0,1 н. раствор гидроксида натрия, 8% раствор уксусной кислоты), карбоновыми кислотами (ледяная уксусная кислота) и их ангидридами (уксусный ангидрид), кетонами (ацетон),спиртами (метанол, этанол, пропанол-1, пропанол-2, бутанол-1, бутанол-2), гетероциклическими кислородсодержащими соединениями (диоксан), алканами (гексан), галогеналканами (метиленхлорид, хлороформ, тетрахлорметан), а также аренами (бензол, толуол, о-ксилол), сложными и простыми эфирами (диэтиловый эфир, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат), нитрилами (ацетонитрил).
Для этого готовили модельные смеси исследуемого вещества и мелкоизмельченной трупной печени человека, которые выдерживали при 18-20 0С в течение 1,5 часов после приготовления. Осуществляли двукратное изолирование хлорамбуцила из модельных смесей при соотношении изолирующего агента и биологического материала 2:1 (по массе). Продолжительность каждого настаивания составляла 45 минут. Оба извлечения, полученные из каждой модельной смеси, объединяли, отфильтровывали на фильтре, предварительно промытом изолирующим агентом, а затем очищали от соэкстрактивных веществ биологической матрицы мето-
дом адсорбционной высокоэффективной ТСХ, используя тонкий слой гидроксилированного сорбента СТХ-1А и подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 в объемных соотношениях 12,5:5:1. На хроматограммах хлорамбуцил обнаруживался в виде темно-фиолетового пятна на более светлом общем фоне пластины в УФ-свете. Хлорамбуцил элюировали из сорбента этила-цетатом двукратно порциями по 5 мл. Элюат испаряли в токе воздуха при комнатной температуре, а анализируемое вещество, содержащееся в остатке, переводили в соответствующее нитропроизводное путем обработки 10% раствором калия нитрата в концентрированной серной кислоте в течение 5 минут.
Количество хлорамбуцила в извлечениях определяли по интенсивности поглощения его нитропроизводного в среде разбавленного раствора гидроксида натрия при аналитической длине волны 325 нм. Расчеты осуществляли по уравнению градуировочного графика.
С помощью описанной выше схемы изолирования, очистки и определения хлорамбуцила исследовали зависимость степени извлечения рассматриваемого вещества из биологического материала от продолжительности контакта изолирующей жидкости с биологическим материалом, кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и биологической ткани.
Г>
100 т
80 -60 -40 -
20 -
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
\
•Г ^ Ж Л? л*'
<\<Г <\<Г ^
оР оР'
О /ОО
■$> & & ////
' 00°т
80 - -60 -40 -
20 -
+
+
+
+
+
п . п
О
/ *
/■ у
/
о\оЛ .
О4
<г>
*
о\о
о-
Рис. 1. Зависимость степени извлечения (И, %) хлорамбуцила из ткани печени от природы изолирующего агента (двукратное изолирование, соотношение изолирующего агента и биологического материала 2:1
(по массе)
Изучалась зависимость степени извлечения хлорамбуцила оптимальным изолирующим агентом в оптимальных условиях от концентрации анализируемого соединения в биологическом объекте. В каждом случае 25,00 г мелкоизмельченной трупной печени человека, содержащей определенное количество хлорамбуцила (от 2,50 до 50,00 мг), заливали 50 г ацетона и выдерживали в течение 30 минут при периодическом перемешивании. По истечении 30 минут извлечение сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли по описанной выше схеме. Отдельные извлечения объединяли и отфильтровывали на фильтре, предварительно промытом ацетоном. 0,5 мл полученного фильтрата наносили на хроматографическую пластину «Сорбфил» марки ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы и осуществляли хроматографирование в присутствии вещества-свидетеля в стеклянной камере объемом 600 смз, используя в качестве элюента систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (12,5:5:1). Участок хроматограммы с хлорамбуцилом вырезали и осуществляли элюирование анализируемого вещества с пластины этилацетатом дважды порциями по 5 мл. Элюат испаряли в токе воздуха при комнатной температуре, а сухой остаток переводили в соответствующее нитропроизводное по описанной выше схеме. Оптическую плотность нитропроизводного измеряли на спектрофотометре СФ-56 в кварцевых кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм при аналитической длине волны, равной
325 нм. В качестве фона использовали элюат, полученный в контрольном опыте. Количественное содержание рассматриваемого вещества рассчитывали с помощью уравнения градуировочного графика.
Результаты исследования и их обсуждение. В данном случае уравнение градуировочного графика имело вид:
А = 0,01562 • С + 0,004535, где А - оптическая плотность; С - концентрация, мкг/мл;
Результаты зависимости изолирования хлорамбуцила из трупной печени от природы изолирующего агента представлены на рис. 1.
Сравнение результатов изолирования показало, что наибольшая степень извлечения достигается при использовании в качестве изолирующего агента ацетона.
Установлено, что максимальная степень извлечения хлорамбуцила из трупной печени ацетоном достигается при продолжительности настаивания не менее 30 минут (рис. 2).
100
к%
90
80
70
60
50
15 мин
30 мин
45 мин
60 мин
75 мин
Рис. 2. Зависимость степени извлечения (И, %) хлорамбуцила из ткани печени от времени (двукратное изолирование ацетоном, соотношение изолирующего агента и биологического материала 2:1
(по массе)
Таблица 1
Зависимость степени извлечения (К, %) хлорамбуцила из ткани печени от соотношения количества биоматериала и ацетона и от кратности настаивания (п=5)
Взято вещества, мг Масса ацетона, г Кратность настаивания Найдено вещества
мг %
1 2 3 4 5
25,0 25 1 8,20 32,80
2 6,23 24,93
1+2 14,43 57,73
3 3,77 15,08
1+2+3 18,20 72,81
4 2,86 11,44
1+2+3+4 21,06 84,25
25,0 50 1 13,34 53,36
2 7,63 30,51
1+2 20,97 83,87
3 2,53 10,11
1+2+3 23,5 93,98
4 0,47 1,89
1+2+3+4 23,97 95,87
25,0 62,5 1 14,19 56,76
2 7,05 28,21
1+2 21,24 84,97
3 2,22 8,89
1+2+3 23,46 93,86
4 0,62 2,46
1+2+3+4 24,08 96,32
25,0 75 1 14,72 58,89
Окончание табл. 1
1 2 3 4 5
2 6,56 26,23
1+2 21,28 85,12
3 2,28 9,14
1+2+3 23,56 94,26
4 0,50 2,00
1+2+3+4 24,06 96,26
25,0 100 1 15,47 61,89
2 6,41 25,63
1+2 21,88 87,52
3 1,95 7,79
1+2+3 23,83 95,31
4 0,30 1,19
1+2+3+4 24,13 96,50
Исследование зависимости степени извлечения хлорамбуцила от кратности настаивания показало, что для достаточно полного извлечения рассматриваемого вещества из трупной печени необходимо двукратное настаивание биологического материала с изолирующим агентом при условии, что количество ацетона в каждом случае превышает количество биологического материала как минимум в 2 раза по массе (табл. 1).
Как свидетельствуют данные эксперимента, представленные в табл. 2, увеличение содержания хлорамбуцила в модельных смесях в достаточно широком интервале концентраций (2,50-50,00 мг) при постоянной массе навески ткани печени (25,00 г) сопровождается лишь незначительным изменением значений степени извлечения, не превышающим 2%. Это обстоятельство позволяет предположить, что взаимодействие молекул хлорамбуцила со структурными элементами ткани печени не приводит к образованию достаточно прочных связей.
Таблица 2
Зависимость степени извлечения (К, %) хлорамбуцила из ткани печени от количества хлорамбуцила и биологического материала (по массе)(п = 5; Р = 0,95)
Внесено хлорамбуцила, мг в 25 г биоматериала Найдено, %
Х 8 8 X д Х е
50,0 84,83 2,17 0,97 2,50 2,94
25,0 83,99 2,53 1,13 2,91 3,47
12,5 83,80 2,74 1,22 3,15 3,75
5,0 83,65 2,91 1,30 3,35 4,00
2,5 82,89 3,41 1,52 3,91 4,72
Использование в качестве изолирующего агента ацетона и предложенные условия изолирования позволяют достичь достаточно высокой степени извлечения анализируемого вещества из ткани трупной печени. Предложенная методика достаточно хорошо воспроизводима, отличается простотой выполнения, не требует применения сложной аппаратуры и значительных затрат времени на воспроизведение. Она может быть использована в практике при проведении экспертизы в случае отравления хлорамбуцилом.
Выводы:
1. Изучена возможность использования ацетона в качестве изолирующего агента при химико-токсикологическом исследовании хлорамбуцила.
2. Определены оптимальные условия изолирования хлорамбуцила ацетоном из биологического материала.
3. Дана количественная оценка изолирования ацетоном рассматриваемого вещества из модельных смесей с тканью печени.
Литература
1. Влияние хронической задержки мочеиспускания и канцерогенов на развитие поверхностного рака мочевого пузыря / В.Н. Павлов, С.Л. Попов, В.З. Галимзянов и др. // Человек и его здоровье: Курский научно-практический вестник. - 2009. - № 3. - С. 121-124.
2. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский // Пособие для врачей. - М.: Новая волна, 2008. - 1206 с.
3. Improving the spectrophotometric determination of the alkylating activity of anticancer agents: a new insight into the mechanism of the NBP method / K.M. Dierickx, F. Journe, P. Gerbaux and others / / Talanta. - 2009. -Vol. 77, № 4. - Р. 1370-1375.
4. Toxicity of High-Dose Chlorambucil in Wistar Rats / J. Tomenendalova, J. Mayer, M. Doubek and others // Acta. Vet. Brno. - 2008. - Vol. 77, № 4. - P. 595-602.
5. Chlorambucil overdose: accidental ingestion of an antineoplastic drug / S.A. Vandenberg, K. Kulig, D. G. Spoerke and others // J. Emerg. Med. - 1988. - № 6. - Р. 495-498.
CHLORAMBUCIL ISOLATION OF BIOLOGICAL MATERIAL
V.K. SHORMANOV M.L. STOLYAROV
As isolating agent for extraction of biological material chlorambucil acetone was proposed. The optimal conditions were clarified for isolation ofchlorambucil human cadaver liver acetone and quantified isolation results.
Kursk State Medical University
e-mail: [email protected]
Key words: chlorambucil, isolation, forensic chemical analysis, TLC, spectrophotometry.
