CC BY
18
ИЗОФОРМЫ микроРНК MIR-148A И MIR-203A ПРЕДПОЛОЖИТЕЛЬНО ИГРАЮТ РОЛЬ СУПРЕССОРОВ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА
С. А. Нерсисян1'2^
1 Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики», Москва, Россия
2 Институт молекулярной биологии Национальной академии наук Республики Армения, Ереван, Армения
Изоформы микроРНК — класс коротких некодирующих РНК, осуществляющих регуляцию экспрессии генов. Изоформы микроРНК отличаются от канонических микроРНК несколькими нуклеотидами на концах молекулы, причем вариации с 5'-концов микроРНК изменяют множество генов-мишеней. Целью работы было провести анализ функциональной активности 5'-изоформ микроРНК в тканях колоректального рака. Мишени 5'-изоформ микроРНК были предсказаны с помощью биоинформатических программ miRDB и TargetScan. Полученные данные о мишенях 5'-изоформ микроРНК были интегрированы с данными секвенирования мРНК и изоформ микроРНК образцов первичных колоректальных опухолей проекта The Cancer Genome Atlas Colon Adenocarcinoma. Для построения сети взаимодействий изоформ микроРНК, их мишеней и транскрипционных факторов по интегрированным данным использовали алгоритм miRGTF-net. Показано, что высокоэкспрессированные при колоректальном раке изоформы микроРНК, различающиеся одним нуклеотидом на 5'-конце молекулы, имеют не более 30% общих мишеней. В регуляторной сети взаимодействий выявлены наиболее активные изоформы микроРНК. Уровни экспрессий канонической микроРНК hsa-miR-148a-3p и ее предсказанных мишеней, являющихся регуляторами клеточной пролиферации (CSF1, ETS1, FLT1, ITGA5, MEIS1, MITF, RUNX2), были значимо отрицательно коррелированы, откуда может следовать противоопухолевая роль данной молекулы. Каноническая микроРНК hsa-miR-203a-3p|0 и ее 5'-изоформа были антикоррелированы с различными генами-мишенями, но при этом обе потенциально подавляли экспрессию генов, вовлеченных в эпителиально-мезенхимный переход: SNAI2 и TNC.
Ключевые слова: изоформы микроРНК, колоректальный рак, регуляторные сети, miRGTF-net, TCGA Финансирование: исследование осуществлено в рамках Программы фундаментальных исследований НИУ ВШЭ.
Благодарности: Алексею Галатенко из лаборатории молекулярной физиологии НИУ ВШЭ за критику авторских идей и ценные замечания.
Соблюдение этических стандартов: исследование проведено с соблюдением этических принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации.
[ЯЗ Для корреспонденции: Степан Ашотович Нерсисян
ул. Вавилова, д. 7, г. Москва, 117312, Россия; [email protected]
Статья получена: 29.04.2022 Статья принята к печати: 22.05.2022 Опубликована онлайн: 30.05.2022 DOI: 10.24075/vrgmu.2022.028
ISOFORMS OF MIR-148A AND MIR-203A ARE PUTATIVE SUPPRESSORS OF COLORECTAL CANCER
Nersisyan SA1,2E3
1 National Research University Higher School of Economics (HSE), Moscow, Russia
2 Institute of Molecular Biology (1MB) of the National Academy of Sciences of the Republic of Armenia, Yerevan, Armenia
MicroRNAs are short non-coding molecules which regulate translation in a gene-specific manner. MicroRNA isoforms that differ by few extra or missing nucleotides at the 5'-terminus (5'-isomiR) show strikingly different target specificity. This study aimed to identify functional roles of 5'-isomiR in colorectal cancers. Transcriptomic targets of microRNA isoforms were predicted using bioinformatics tools miRDB and TargetScan. The sets of putative targets identified for 5'-isomiR were integrated with mRNA and microRNA sequencing data for primary colorectal tumors retrieved from The Cancer Genome Atlas Colon Adenocarcinoma (TCGA-COAD) database. The network of interactions among miRNA, their targets and transcription factors was built using the miRGTF-net algorithm. The results indicate that microRNA isoforms highly expressed in colorectal cancer and differing by a single nucleotide position at the 5'-terminus have < 30% common targets. The regulatory network of interactions enables identification of the most engaged microRNA isoforms. Anti-correlated expression levels of canonical microRNA hsa-miR-148a-3p and its putative targets including CSF1, ETS1, FLT1, ITGA5, MEIS1, MITF and RUNX2 proliferation regulators suggest an anti-tumor role for this molecule. The canonical microRNA hsa-miR-203a-3p|0 and its 5'-isoform bind different sets of anti-correlated putative targets, although both of them interact with genes involved in the epithelial-mesenchymal transition: SNAI2 and TNC.
Keywords: isomiR, colorectal cancer, regulatory networks, miRGTF-net, TCGA
Funding: the study was supported by HSE Basic Research Program.
Acknowledgement: the author thanks Aleksey Galatenko of the HSE Laboratory of Molecular Physiology for the fruitful critique and valuable comments.
Compliance with ethical standards: the study complies with the ethical principles of the World Medical Association Declaration of Helsinki.
[>3 Correspondence should be addressed: Stepan A. Nersisyan Vavilova, 7, Moscow, 117312, Russia; [email protected]
Received: 29.04.2022 Accepted: 22.05.2022 Published online: 30.05.2022
DOI: 10.24075/brsmu.2022.028
МикроРНК — семейство коротких некодирующих РНК, осуществляющих пост-транскрипционную регуляцию экспрессии генов [1]. Необходимым условием для связывания микроРНК с мРНК является комплементарность эееС-региона микроРНК (2-7 нуклеотиды с 5'-конца) с последовательностью мРНК-мишени [2]. В результате такого связывания происходит остановка трансляции мРНК или же ее деградация, причем вероятность деградации
напрямую связана с количеством комплементарных связей за пределами seed-региона [2]. Хорошо известно, что молекулы микроРНК могут играть роль как опухолевых супрессоров, так и онкогенов для множества видов рака [3-5].
В ходе созревания микроРНК ферменты Drosha и Dicer могут неточно осуществлять обрезку шпильки при-микроРНК, в результате чего образуются изоформы
микроРНК, отличающиеся от канонической микроРНК несколькими нуклеотидами на концах молекулы [6]. Вариация длины микроРНК с 5'-конца играет особую роль, так как при изменениях смещается seed-регион; таким образом, 5'-изоформы микроРНК обладают другим набором мишеней даже в случае изменения длины на один нуклеотид.
Колоректальный рак (КРР) занимает третье место по частоте заболеваемости и второе по частоте летальных исходов среди онкологических заболеваний в мире [7]. Широко известны примеры участия микроРНК в механизмах прогрессии и метастизрования КРР. Например, семейство микроРНК miR-200 подавляет экспрессию генов ZEB1, ZEB2, кодирующих ключевые транскрипционные факторы (ТФ) для эпителиально-мезенхимного перехода (ЭМП) [8]. Соответственно, транскрипционное и/или эпигенетическое подавление экспрессии miR-200 способствует ЭМП и метастазированию рака [8]. Профили экспрессии молекул микроРНК активно используют также для поиска диагностических и прогностических маркеров КРР [9]. На сегодняшний день изучение роли изоформ микроРНК при КРР ограничено изучением их уровней экспрессии в опухолевых и здоровых тканях [10], при этом, насколько нам известно, функциональную активность 5'-изоформ микроРНК при КРР исследователи не анализировали.
Большое количество микроРНК и на порядки большее число порождаемых ими регуляторных взаимодействий (в среднем для одной микроРНК предсказано около 200 мишеней [1]) требуют применения биоинформатических подходов; один из наиболее распространенных методов — анализ регуляторных сетей. В рамках данного подхода молекулам микроРНК и генам ставят в соответствие вершины сети, а паре взаимодействующих молекул — ребро, соединяющее микроРНК и мишень [11]. Для построения регуляторных сетей традиционно используют два подхода: литературные базы данных взаимодействий и корреляционный анализ по выборке образцов с известной экспрессией мРНК и микроРНК. Нами ранее был разработан и программно реализован алгоритм miRGTF-net, позволяющий объединить эти два подхода и добавить в сеть другой класс регуляторных молекул — транскрипционных факторов [12]. Использование данного алгоритма позволяет максимально полно и достоверно описать ландшафт внутриклеточных взаимодействий в интересующем типе клеток/тканей.
Целью работы было выяснить функциональную роль 5'-изоформ микроРНК в тканях КРР, проанализировав их профиль экспрессии, предсказав мишени на основе нуклеотидных последовательностей и интегрировав полученные данные с данными активности ТФ с помощью алгоритма miRGTF-net.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Предсказание мишеней изоформ микроРНК
Последовательности шпилек при-микроРНК и канонические позиции их разрезания ферментами Drosha и Dicer извлекали из базы данных miRBase версии 21 (https:// www.mirbase.org). Для обозначения 5'-изоформ микроРНК использовали стандартную номенклатуру: число после вертикальной черты обозначает сдвиг позиции разрезания относительно канонического в направлении от 5'- к 3'-концу. Например, hsa-miR-10a-5p| + 1 соответствует последовательности микроРНК hsa-miR-10a-5p без первого нуклеотида на 5'-конце молекулы.
Нуклеотидные последовательности микроРНК и их изоформ вводили в программы miRDB версии 6.0 [13] и TargetScan версии 7.2 [2] для определения мРНК-мишеней. Согласно рекомендациям разработчиком miRDB, выбирали предсказания с качеством связывания не менее 80. Число предсказаний TargetScan уравнивали с числом предсказаний miRDB, выбирая соответствующее число наиболее сильных взаимодействий для каждой изоформ микроРНК.
Сбор и анализ данных секвенирования мРНК и изоформ микроРНК
Публично доступные исходные данные секвенирования мРНК и изоформ микроРНК проекта The Cancer Genome Atlas Colon Adenocarcinoma (TCGA-COAD) получали с портала GDC (https://portal.gdc.cancer.gov/). Данные нормировали с помощью пакета edgeR версии 3.30.0 [14], использовали алгоритм нормализации Trimmed Mean of M-values (TMM), в результате получили таблицы Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads (TMM-RPKM) для экспрессии мРНК и Reads Per Million mapped reads (TMM-RPM) — для экспрессии микроРНК.
Таблицу экспрессии 5'-изоформ микроРНК сортировали по суммарной экспрессии в рассматриваемых образцах, после чего считали кумулятивную функцию распределения. Наименьшее число 5'-изоформ микроРНК, покрывающих 95% всех прочтений секвенирования, обозначали высокоэкспрессированными 5'-изоформами микроРНК и использовали для дальнейшего анализа.
Построение регуляторной сети взаимодействий изоформ микроРНК, их мишеней и транскрипционных факторов
Алгоритм miRGTF-net [12] использовали для построения регуляторной сети взаимодействий изоформ микроРНК, их мишеней и транскрипционных факторов. Основным преимуществом алгоритма является возможность интеграции данных экспрессии мРНК и изоформ микроРНК (TCGA-COAD) с биологическими базами данных:
- TRRUST версии 2 (https://www.grnpedia.org/trrust/): взаимодействия ТФ и генов;
- TransmiR версии 2 (http://www.cuilab.cn/transmir): взаимодействия ТФ и микроРНК;
- miRDB, TargetScan: взаимодействия 5'-изоформ микроРНК и их мишеней (см. выше);
- miRIAD (https://www.miriad-database.org): коэкспрессия генов-хозяев и их интронных микроРНК.
Использовали каноническую последовательность шагов алгоритма miRGTF-net. Вкратце, сначала строили сеть на основе взаимодействий из баз данных. Затем для каждого ребра рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена по соответствующим значениям экспрессии TCGA-COAD. Ребра, соответствующие молекулам со слабо коррелированными уровнями экспрессии, удаляли (отсечку на абсолютное значение корреляции Спирмена выбирали по 0,9-квантили распределения корреляций). Кроме того, удаляли ребра, соединяющие положительно коррелированные изоформы микроРНК и их мишени и соединяющие отрицательно коррелированных генов-хозяев с их интронными микроРНК.
Далее оценивали силу линейной зависимости между экспрессией каждой вершины и ее прямыми регуляторами. Соответствующие линейные модели строили с помощью
гребневой регрессии. Ячество моделей оценивали с помощью коэффициента детерминации R2, силу и направление регуляции оценивали с помощью стандартизованных ß-коэффициентов регрессии. Для фильтрации вершин и ребер сети использовали пороговые значения, установленные в пакете miRGTF-net по умолчанию: модуль ß-коэффициента не менее 0,3, 90% наибольших значений коэффициентов детерминации. Таким образом, полученная сеть содержала вершины, соответствующие как регуляторам экспрессии, так и регулируемым генам и изоформам микроРНК
Поиск сильно связных компонент в сети проводили с помощью пакета NetworkX версии 2.8 (https://networkx.org). Регуляторные сети визуализировали с помощью программ Gephi (https://gephi.org) и yED Graph Editor (yWorks GmbH; Германия).
Анализ обогащения по функциональной принадлежности
Для функциональной аннотации списков генов (мишеней 5'-изоформ микроРН^ использовали веб-сервис DAVID версии декабря 2021 г. [15] и аннотацию биологических путей Gene Ontology (GO) [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Профиль экспрессии изоформ микроРНК в образцах колоректального рака
Анализируемая выборка TCGA-COAD состояла из профилей экспрессии мРНK и 5'-изоформ микроРНK 426 образцов первичных опухолей KRR Нами было выделено 55 высокоэкспрессированных изоформ микроРНК 10 из которых составляли неканонические изоформы микроРНK (рис. 1). Были выявлены две неканонические 5'-изоформы микроРНК на каждую из которых приходилось более 1% от тотальной экспрессии
микроРНК в рассматриваемых образцах: 1пза-т^-192-5р|+1 (2,4%) и 1пза-т^-10а-5р|+1 (1,3%).
Вариация последовательности микроРНК на ее 5'-конце меняет эееС-регион молекулы, вследствие чего может меняться множество потенциальных генов-мишеней. Последовательности найденных канонических и неканонических изоформ микроРНК были использованы для биоинформатического предсказания их мишеней. Как и ожидалось, пары изоформ микроРНК, отличающихся на один нуклеотид с 5'-конца, имели слабо пересекающиеся множества мишеней (см. таблицу). Например, каноническая форма микроРНК 1пза-т^-10а-5р и ее 5'-изоформа без первого нуклеотида имели всего 11 общих мишеней из 267 мишеней в объединении (4,1%). Максимальная доля общих мишеней была достигнута для микроРНК 1пза-т^-29а-3р и ее более длинной изоформы: 246 общих мишеней, 788 мишеней в объединении (31,2%).
Регуляторная сеть взаимодействий изоформ микроРНК, их мишеней и транскрипционных факторов
Следующим шагом биоинформатического анализа было построение регуляторной сети взаимодействий в клетках КРР. Алгоритм miRGTF-net позволяет строить такие сети, интегрируя два типа данных: биологически обоснованные взаимодействия из баз данных и профили экспрессии мРНК и изоформ микроРНК в выборке образцов. Регуляторая сеть содержала взаимодействия четырех типов:
- ТФ, регулирующие экспрессию генов;
- ТФ, регулярующие экспрессию микроРНК;
- 5'-изоформы микроРНК, регулирующие экспрессию генов;
- коэкспрессию генов-хозяев и их интронных микроРНК.
Данные экспрессии мРНК и 5'-изоформ микроРНК
в выборке TCGA-COAD использовали для выбора взаимодействий, подкрепленных значимой корреляцией в рассматриваемых образцах.
гч g
^llfЕЁ?
Го V ' m ® Ш
^ .с -С .с JZ
> о о о о
! Q- Q. Q- Q-
imfimm
J -Q _¿ CN Ü 1 OI МЛ oí ) ffl (N LO fN £¿ ¿ ¿ cC ■; —
Рис. 1. Распределение экспрессии 55 наиболее экспрессированных 5'-изоформ микроРНК в выборке образцов колоректального рака. Горизонтальный отрезок внутри ящика отображает медиану распределения, границы ящиков соответствуют нижнему и верхнему квартилям, а вертикальные отрезки за пределами ящика продолжаются до минимального и максимального значения экспрессии
Рис. 2. Регуляторная сеть взаимодействий изоформ микроРНК, их мишеней и транскрипционных факторов. Синим, зеленым и красным цветом выделены 5'-изоформы микроРНК, транскрипционные факторы и гены, соответственно. Цвета ребер соответствуют цветам соответствующих регуляторов. Размеры вершин линейно соответствуют их степеням
Построенная сеть состояла из 333 молекул: 24 5'-изоформы микроРНК, 166 ТФ и 143 гена, не кодирующих ТФ (рис. 2). Из 456 взаимодействий 42 соответствовали подавлению экспрессии генов-мишеней изоформами микроРНК, 413 регуляции экспрессии генов и микроРНК с помощью ТФ и лишь одна пара ген-микроРНК соответствовала коэкспрессии гена-хозяина и интронной микроРНК: HOXB3 и hsa-mir-10a.
Наибольшее число антикоррелированных мишеней (семь) было найдено для канонической микроРНК hsa-miR-148a-3p. Данный список состоял из известных онкогенов, включая регуляторы и маркеры пролиферации (CSF1, ETS1, FLT1, MEIS1, MITF, RUNX2, категория G0:0008284 "positive regulation of cell proliferation") и молекулу из семейства интегринов ITGA5, участвующую в регуляции клеточной пролиферации, инвазии и миграции путем передачи сигнала в клетки [17]. Данная микроРНК тоже присутствовала в наибольшой компоненте сильной связности регуляторной сети (т. е. подсети, в которой существует ориентированный путь между двумя любыми вершинами), напрямую связанной с ЭМП и эстрогеновым сигнальным путем (рис. 3). Таким образом, микроРНК hsa-miR-148a-3p потенциально подавляет экспрессию проопухолевых генов, играя роль возможного опухолевого супрессора при КРР.
Второй по количеству регулируемых генов оказалась пара, состоящая из канонической микроРНК hsa-miR-203a-3p|0
и ее 5'-изоформы ИБа-т1П-203а-3р|+1. В то время как у данных молекул не было общих антикоррелированных мишеней, обе изоформы микроРНК выполняли единую функцию, потенциально подавляя экспрессию онкогенов. Так, экспрессия канонической микроРНК Ига-тиП-203а-3р|0 отрицательно коррелировала с экспрессией ТФ SNAI2, являющегося одним из драйверов ЭМП [18], а неканоническая 5'-изоформа Иза-т1П-203а-3р|+1 предположительно регулировала экспрессию белка внеклеточного матрикса, кодируемого геном TNC, который также играет ключевую роль в ЭМП при КРР [19].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В настоящем исследовании с помощью биоинформатического анализа была рассмотрена функциональная активность 5'-изоформ микроРНК в злокачественных колоректальных опухолях. Показано, что изоформы микроРНК, отличающиеся одним нуклеотидом на 5'-конце молекулы, обладают слабо пересекающимися множествами генов-мишеней (31,2% максимум). В число наиболее активных регуляторов вошли Иза-т1П-148а-3р (каноническая микроРНК), Иза-т1П-203а-3р|0 (каноническая микроРНК) и ее 5'-изоформа Иза-т1П-203а-3р|+1. Интересно, что все три найденные микроРНК предположительно подавляли экспрессию проопухолевых генов, причем множества
Рис. 3. Сильно связная подсеть взаимодействий 5'-изоформ микроРНК и транскрипционных факторов. Эллипсами и прямоугольниками обозначены изоформы микроРНК и транскрипционные факторы соответственно. Стрелки обозначают активацию экспрессии, Т-образные линии обозначают подавление экспрессии
антикоррелированных мишеней канонической формы и 5'-изоформы miR-203a не пересекались.
Функциональную активность 5'-изоформ микроРНК ранее изучали в контексте рака молочной железы. Показано, что две 5'-изоформы микроРНК hsa-miR-183-5p оказывают различное влияние на транскриптом клеток MDA-MB-231, в частности, были найдены гены, опосредованно регулируемые изоформами в разных направлениях (EGFR, NRAS) [20]. По нашим данным, анализ мишени 5'-изоформ микроРНК при КРР проведен впервые.
Четыре из семи отобранных нами потенциальных мишеней hsa-miR-148a-3p были валидированы in vitro в ранее опубликованных исследованиях: CSF1, ITGA5 [21], MITF[22], RUNX2 [23]. Нами ранее было также обнаружено, что гипоксия клеточных линий КРР HT-29 и Caco-2 приводила к подавлению экспрессии микроРНК hsa-miR-148a-3p, что влекло за собой повышение экспрессии гена-мишени ITGA5 [24]. В ряде других работ показано,
что miR-148a оказывает проапоптотическое действие и ингибирует пролиферацию, миграцию и инвазию клеток КРР, подавляя экспрессию Bcl-2 [25], ErbB3 [26] и WNT10b [27]. Помимо КРР, роль hsa-miR-148a-3p в качестве супрессора пролиферации опухолевых клеток была показана в контексте раков молочной железы, простаты и уротелия [28]. Таким образом, полученные нами данные о противоопухолевой роли miR-148a хорошо согласуются с существующей литературой.
Аналогичную картину можно наблюдать для канонической формы микроРНК miR-203a: предсказанное нами взаимодействие miR-203a и SNAI2 было ранее валидировано in vitro [29], оверэкспрессия miR-203a в клеточных линиях КРР приводила к ингибированию инвазии и миграции клеток [30]. Таким образом, выявленные нами потенциальные мишени неканонической изоформы микроРНК hsa-miR-203a-3p|+1 согласуются с известными фактами о функциональной активности канонической микроРНК.
Таблица. Число предсказанных мишеней высокоэкспрессированных канонических микроРНК и соответствующих 5'-изоформ
Каноническая микроРНК 5'-изоформа Каноническая микроРНК, число мишеней 5'-изоформа, число мишеней Число общих мишеней
hsa-miR-10a-5p|0 hsa-miR-10a-5p|+1 175 103 11
hsa-miR-10b-5p|0 hsa-miR-10b-5p|+1 173 102 12
hsa-miR-22-3p|0 hsa-miR-22-3p|+1 235 235 42
hsa-miR-29a-3p|0 hsa-miR-29a-3p|-1 671 363 246
hsa-miR-101-3p|0 hsa-miR-101-3p|-1 632 694 267
hsa-miR-142-3p|0 hsa-miR-142-3p|+1 254 359 33
hsa-miR-143-3p|0 hsa-miR-143-3p|-1 351 205 118
hsa-miR-183-5p|0 hsa-miR-183-5p|+1 366 396 63
hsa-miR-192-5p|0 hsa-miR-192-5p|+1 68 76 16
hsa-miR-203a-3p|0 hsa-miR-203a-3p|+1 573 676 256
ВЫВОДЫ
Применение методов построения и анализа регуляторных сетей взаимодействий позволило нам определить роль функциональной активности некоторых 5'-изоформ микроРНК в клетках колоректального рака. Показано, что 5'-изоформы микроРНК 1т8а-т1Р-203а-3р могут
регулировать различные гены-мишени, играя при этом схожую антиопухолевую роль. Дальнейшие экспериментальные исследования, например, оверэкспрессия 5'-изоформ hsa-miR-203a-3p и других микроРНК in vitro и in vivo, необходимы для понимания молекулярных механизмов развития и прогрессирования колоректальных опухолей.
Литература
1. Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 2005; 120 (1): 15-20. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652477.
2. Agarwal V, Bell GW, Nam J-W, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 2015; 4. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26267216.
3. Garzon R, Calin GA, Croce CM. MicroRNAs in Cancer. Annu Rev Med. 2009; 60 (1): 167-79. Available from: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/19630570.
4. Nersisyan S, Shkurnikov M, Poloznikov A, Turchinovich A, Burwinkel B, Anisimov N, et al. Post-Processing Algorithm for miRNA Microarray Data. Int J Mol Sci. 2020; 21 (4). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32059403.
5. Turchinovich A, Tonevitsky AG, Cho WC, Burwinkel B. Check and mate to exosomal extracellular miRNA: new lesson from a new approach. Front Mol Biosci. 2015; 2 (APR): 11. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25988178.
6. Zhiyanov A, Nersisyan S, Tonevitsky A. Hairpin sequence and structure is associated with features of isomiR biogenesis. RNA Biol. 2021; 18 (sup1): 430-8. Available from: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/34286662.
7. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021; 71 (3): 209-49. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33538338.
8. Hill L, Browne G, Tulchinsky E. ZEB/miR-200 feedback loop: at the crossroads of signal transduction in cancer. Int J cancer. 2013; 132 (4): 745-54. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/22753312.
9. Chen B, Xia Z, Deng Y-N, Yang Y, Zhang P, Zhu H, et al. Emerging microRNA biomarkers for colorectal cancer diagnosis and prognosis. Open Biol. 2019; 9 (1): 180212. Available from: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30958116.
10. Zelli V Compagnoni C, Capelli R, Corrente A, Cornice J, Vecchiotti D, et al. Emerging Role of isomiRs in Cancer: State of the Art and Recent Advances. Genes (Basel) 2021; 12 (9). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34573429.
11. Galatenko VV, Galatenko AV, Samatov TR, Turchinovich AA, Shkurnikov MY, Makarova JA, et al. Comprehensive network of miRNA-induced intergenic interactions and a biological role of its core in cancer. Sci Rep. 2018; 8 (1): 2418. Available from: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29402894.
12. Nersisyan S, Galatenko A, Galatenko V Shkurnikov M, Tonevitsky A. miRGTF-net: Integrative miRNA-gene-TF network analysis reveals key drivers of breast cancer recurrence. PLoS One. 2021; 16 (4): e0249424. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/33852600.
13. Chen Y, Wang X. miRDB: an online database for prediction of functional microRNA targets. Nucleic Acids Res. 2020; 48 (D1): D127-31. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/31504780.
14. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 2010; 26 (1): 139-40. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19910308.
15. Sherman BT, Hao M, Qiu J, Jiao X, Baseler MW, Lane HC, et al. DAVID: a web server for functional enrichment analysis
and functional annotation of gene lists (2021 update). Nucleic Acids Res. 2022. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/35325185.
16. Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 2021; 49 (D1): D325-34. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33290552.
17. Hamidi H, Ivaska J. Every step of the way: integrins in cancer progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 2018; 18 (9): 533-48. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30002479.
18. Dudas J, Ladanyi A, Ingruber J, Steinbichler TB, Riechelmann H. Epithelial to Mesenchymal Transition: A Mechanism that Fuels Cancer Radio/Chemoresistance. Cells. 2020; 9 (2). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32059478.
19. Takahashi Y, Sawada G, Kurashige J, Matsumura T, Uchi R, Ueo H, et al. Tumor-derived tenascin-C promotes the epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer cells. Anticancer Res. 2013; 33 (5): 1927-34. Available from: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/23645740.
20. Telonis AG, Loher P, Jing Y, Londin E, Rigoutsos I. Beyond the one-locus-one-miRNA paradigm: microRNA isoforms enable deeper insights into breast cancer heterogeneity. Nucleic Acids Res. 2015; 43 (19): 9158-75. Available from: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/26400174.
21. Cimino D, De Pitta C, Orso F, Zampini M, Casara S, Penna E, et al. miR148b is a major coordinator of breast cancer progression in a relapse-associated microRNA signature by targeting ITGA5, ROCK1, PIK3CA, NRAS, and CSF1. FASEB J. 2013; 27 (3): 1223-35. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/23233531.
22. Haflidadottir BS, Bergsteinsdottir K, Praetorius C, Steingrimsson E. miR-148 regulates Mitf in melanoma cells. PLoS One. 2010; 5 (7): e11574. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/20644734.
23. Liu H, Su H, Wang X, Hao W. MiR-148a regulates bone marrow mesenchymal stem cells-mediated fracture healing by targeting insulin-like growth factor 1. J Cell Biochem. 2018. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30335895.
24. Nersisyan S, Galatenko A, Chekova M, Tonevitsky A. Hypoxia-Induced miR-148a Downregulation Contributes to Poor Survival in Colorectal Cancer. Front Genet. 2021; 12: 662468. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34135940.
25. Zhang H, Li Y, Huang Q, Ren X, Hu H, Sheng H, et al. MiR-148a promotes apoptosis by targeting Bcl-2 in colorectal cancer. Cell Death Differ. 2011; 18 (11): 1702-10. Available from: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21455217.
26. Zhao W, Zheng J, Wei G, Yang K, Wang G, Sun X. miR-148a inhibits cell proliferation and migration through targeting ErbB3 in colorectal cancer. Oncol Lett. 2019; 18 (3): 2530-6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31402949.
27. Shi L, Xi J, Xu X, Peng B, Zhang B. MiR-148a suppressed cell invasion and migration via targeting WNT10b and modulating p-catenin signaling in cisplatin-resistant colorectal cancer cells. Biomed Pharmacother. 2019; 109: 902-9. Available from: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30551544.
28. Li Y, Deng X, Zeng X, Peng X. The Role of Mir-148a in Cancer. J Cancer. 2016; 7 (10): 1233-41. Available from: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/27390598.
29. Ma X, Li L, Jia T, Chen M, Liu G, Li C, et al. miR-203a controls keratinocyte proliferation and differentiation via targeting the
stemness-associated factor ANp63 and establishing a regulatory 30. circuit with SNAI2. Biochem Biophys Res Commun. 2017; 491 (2): 241-9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/28754589.
References
1. Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes
are microRNA targets. Cell. 2005; 120 (1): 15-20. Available from: 17. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652477.
2. Agarwal V, Bell GW, Nam J-W, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 2015; 4. 18. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26267216.
3. Garzon R, Calin GA, Croce CM. MicroRNAs in Cancer. Annu Rev Med. 2009; 60 (1): 167-79. Available from: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/19630570. 19.
4. Nersisyan S, Shkurnikov M, Poloznikov A, Turchinovich A, Burwinkel B, Anisimov N, et al. Post-Processing Algorithm for miRNA Microarray Data. Int J Mol Sci. 2020; 21 (4). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32059403.
5. Turchinovich A, Tonevitsky AG, Cho WC, Burwinkel B. Check and 20. mate to exosomal extracellular miRNA: new lesson from a new approach. Front Mol Biosci. 2015; 2 (APR): 11. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25988178.
6. Zhiyanov A, Nersisyan S, Tonevitsky A. Hairpin sequence and structure is associated with features of isomiR biogenesis. RNA 21. Biol. 2021; 18 (sup1): 430-8. Available from: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/34286662.
7. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in
185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021; 71 (3): 209-49. Available 22. from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33538338.
8. Hill L, Browne G, Tulchinsky E. ZEB/miR-200 feedback loop: at the crossroads of signal transduction in cancer. Int J cancer. 2013; 132 (4): 745-54. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. 23. gov/pubmed/22753312.
9. Chen B, Xia Z, Deng Y-N, Yang Y, Zhang P, Zhu H, et al. Emerging microRNA biomarkers for colorectal cancer diagnosis and prognosis. Open Biol. 2019; 9 (1): 180212. Available from: http:// 24. www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30958116.
10. Zelli V Compagnoni C, Capelli R, Corrente A, Cornice J, Vecchiotti D, et al. Emerging Role of isomiRs in Cancer: State of the Art and Recent Advances. Genes (Basel) 2021; 12 (9). Available from: 25. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34573429.
11. Galatenko VV, Galatenko AV, Samatov TR, Turchinovich AA, Shkurnikov MY, Makarova JA, et al. Comprehensive network of miRNA-induced intergenic interactions and a biological role of its 26. core in cancer. Sci Rep. 2018; 8 (1): 2418. Available from: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29402894.
12. Nersisyan S, Galatenko A, Galatenko V, Shkurnikov M, Tonevitsky A. miRGTF-net: Integrative miRNA-gene-TF network analysis reveals 27. key drivers of breast cancer recurrence. PLoS One. 2021; 16
(4): e0249424. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/33852600.
13. Chen Y, Wang X. miRDB: an online database for prediction
of functional microRNA targets. Nucleic Acids Res. 2020; 48 28. (D1): D127-31. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/31504780.
14. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor 29. package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 2010; 26 (1): 139-40. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19910308.
15. Sherman BT, Hao M, Qiu J, Jiao X, Baseler MW, Lane HC, et al. DAVID: a web server for functional enrichment analysis
and functional annotation of gene lists (2021 update). Nucleic 30. Acids Res. 2022. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/35325185.
16. Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource:
Qian Z, Gong L, Mou Y, Han Y, Zheng S. MicroRNA-203a-3p is a candidate tumor suppressor that targets thrombospondin 2 in colorectal carcinoma. Oncol Rep. 2019; 42 (5): 1825-32. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31545460.
enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 2021; 49 (D1): D325-34. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33290552. Hamidi H, Ivaska J. Every step of the way: integrins in cancer progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 2018; 18 (9): 533-48. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30002479. Dudas J, Ladanyi A, Ingruber J, Steinbichler TB, Riechelmann H. Epithelial to Mesenchymal Transition: A Mechanism that Fuels Cancer Radio/Chemoresistance. Cells. 2020; 9 (2). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32059478. Takahashi Y, Sawada G, Kurashige J, Matsumura T, Uchi R, Ueo H, et al. Tumor-derived tenascin-C promotes the epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer cells. Anticancer Res. 2013; 33 (5): 1927-34. Available from: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/23645740.
Telonis AG, Loher P, Jing Y, Londin E, Rigoutsos I. Beyond the one-locus-one-miRNA paradigm: microRNA isoforms enable deeper insights into breast cancer heterogeneity. Nucleic Acids Res. 2015; 43 (19): 9158-75. Available from: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/26400174.
Cimino D, De Pitta C, Orso F, Zampini M, Casara S, Penna E, et al. miR148b is a major coordinator of breast cancer progression in a relapse-associated microRNA signature by targeting ITGA5, ROCK1, PIK3CA, NRAS, and CSF1. FASEB J. 2013; 27 (3): 1223-35. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/23233531.
Haflidadottir BS, Bergsteinsdottir K, Praetorius C, Steingrimsson E. miR-148 regulates Mitf in melanoma cells. PLoS One. 2010; 5 (7): e11574. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/20644734.
Liu H, Su H, Wang X, Hao W. MiR-148a regulates bone marrow mesenchymal stem cells-mediated fracture healing by targeting insulin-like growth factor 1. J Cell Biochem. 2018. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30335895. Nersisyan S, Galatenko A, Chekova M, Tonevitsky A. Hypoxia-Induced miR-148a Downregulation Contributes to Poor Survival in Colorectal Cancer. Front Genet. 2021; 12: 662468. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34135940. Zhang H, Li Y, Huang Q, Ren X, Hu H, Sheng H, et al. MiR-148a promotes apoptosis by targeting Bcl-2 in colorectal cancer. Cell Death Differ. 2011; 18 (11): 1702-10. Available from: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21455217.
Zhao W, Zheng J, Wei G, Yang K, Wang G, Sun X. miR-148a inhibits cell proliferation and migration through targeting ErbB3 in colorectal cancer. Oncol Lett. 2019; 18 (3): 2530-6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31402949. Shi L, Xi J, Xu X, Peng B, Zhang B. MiR-148a suppressed cell invasion and migration via targeting WNT10b and modulating p-catenin signaling in cisplatin-resistant colorectal cancer cells. Biomed Pharmacother. 2019; 109: 902-9. Available from: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30551544. Li Y, Deng X, Zeng X, Peng X. The Role of Mir-148a in Cancer. J Cancer. 2016; 7 (10): 1233-41. Available from: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/27390598.
Ma X, Li L, Jia T, Chen M, Liu G, Li C, et al. miR-203a controls keratinocyte proliferation and differentiation via targeting the stemness-associated factor ANp63 and establishing a regulatory circuit with SNAI2. Biochem Biophys Res Commun. 2017; 491 (2): 241-9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/28754589.
Qian Z, Gong L, Mou Y, Han Y, Zheng S. MicroRNA-203a-3p is a candidate tumor suppressor that targets thrombospondin 2 in colorectal carcinoma. Oncol Rep. 2019; 42 (5): 1825-32. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31545460.
