CC BY
15
ИЗМЕНЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ И ИОННЫХ ТОКОВ НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКОВ ПРИ ВНЕ- И ВНУТРИКЛЕТОЧНОМ ДЕЙСТВИИ СЕВОФЛУРАНА И ДЕСФЛУРАНА
А. II. Вислобоков, Э. Э. Звартау, Ю. С. Полушин, В. В. Алферова, II. Г. Буханков
CHANGES IN INTRACELLULAR POTENTIALS AND ION FLUXES ОГ NEURONS ОГ MOLLUSKS BY EXTRACELLULAR AND INTRACELLULAR ACTION ОГ SEVOFLURANE AND DESFLURANE
A. I. Vislobokov, E. E. Zvartau, Yu. S. Polushin, V. V. Alfcrova, I. G. Bukhankov
ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад. И. II. Павлова» МЗ РФ
Pavlov First Saint Petersburg State Medical University. RF
Проведены исследования изменений внутриклеточных потенциалов идентифицируемых интактных нейронов изолированной ЦНС моллюска катушки роговой (Planorbarius corneus) с помощью в ну три клеточных микроэлектродов и ионных токов изолированных нейронов катушки и прудовмка (Lymnaea sta&ialis) в условиях фиксации потенциала под влиянием десфлурана в концентрациях 1 и 10 мМ (1.2 и 12 МАК) и севофлурана в концентрациях 1 иГ> мМ (2,27 и 11.36 МАК). Через 3-5 мин от началадействия анестетиков в одних нейронах развивалась незначительная гилерполяризация (на 2-.г> мВ), а и других - деполяризация (до 10 мВ). При отмывании анестетиков в течение 5-10 мин возникала обратимая гиперполяризация.
Изменения ионных токов под влиянием анестетиков оказались более однородными, чем изменения биопотенциалов. При действии десфлу рана и севофлурана в концентрации I мМ происходило подавление амплитуд натриевых, кальциевых и калиевых токов на 40%. при этом наблюдал ось ускорение инактивации калиевых медленных токов. 11од влиянием анестетиков в концентрации 5-10 мМ происходило подавление токов на 70-80%. Оно развивалось быстро (за 20-30 с), а после их действия восстановление амплитуд ионных токовбыло замедленным (за 5-15 мин) и не всегда достигало исходных величин. Внутриклеточное действие севофлурана не подавляло ионные токи. т. е. было неэффективным.
Ключевые слова: Planorbarius corneus, Lymnaea stagnaHs. десфлуран. севофлуран, потенциал покоя, потенциал действия, импульсная активность, ионные токи.
Intercellular potentials changes of identifiable intact neurons in isolated CNS of great ramshorn (Planorbarius corneus) have been investigated with the help of intercellular microelectrodes and ion currents of isolated neurons of great ramshornsand pond snails {Lymnaea stagnaHs) with the fixation of potential influenced by desflurane in concentrations of 1 and 10 nM (1.2 и 12 MAC) and sevoflurane in concentrations of 1 and 5 mM (2.27 and 11.36 MAC). In 3-5 minutes after the start of anesthetics' action some neurons developed insignificant hyperpolarization (for 2-5 mV), and some other developed depolarization (up to 10 mV). W hen anesthetics were being washed out for 5-10 minutes the reversible depolarization appeared.
Changes in ion currents under the influence of anesthetics were more homogeneous compared to changes in biopotentials. Desflurane and sevoflurane in 1 mM concentrations suppressed amplitudes of sodium, calcium and potassium currents by 40%, and inactivation of potassium low currents was speed up. Anesthetics in the concentration of 5-10 mM suppressed currents by 70-80%. 11 developed fast (for 20-30 seconds) and after this action the amplitudes restored slowly (for 5-15 minutes)and it failed to reach the initial values in all the times. I ntercellu lar activity of sevoflurane did not suppress ion currents, i.e. it was ineffective.
Key words: Planorbarius corneus. Lymnaea stagnalis. desflurane, sevoflurane. resting potential, potential-action, impulse activity, ion currents.
Современные методики анестезии трудно представить без ингаляционных анестетиков (севофлуран. десфлуран. изофлуран. галотан и пр.). которые в качестве одного из компонентов используют как для индукции, так и для поддержания анестезии.
Показано, что они влияют на ретикулярную формацию, кору больших полушарий, клиновидное ядро п гиппоками. а также подавляют передачу возбуждения на уровне нейронов спинного мозга [8. 10]. Основной «мишенью» для молекул ингаляционных
анестетиков считаются нейроны н их синаптические контакты н головном мозге. Полагают, что. помимо прямого влияния на нервную систему с развитием картины анестезии, ингаляционные фторсодержа-щие анестетики могут обладать эффектом «прекон-дицнонирования » и повышать устойчивость клеток к ишемии 11, 12. 13].
Имеются сведения и о том. что некоторые анестетики вызывают развитие воспаления в мозговой ткани 11В], которое, предположительно, может быть одной из причин послеоперационных когнитивных нарушений.
Несмотря более чем на 200-летнюю историю применения ингаляционных анестетиков, в понимании механизма их действия остаётся много неясного. Полагают, что на молекулярном уровне имеется много общего для всех ингаляционных анестетиков. Наибольшее признание п развитие получила мембранная теория общей анестезии, которая основывается на данных о влиянии анестетиков на ионные каналы, на ионную проницаемость мембран нервных клеток. Установлено также, что общие анестетики в дозах, которые существенно не влияют на электрогенез мембран нейронов, оказывают выраженное тормозящее действие на ире-сшоптическом и ностсинаптическом уровнях. Однако в деталях молекулярный механизм угнетения возбудимости нейронов п торможения транссинан-тической передачи под влиянием анестетиков исследован недостаточно. Одно ясно, что конечный эффект действия ингаляционных анестетиков зависит от достижения терапевтической концентрации в ткани головного мозга, а синапсы являются ключевым звеном рефлекторных ценен и подвержены влиянию различного рода эндогенных и экзогенных факторов.
Основными электрофизиологическими параметрами функционального состояния нейронов являются потенциал покоя (ПИ), потенциал действия (ПД), синаптические потенциалы и трансмембранные ионные токи. Уровень МП характеризует состояние нейрона и существенно определяет его деятельность: возбудимость, генерацию ПД, межнейронные взаимоотношения. За последние 20-30 лет многостороннее влияние ингаляционных общих анестетиков на биологические объекты отражено в очень большом числе публикаций [9-15. 17—20]. Тем не менее сравнительных конкретных сведений об изменениях данных параметров иод влиянием разных анестетиков на одном объекте в литературе недостаточно. Недостаточно н работ, отражающих эффекты последействия и восстановления функционального состояния нейронов после выведения анестетика. Поэтому исследования в этих направлениях по-прежнему представляют интерес.
Цель - с использованием экспериментальной модели нейронов моллюсков, позволяющей
изучать изменения их функционального состояния при действии фармакологических средств, получить собственные данные о динамике изменений биопотенциалов и ионных токов под влиянием ингаляционных анестетиков севофлурана и десфлурана.
Материалы н методы
В качестве исследуемых средств выбраны наиболее востребованные фторсодержащие общие анестетики десфлуран и севофлуран. Использованы эспериментальные подходы, апробированные в течение многих лет в отделе нейрофармаколо-гии Института фармакологии им. А. И. Вал ьд май а ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. М. II. Павлова» при изучении эффектов мембраноактивных соединений различных групп [1,3].
Микроэлектродиые исследовамня 11роведены на идентифицируемых (100-200 мкм) интактных нейронах изолированной Ц11С (рис. 1а) моллюска катушки роговой (Р1апогЬапи$ сотет). В физиологический раствор вводил и десфлуран и севофлуран до насыщения - около 10 мМ десфлурана н 5 мМ севофлурана 115], а затем разбавляли до 1 мМ и изучали их действие при внеклеточном приложении. Если анализировать эффекты десфлурана и севофлурана. показанные в литературе на нейронах моллюска прудовика [6] или мышечных клетках 118], и эффективные концентрации анестетиков, применяемые авторами, то в большинстве случаев они составляли около 1 МАК, хотя в условиях клиники величина МАК подбирается индивидуально. Значения величин МАК и их соотношения с используемыми концентрациями анестетиков следующие: для десфлурана 1 МАК = 7,2% = 0,83 мМ (и тогда 1 мМ = 1.2 МЛ К; 10 мМ = 12 МАК), а для севофлурана 1 МАК = 2,4% = 0,44 мМ (а I мМ = 2.27 МАК; 5 мМ = 11,36 МАК). Использовали и высокие концентрации анестетиков (около 10 МАК) в целях оценки их возможного токсического действия.
Эксперименты начинались с того, что из тела моллюска вырезали кольцо ганглиев и помещали в маленькую камеру с раствором объёмом около 0,5см3, содержащим (в мМ/л) ЫаС1 - 50: КС1 - 2; СаС12- 4; М&С12- 1,5; трис-ОН - 10; рН - 7.5. Для регистрации электрофизиологических характеристик нейронов использовали стеклянные микроэлектроды (МЭ), заполненные 2.5 М КС1. с сопротивлением 10-20 мОм [1.2].
Эксперименты проведены на 11 экземплярах ЦИС, зарегистрированы электрическая активность и сё изменения при действии севофлурана и десфлурана на 24 нейронах педальных и висцерального ганглиев. При этом влияние каждого анестетика в различных концентрациях исследовали как на различных нейронах, так и на одном и том же нейроне.
6 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
V/V0, %
8
_L
_L
m
1
8
J
Норма 1 мМ (m) 1 мМ (дп) 5 мМ (гп) 5 мМ ;дп)
Севофлурзн 1 мМ Контроль
Севофлурзн 5 мМ
Отмывание
•2мБ
2 мин
^ s
Контроль
Отмывание
д Контроль
Рис. 1. Динамика изменений электрической активности нейронов катушки иод влиянием севофлурана; а - идентифицируемые нейроны педальных ганглиев Ш 1С (ЛПед1 и ППед1): 6 - изменения потенциала покоя (ди - деполяризация, гп - гиперполярхнация) нейронов под влиянием севофлурана в концентрациях 1 и 5 мМ (графикпостроен на основании данных табл. 2); вертикальными отрезками обозначены доверительные 95%-ные интервалы, рассчитанные методом Бутстрапа для среднего арифметического. Цифры на столбиках гистограмм - количество воздействий. * - статистически значимые отличия от исходного значения (от нормы) на уровне р < 0.05 (парный тест Унлкоксона FDR поправка на множественность сравнений). По оси ординат: V- ПН при действии СФ. Vn- в норме; по оси абсцисс - концентрация; в - нейрон ППед1. г - нейрон ЛПед1. д- нейрон Л Пед1, подругой катушки и в «плохом* исходном функциональном состоянии (I III около-45 мВ)
Оценивали динамику изменений НИ. импульсной активности (ИЛ) и параметров ПД.
При измерениях трансмембранных ионных токов применяли метод внутриклеточного диализа изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала |1. 3]. Для изготовления микропинетки с порой использовали тонкую полиэтиленовую трубку длиной Л см, сгибали ее V-образно в струе горячего воздуха, на сгибе тонкой стальной проволочкой формировали выступ. Затем на вершине выступа иод бинокулярной лупой иглой делали отверстие. Изготовленную микропинетку соединяли с системой трубочек для подачи Анализирующего раствора (табл. I). Но величине сопротивления (200-300 кОм) оценивали диаметр отверстия (3-5 мкм) и пригодность микропипетки для работы.
Изолированную живую клетку помещали на полиэтиленовую пинетку, к которой создавали толчки отрицательного гидростатического давления, вследствие чего в области поры мембрана нейрона разрушалась и создавался электрический контакт неиоляризующегося электрода, соединённого с усилителем фиксации потенциала, с внутриклеточным содержимым. Перфузирующип раствор (табл. 1). в который добавляли исследуемые вещества, подавался в камеру, где находился нейрон на полиэтиленовой микропипетке, адиализирующий, п который добавляли севофлуран. - внутрь этой пипетки.
Биопотенциалы регистрировали с помощью аналого-цифрового преобразователя (А ЦГ1) фирмы «L-Card» L-791 (Россия). Ионные токи регистрировали с помощью другого АЦП-ЦАП и компьютерной программы Clamp, разработанной для этой цели.
Статистическую обработку изменений параметров электрической активности нейронов проводили с помощью фрагмента программы Bioactivity Recorder v5.32b [5], встроенной в программу для обслуживания АIПI L-791. а амплитуд ионных токов - с использованием статистической программы R [16|. Применён непараметрический тест Фридмана для связанных выборок. Анализ post hoc проведён в виде парных сравнений полученных измерений с исходной точкой (нормой) с помощью
непараметрического теста Уилкоксона для связанных выборок с поправкой FDR на множественность сравнений.
Результаты п обсуждение
Изменения биопотенциалов иитактных нейронов изолированной ЦНС катушки.
/. Эффекты севофлуран а. В контроле МП нейронов составлял -58,3 ± 2.7 мВ (п =17). что свидетельствует об их «хорошем» функциональном состоянии. Изменения INI для различных исследованных нейронов под влиянием анестетиков представлены в табл. 2. Севофлуран в концентрации 1 мМ вызывал незначительные и разнонаправленные изменения ПИ: гиперполяризацию на -4,8 ± 53 мВ (табл. 2. п = 6; рис. 1б) или столь же незначительную деполяризацию на 3,5 ± 2.8 мВ (табл. 2. п = 4; рис. 1г).
Перестраивалась МЛ нейронов: при гинерполя-ризации наблюдалось еёурежение, при деполяризации - учащение, возникали пачки ПД. параметры ПД изменялись незначительно. Изменения были обратимы. В концентрации 5 мМ севофлуран вызывал значительную (на 10.4 ± 6,5 мВ) деполяризацию (табл. 2. п = 8) с учащением IÍA, существенным снижением амплитуд ПД, вплоть до прекращения активности (рис. 1ви 1г). Па фоне длительного (более 5 мин) действия анестетика в 35% случаев в нейронах возникала пшерполярнзация на-5,7 ± 1.4 мВ (табл. 2. п = в), которая в течение 5-7 мин продолжалась и при отмывании до -6.6 ± 2.1 мВ (табл. 2. п = 8: рис. 1 в). По мере отмывания севофлурана 1111 постепенно восстанавливался до исходных величин, возникали редкие ПД с восстановлением характера ИЛ к контролю.
Полученные данные об изменениях ПП различных нейронов под влиянием СФ в концентрациях 1 н 5 мМ были разделены на 4 группы и представлены на рис. 1б: 1) нейроны, в которых возникала гиперполяризация при действии 1 мМ СФ - 1 мМ (гп); 2) деполяризация при действии 1 мМ - 1 мМ (дп); 3) гиперполяризация при действии Г> мМ - 5 мМ (гп) и 4) деполяризация
Таблица 1
Ионный состав растворов для изолированных нейронов (в мМ)
Регистрируемые токи NaCl CsCl Caá MgCl, KCl трис-ОН pH
Внеклеточные (перфузнрующие) растворы
Суммарный входящий 100 - 2 1,5 5 10 7,5
Кальциевый входящий - 100 10 1,5 - 10 7,5
Натриевый входящий 110 - - 1,5 - 10 7.5
Калиевые выходящие 100 - 2 1,5 5 10 7,5
Внутриклеточные (диализируюшне) растворы
Входящие - 120 - - - 10 7.4
Калиевые выходящие - - - - 120 10 7,4
Таблица 2
Изменения 1111 нейронов при действий и отмывании ингаляционных анестетиков (и мВ)
Контроль. ПП. N(3 Севофлуран Десфлуран
№ п п Нейрон 1 мМ 5 мМ Отмыв 5 мин 1 мМ 10 мМ Отмыв 5 мин
1 ЛПед1 -63.1 +2 (-3,17) 0 0
2 ППел1 -59,2 +3 (-5,07) -6 (-10.14) 0
3 ППел2 -59,6 -2 (+3,36) -15 (-25.17) +3
4 ЛПед1 -69,5 -2 (+2.88) 0 -5
5 ЛПед1 -60.1 +3 (-4,99) +15 (-24,96) -7
6 ППел1 -49,4 -1.5 (+3.04) -2 (-2,13) -5
7 ППел1 -49.4 +6 (-12,14) +2 (-2,13) 0
3 В1 -60.9 -4 (+6,57) -4 (-6.57) 0 -1 -4 0
9 В1 -61.0 -6 (-9.84) 0
10 ППед1 -60.9 -8 (+13,14) -12 -4 -6
11 ЛПея1 -53,6 0 -25 (-46.64) 0 +7 -7
12 ППед1 -57,9 -6 (+10.36) 0 -1 +10 0
13 ППел1 -54,1 -3 (+5,54) +8 (-14,79) -6
14 ЛПел1 -63,5 -3 (+4,72) -5 (+7,87) 0 -9 -6
15 ППел1 -56.6 0 -4
16 ЛПед1 -59,2 -5 (-8,45) -8
17 ППелЗ -53,2 -10 (-18,80) -7
Примечание: ЛПед, ППед- левый п правый педальные ганглии. В - висцеральный: цифры - номера идентифицируемых нейронов. (+) - деполяризация нейрона, (-) - пшерноляризация. (0) - ПП на уровне контроля: в скобках - изменения в%к контролю.
при действии 5 мМ - 5 мМ (ди). 11а рис. 1 г показана общая картина изменений электрической активности нейрона ЛПед1 под влиянием севофлурана. а результаты обработки этих изменений для нескольких дополнительных параметров - в табл. 3.
В ряде случаев при действии анестетика в концентрации 5 мМ развивалась только деполяризация нейронов, которая сохранялась и при отмывании (рис. 1г). 11а некоторых нейронах могла наблюдаться двоякая реакция - как де-. так и гиперполяризация.
На нейронах с низким исходным уровнем ПИ (-45-50 мВ) севофлуран в концентрации 1 мМ. вследствие возникающей в них гинерполяризации. мог оказывать «восстанавливающее», активирующее действие (рис. 1д). При отмывании эффект усиливался. Из рисунка видно, что севофлуран в концентрации .5 мМ на этом нейроне вызывал деполяризацию. ИЛ подавлялась, на фоне увеличения частоты 11Д их амплитуда снижалась, длительность ПД возрастала, возникали пачки ПД, и. вследствие развивающейся далее гиперполяризации, генерация
Таблица 3
Параметры изменений ИЛ нейрона ЛПед!. представленной на рис. 1г. под влиянием севофлурана
Параметры Контроль (100%) Концентрация. мМ
1 5 Отмывание
%
Средняя частота (имп/с) 0.24 ±0.30 64.50 ±46,7 1 659.47 ±1 223,3 452.81 ±416,7
Средний период (мс) 4 005 ±5 039,6 156.00 ±116,01 6.17 ±4.47 22.60 ±20,51
Средняя амплитуда (мВ) 85,4 102,00 51.68 81.50
Самый короткий интервал (мс) 144,6 233,96 58.23 101.24
Самый длинный интервал (мс) 17 651.2 115.18 18.14 53.55
Общее число ПД (и) 39 51 518 338
ПД прекращалась. При отмывании возникала более существенная гиперполяризация, после которой, по мере восстановления IIII к исходному уровню, генерация ПД восстанавливалась.
2. Эффекты десфлурана. Влияние десфлура-на на электрическую активность нейронов было сходным с влиянием севофлурана. В концентрации 1 мМ десфлуран (п = 2) также вызывал незначительную гиперноляризацию (табл. 2. рис. 2а). В концентрации 10 мМ в нейронах возникала значительная (до 10 мВ) деполяризация (п = 3) с учащением ПЛ. снижением амплитуд ПД, прекращением активности (рис. 2а). Параметры ПД под влиянием десфлурана претерпевали существенные изменения: помимо снижения амплитуды, возрастала их длительность, при отмывании параметры ПД восстанавливались до исходных значений (рис. 2а. 1-3). возникала гиперполяризация н ИЛ постепенно приходила к норме. I Ja некоторых нейронах (табл. 2. п = 2) влияние десфлурана в высокой концентрации после начальной деполяризации сопровождалось гиперполяризацией и особенно вы-раженно - при отмывании (табл. 2. п = 3; рис. 26).
Следует отметить, что под влиянием обоих анестетиков существенно перестраивался характер ИЛ (рис. 1 и 2).
3. Эффекты тетраэтиламмония (ТЭА).
В целях анализа и сравнения вариантов изменений электрической активности нейронов под влиянием севофлурана н десфлурана с эффектами некоторых других каналоблокнрующих веществ проведены отдельные эксперименты (п = 1) с демонстрацией влияния на нейроны ТЭА в концентрации 10 мМ.
Под влиянием ТЭА (рис. 3) возникала небольшая деполяризация нейрона, возрастала частота МЛ. снижалась амплитуда ПД и значительно (в 2-3 раза) увеличивалась их длительность (рис. 3. 1-3). Такое увеличение длительности ПД (при равном подавлении амплитуды ПД ТЕА и севофлураном) и отсутствие заметных изменений ПИ. а также отсутствие гнперполяризацин при от-мыванни ТЭА (рис. 3) было су 11дестве! шо отличным от действия анестетиков.
Изменения трансмембранных ионных токов изолированных нейронов прудовика и катушки. В предварительных экспериментах показано, что
а
:
I \
\ 12 М81_ V 15 мс IV
1 (контроль) 2 (десфлуран 10 мМ)
3 (отмыаание)
Контроль Десфлуран 10 мМ
Отмывание
12 мВ
2 мин
Рис. 2. Изменения электрической активности нейронов катушки под влиянием десфлурана: а - нейрон ППед1:1-3 - изменения параметров ПД нейрона (фрагмент записи на а - развертка во времени); 6 - нейрон Л Нед 1
Контроль
Десфлуран 1 мМ
Десфлуран 10 мМ
Отмы&зние Севофлуран 5 мМ
Контроле
Отмывзн/е
12 мВ|_
20 мс
1 (контроль-
2 (влияние ТЗА 10 мМ)
3 (отмывание)
Рис. 3. Изменения электрической активности нейронов катушки под влиянием ТЭА. Нейрон Л11ед1: 1-3 - изменения параметров ПД нейрона (фрагменты записи сверху - развертка во времени)
реакции нейронов на действие севофлураиа и дес-флурана были похожими, поэтому в последующих экспериментах подробно изучали изменения ионных токов только под влиянием севофлураиа в концентрациях 0.5; 1.0:2.5 и 5 мМ. Изменения амплитуд суммарных входящих (натрий-кальциевых) и выходящих калиевых медленных токов представлены на рис. 4. Отчетливо нпдиа зависимость подавления амплитуд всех токов от концентрации. Пример обратимого подавления натриевых токов показан на рис. 5а, а суммарных входящих натрий-кальциевых п выходящих калиевых медленных токов (без изменения их кинетики активации и инактивации ) - на рис. 56 и 5в. 11одавление выходящих быстрых калиевых токов показано на рис. 5в (в левой части рис.). а существенное ускорение инактивации калиевых медленных токов при действии севофлураиа в концентрации I мМ - в правой части рис. 5в.
2 и почти полное подавление тока под его влиянием в концентрации 5 мМ - на рис. 5в, 3. Восстановление амплитуд ионных токов после действия севофлураиа в концентрациях 0,5; 1 и 2,5 мМ до исходных значений происходит полностью за 5-8 мин, а в концентрации 5 мМ - за 10-15 мин и не полностью (до 70-80%).
В отдельной серии экспериментов на 4 изолированных нейронах севофлуран подавали с диалнзн-рующим внутриклеточным раствором (на внутреннюю сторону мембраны). Оказалось, что при этом он не оказывал подавляющего действия на ионные токи. Однако добавление севофлураиа дополнительно и с наружной стороны приводило к подавлению токов в концентрации 1 мМ и тем более - в концентрации 5 мМ. Отмывание севофлураиа с наружной и внутренней стороны мембраны нейронов приводило к частичному восстановлению
120 г-
100
*50
П
% 60 2 О
~ 40
20
22
т
12
Норма
0.5
*
I
I
1
С. мМ
2.5
120 г-
100 S0
2 ео
о 2
40
20
и *
1
■ ■ ■
т
24 • 13 1 6 1 12 I I 9 I
Норма
0.5
1
С. мМ
2.5
Рис. 4. Зависимости концентрация - эффект для входящих и выходящих токов при действии севофлураиа: а - натрий-кальциевые токи; б - калиевые медленные токи. I - токи при действии. 10 - в норме. Вертикальными отрезками обозначены доверительные 95%-ные интервалы, рассчитанные методом Бутстрапа для среднего арифметического. Цифры на столбиках гистограмм - количество измерений. *. ** - статистически значимые отличия от исходного значения (от нормы) на уровне р < 0.05 или р < 0.01 (парный тест Уилкоксона. FDR поправка на множественность сравнений)
Рис. 5. Примеры изменений амплитуд и кинетики развития ионных токов иод влиянием севофлурана; а - изменения натриевых токов: 1 - контроль. 2 - севофлуран 5 мМ, 3 - отмывание; 6 - входящие натри й-кальциевые (в левой часто кривых) и выходящие медленные калиевые токи (в правой части): 1 - контроль. 2 - севофлуран 1 мМ, 3 - отмывание: в - характер изменений амплитуды и кинетики (активации и инактивации) калиевого медленного тока: 1 - контроль. 2 - 1 мМ, 3-5 мМ, 4 - отмывание: г - подавление севофлураном быстрого калиевого тока (в левой части кривых) и ускорение инактивации медленного калиевого тока (в правой части, кривая 2): 1 - контроль. 2 - 1 мМ, 3-5 мМ. По оси абсцисс - а - потенциал и время (пилообразное смещение потенциала от-40 до 10 мВ в течение 20 мс): 6 - время: иооси ординат - ионные токи. Поддерживаемый потенциал -90 мВ. тестирующие: на а - от -40 до 10 мВ. на 6-г - 1-я ступенька (Т1) - 0 мВ. 2-я (Т2) - 30 мВ
ионных токов. I Годного восстановления не происходило потому, что севофлуран в концентрации 5 мМ оказывал «повреждающее» действие на нейроны. Характерный пример таких эффектов представлен на рис. 6.
До настоящего времени не существует единой общепризнанной теории действия анестетиков [20|. По этой причине продолжают исследования их влияния на организм, в том числе на клеточ-но-молекулярном уровне,уточняют молекулярные
Рис. 6. Различия в подавлении ионных токов севофлураном при его действии с наружной (б) и внутренней (б) сторон мембраны нейронов: а - внеклеточное действие: 1 - контроль. 2 - СФ 1 мМ. 3 - 5 мМ. 4 - отмывание: б - внутриклеточное действие: 1 - контроль, 2 - СФ 5 мМ изнутри (2 мин). 3 - 5 мМ (3 мин). 4-5 мМ (4 мин) + СФ 1 мМ снаружи. 5-5 мМ (6 мин) + СФ 5 мМ снаружи. 6 - отмывание СФ изнутри и снаружи 3 мин. По оси абсцисс: время: но оси ординат - ионные токи. Поддерживаемый потенциал -90 мВ. тестирующие: 1-я ступенька (Т1) - 0 мВ, 2-я (Т2) - 30 мВ
механизмы и места связывания в клетке. Лиганд-за-внсимые ионные каналы, глициновые рецепторы, нейрональные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы. рецепторы ЫМГ)Л и глутамата, а также потенциалозависимые ионные каналы (кальциевые, калиевые и натриевые) рассматривают как молекулярные мишени |7.9. 11. 11. 15] для различных ингаляционных анестетиков, подавляющих амплитуды потенциалов и ионные токи. Блокада нреси-нантнческих ПД, связанных с Ыа+ и Са2'-каналами. приводит к уменьшению выброса нейромедиаторов 17— 11.11.15,17.19]. Характер подавления ионных токов различными ингаляционными анестетиками неодинаков. Например, для натриевых каналов но степени подавления они располагаются в ряд: га-лотан > изофлуран = севофлуран > энфлуран > дес-флуран [15].
Гнпериоляризацня клеточных мембран при действии десфлурана и севофлурана может быть связана с активацией электрогенного транспорта ионов натрия, со снижением пассивной проницаемости мембраны к ионам натрия или увеличением проницаемости к ионам калия. Деполяризация клеток может объясняться подавлением электрогенной части в работе натр и й-калиевого насоса и с изменениями пассивной проницаемости клеточных мембран к ионам натрия и калия, в особенности в концентрациях 5-10 мМ. Снижение частоты ИЛ при гнперполяризации клеток, вероятно, обусловлено снижением возбудимости клеток как вследствие самой гиперноляризацни.так и блокированием анестетиками части каналов входящего тока для ионов натрия н кальция. Увеличение частоты ИА при деполяризации связано преимущественно с повышением возбудимости нейронов, со снижением критического уровня деполяризации для возникновения ПД. Отчасти последним обусловлена н генерация пачек импульсов под влиянием анестетиков, что может вести к усиленному выбросу медиаторов.
Подавление амплитуд ионных токов может происходить из-за непосредственного блокирования ионных каналов для соответствующих ионов (натрия, кальция и калия), нельзя исключить и насыщение анестетиками лнгшдной фазы мембран и нарушение функций ионных каналов. Так, для натриевых каналов (Ыа\г1.4) величина ЕС-50 для севофлурана составляет 1.21 ± 0,03 мМ. десфлурана - 1,68 ± 0.09 мМ 115]. а в наших экспериментах для суммарных входящих токов (рис. 4а) порядка 3 мМ - различия не такие уж существенные. Ускорение инактивации калиевых медленных токов может прямо свидетельствовать о том. что при открывании каналов анестетики входят в открытые каналы и снижают амплитуду токов. Результаты наших экспериментов демонстрируют, что под влиянием ингаляционных анестетиков длительность ПД увеличивается в меньшей степени, чем при действии ТЭА. что можно объяснить тем,
что анестетики примерно в равной степени подавляют как натрий-кальциевые, так н калиевые токи, а ТЭА - преимущественно калиевые медленные токи (данные литературы и рис. 2а. 2 и рис. 3.2).
В целом полученные результаты согласуются с известными из литературы фактами как но эффектам прямого воздействия на нервные клетки, так и но диапазону эффективных концентраций ингаляционных анестетиков. Однако неэффективность подавления ионных токов севофлураном при его внутриклеточном приложении к внутренней стороне мембраны нейронов но сравнению с его эффективностью при внеклеточном действии, на наш взгляд, является принципиально важным. Это означает. что мишеней для севофлурана на внутренней стороне мембраны нет или они недоступны. В литературе подобных фактов для севофлурана не обнаружили. 11а основании результатов настоящей работы и учитывая данные литературы можно говорить о тройственном электрофизиологическом действии севофлурана на нейроны: гиперполяризация клеток, незначительное подавление ионных токов (блокирование ионных каналов), снижение эффективности синаитических взаимодействий. В совокупности эти эффекты способствуют снижению возбудимости нейронов, подавлению активности нейронных сетей, притормаживанию («успокоению») их деятельности, что может быть ассоциировано со способностью препарата отключать сознание. Предложенная экспериментальная модель может быть использована для углубленного изучения клеточных механизмов действия ингаляционных анестетиков, а также для сравнительных исследований общих анестетиков разных групп н экстраполяции клеточных данных на системный уровень.
Выводы
1. Ингаляционные анестетики десфлуран и севофлуран дозозависимо и обратимо изменяют электрическую активность нейронов моллюсков. В концентрации 1 мМ примерно равноэффективно для обоих анестетиков н обратимо они вызывают гипер- ( на 63 ± 2,3% от контроля ) или деполяризацию нейронов на4,4 ± 2.2%. При гиперполяризации снижается частота ИА. при деполяризации она возрастает. параметры ПД изменяются незначительно. Па нейронах с низким исходным уровнем функционального состояния вследствие гнперполяризации анестетики в малой концентрации оказывают «активирующее» действие - улучшающее исходное состояние.
2. Севофлуран в концентрации 5 мМ обратимо деполяризуют нейроны на 9,4 ± 2.2% от контроля, при этом возрастает частота МЛ. снижается амплитуда ПД. возрастает их длительность и иногда может полностью подавляться генерация 11Д. 11а фойе
действия севофлураиа в концентрации 5 мМ развивается обратимая гиперполяризация нейронов до 18.1 ± 16.9%. Десфлуран в концентрации 10 мМ оказывает действие, подобное севофлурану в концентрации 5 мМ. При отмывании и после длительного (более 5 мин) действия анестетиков может возникать выраженная гиперполяризация нейронов.
3. Ингаляционные анестетики могут обратимо инициировать генерацию пачек ПД.
4. Севофлуран (как и десфлуран) в концентрациях от 0,5 до 5 мМ обратимо и в зависимости от концентрации примерно в равной степени подавляет натриевые. кальциевые и калиевые ионные токи (в концентрации 5 мМ - на 70-90% от контроля).
5. Севофлуран подавляет ионные токи только при его внеклеточном приложении (с наружной стороны мембраны) и неэффективен при внутриклеточном (с внутренней стороны) даже в концентрации 5 мМ.
ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:
ГБОУВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. II. Павлова* Минздрава РФ 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8. Тел. 8 ($12)499-71-02. *
Вислобоков Анатолий Иванович
доктор биологических паук. заведующий отделом нейрофармакологии, старший научный сотрудник института фармакологии им. А. В. Вальдмана E-mail: [email protected]
Звартау Эдвин Эдуардович
доктор медищшсхих паук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии. директор Института фармакологии им. А. В. Вальдмана. E-mail: [email protected]. [email protected]
Полу шин Юрий Сергеевич
член-корреспондент РАН. доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой анестезиологии и реаниматологии, проректор по научной работе, руководитель научно- клинического центра анестезиологии и реаниматологии. E-mail: polushin 1 ®gmail.com
Алферова Владислава Владимировна
клинический о{х}ина:пор кафедры анестезиологии и реаниматологии.
Буханков Иван Григорьевич
заведующий отделением анестезиологии-реанимации наугно-клинического центра анестезиологии и реаниматологии.
Литература
1. Вислобоков А. И > Игнатов Ю. Д.> Галенко-Ярошевский П. А. и др. Мембранотрашое действие фармакологических средств. - СПб. - Краснодар: Просвещение-Юг, 2010. - 528 с
2. Вислобоков А. И, Игнатов Ю. Д.,Середенин С. Б. Изменения электрической активности нейронов под влиянием афобаюла // Эка1ер. и клин, фарм. - 2012. - Т. 75, № 6. - С 3-7.
3. Вислобоков А. И., Шабанов П. Д. Клеточные и молекулярные механизмы действия лекарств. - Серия: Цигс-фармакология. - 'Г. 2. - СПб.: Информ- Навигатор. 2014. - 624 с.
4 Лихванцев В. В, Ильин Ю. В.. Шмелева Е. А. и др Влияние выбора метода анестезии на возникновение и развитие расстройств сознания в послеоперационном периоде у пациентов с церебро-васкулярной недостаточностью// Вест анестезиол. и реаниматол. - 2014. - С. S-15.
5. Толкунов Ю. А., Сибаров Д. А., Фролов Д С. Активность первичных афферентных нейронов гонкой кишки при действии гистамнна модулируется дефенехном HNP-1 // Сенсорн. сист. - 2009. - Т. 23. МП.-С. 79-86.
& Hamakawa Т., Feng Z. P., Grigortv N. et al. Sevoflurane induced suppression of inhibitory synaptic transmission between soma-soma paired Lymnaea neurons//1. Neurophyslol. - 1W9. - Vol. 82. X* 5. - P 2812-2819.
7. Hemmlngs H. C. Neuroprotection by Na* channel blockade if J. Neurosurg. AnesthesioL - 2004. - Vol. 16, - P. 100-101.
8. Hemmlngs H. C. Sodium channels and the synaptic mechanisms of Inhaled anaesthetics // British. I. Anaesthesia. - 2009. - Vol. 103, № I. - P. 61-69.
9. Hlrota K., Fud)lmura J., Wakasi^i M.»Ito Y. Isoflurane and sevoflurane modulate inactlvation kinetics of Ca3* currents in single bullfrog atrial mlocytes // Anesteslol. - 1996 - VoL 54,№ 2. - P. 377-3*3.
10. Hlrota K., Roth & H. The effects of sevoflurane со population spikes in CA1 and dentate gyrus of the rat hlppxampus in vitro // Anesth, Analg - 1997. -VoL 85.-P.426-430.
11. Kamatchl G. L.,Chan C K.,Snutch T. et al. Volatile anesthetic inhibition of neuronal Ca' channel currents expressed In Xenopuscccytes // Brain Res. -1999. - Vol. 831. - R 85-9&
12. Landonl G.y Blondl-Zoccal G. G. L.> Zangrillo A et al. Destlurane and sevoflurane In cardiac surgery: a meta-analysis of randomized clinical trials // J. Cardiothoraclc and Vascular Anesthesia. - 2007. - VoL 21, № 4. -P. 502-511.
13. Landonl G.. Fochl O., Tritapepe L. et aL Cardiac protection by volatile anesthetics // Minerva AnestesloL - 2009. - VoL 75, № 5. - R 269-273.
14. Namba T., Ishil T. M, Ikeda M. et al. Inhibition of the human intermediate conductance Ca2*-activated K' channel, hIKl, by volatile anesthetics // Eur. J. Pharmacol. - 2000. - Vd. 395, ># 2. - P. 95-101.
15. Ouyang W., Herold K. F., Hemmlngs H. C. Comparative effects of halogen at ed inhaled anesthetics on wltage-gated Na- channel function // AnesthesloL -2009. - VoL 110, >* 3. - P 582-590.
16l R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R foundation for statistical computing, Vienna. Austria. - 2014. URL hup:/; ww w. R-pro4ea.org,».
17. Welgt H. U„ Kwok W. M., Rehmert G. C. et aL Voltagedependent effects of volatile anesthetics on cardiac sodium current // Anesth. Analg - 1997. -VoL 84. - R 285-293.
1S. Wu X., Lu Y., Dong Y. et al. The InhalaUon anestheUc isoilurane increases levels of proinflammatory TNF-o, IL-6,andIL-l|?//Neuroblol Agings-2012.-VoL 33. -R 1364-1378.
19. Wulf H., Ledowski T., Llnstedt U. et al. Neuromuscular blocking effects of rocuronlum during destlurane, Isoflurane, and sevoflurane anaesthesia // Can. I. Anaesth. - 1998. - VoL 45. - P. 526-532.
20. Young C. J„ Apfelbaum J.L Inhalatlonal anesthetics: destlurane and sevoflurane // J. Clinic. Anesth. - 1995. - VoL 7. - R 564-577.
References
1. Vlslobokov A.I., Ignatov Yu.D., Galenko-Yaroshevsky P.A. et al. Membranotropnoyedeistviyepharmakotogtcheskikh sredstv. [Membrane-acting action of pharmaceutical substances). SPb., Krasnodar, Prosveschenlye Yug PubL> 2010,528 p.
2. Vlslobokov AI., Ignatov Yu.D., Seredenin S.B. Changes of neuron electric activity under aphctazolum action. Eksper. i ktin.f<rm. 2012, vol. 75, no 6, pp. 3-7. (In Russ.)
3. Vlslobokov A.I., Shabanov P.D. fOetochnye I molekufyarnye mekhanizmy deistviya lekarstv. Seriya: Tsitopharmakologiya. (Cellular and molecular mechanisms of drug acUons. Series: Cytopharmacolog y ). vol 2» St Petersburg, Infomi-Navjgator Publ.,624 p.
4. LlkhvantsevV.V.,Ilyln Yu.V.,ShmdevaEA. etal. Impact cl anesthesia method onbegtnntngand progression of consciousness disorders in postoperative period in patients with cerebral vascular Insufficiency. VestnikAnastezlol. I Reanimate no6,2014,pp. S-IS. (In Russ.)
5. Tolkunov Yu.A„ Slbarov DA., Frolov DS. Action of primary afferent neurons of the small bowd is modulated by HNP-1 defensln by the histamine action. Sensorn. Sis:.y 2009, vol. 23, no. 1, pp. 79-86. (In Russ.)
6. Hamakawa T., Feng Z.P., Grlgorlv N. et aL Sevoflurane induced suppression of inhibitory synaptic transmission between soma-soma paired Lvmnaea neurons. I. NeurophvsloL 1999, vol. 82, no. 5. pp. 2812-2819.
7. Heminlngs H.C. Neuroprotection by Na* channel blockade. /. Seurosurg. Anesthesioi. 3304, vol. 16. pp. 100-101.
8. Hemming* H.C. Sodium channels and the svnapuc mechanisms of Inhaled anaesthetics. British. /. Anaesthesia. 2C09, vol. 103, no. 1, pp. 61 -69.
9. Hlrota K., Fudllmura I, Wakasugl M, Ito Y. Isotlurane and sevoflurane modulate inacUvatlon kinetics of Ca2* currents in single bullfrog atrial mlocytes. Ancstcslol 1996, voL 84, no 2, pp. 377-383.
10. Hlrota K., Roth S.H. The effects of sevollurane on populaUon spikes in CA1
and dentate gyrus of the rat hippxampus in vitro. Anesth. AncJg. 1997, vol. 85, pp. 426-430.
11. Kamatchi G.L., Chan C.K., Snutch T. et al. Volatile anesthetic inhibition of neuronal Ca" channel currents expressed In Xenopus oocytes. Brain Res. 1999, voL 831, pp. 85-96
12. La ndonl G„ Biondi-Zoccai G.G. L, Zangrlib A. et a 1. Destlurane and se voflura ne m cardiac surgery, a meta-analysis of randomized clinical trials /. CaJirthoHKic and Vascular Anesthesia. 2007, vol. 21, no. 4, pp. 502-511.
13. Landonl G„ FcchlO.,Trltapepe L. etaL Cardiac protection by volaUle anesthetics. Minerva Anestesioi 2009, vol. 75, no. 5, pp. 269-273.
14. Namba T., Ishll T.M., Ikeda M. et al. Inhibition of the human intermediate conductance Ca2*-acUvated K- channel. hIKl, by volatile anesthetics. Eur. /. Pharmacol. 2000, wl. 395, no. 2, pp. 95-101.
15. Ouyang W„ Hero-Id K.F., HemmlngsH.C. Comparativeeffectso-f halogenated inhaled anesthetics on wltagje-gated Na- channel function. Anesthesioi 2C09, vol. 110, no. 3, pp. 582-590.
16. R Core Team. R- A language and environment for statlsUcal computing. R foundation for statistical computing. Vienna, Austria. 2014, URL http./Avwwil-proJectorg/.
17. Welgt H.U., Kwok WM, Rehmert G.C et aL Voltagedependent effects of volatile anestheUcson cardiac sodium current. Anesth. 1997, vol. 84. pp. 285-293.
18. Wtt X., Lu Y., Dong Y. et al. The Inhalation anestheUc Isollurane increases levels of proinflammatory TNF-o, IL-6, and IL-ip. Neurobfoi A&n$. 2012, voL 33, pp. 1364-1378.
19. Wulf H., Ledowskl T., Llnstedt U et al. Neuromuscular blocking effects of rocuro-nlum during desflurane, lsoflurane, and sevollurane anaesthesia. Can. J. Anaesth. 1998. vol. 45. pp. 526-532.
20. Yc-ungC.J., Apfelbaum J.L. InhalaUonal anesthetics; desflurane and sevollurane. /. Clinic. Anesth. 1995, voL 7, pp. S64-577.
