CC BY
92
УДК 615.9:577.1
Л.Б. Маснавиева, И.В. Кудаева
ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СТАБИЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ОКСИДА АЗОТА И ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА У КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ПАРОВ МЕТАЛЛИЧЕСКОЙ РТУТИ
АФ-НИИ медицины труда и экологии человека ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (Ангарск)
Исследованы показатели метаболизма оксида азота и глутатиона в крови и ткани головного мозга крыс. Белые беспородные самцы крыс в течение 7 недель по 4 часа в день находились в условиях хронического воздействия паров металлической ртути при. средней концентрации токсиканта в затравочной камере 0,362 мг/м3. Показано, что концентрация нитратов/нитритов в головном, мозге крыс снижается, после завершения ингаляций. Выявлена динамика снижения уровня глутатиона в мозге крыс. Ключевые слова: оксид азота, глутатион, ртуть
CONTENT ALTERATIONS OF STABILE NITROGEN OXIDE METABOLITES AND GLUTATHIONE REDUCED IN RAT IN CHRONIC EXPOSURE TO METALLIC MERCURY VAPOUR
L.B. Masnaviyeva, I.V. Kudayeva
Research Institute of Industrial Medicine and Human Ecology, SC ME, ESSC of RAMS, Angarsk
The metabolism, indices of nitrogen oxide and glutathione have been studied, in the rat blood and brain tissues. Albino non-breeded rats (males) were chronically exposed, to metallic mercury vapour for 7 weeks (4 hours every day) with, an average toxicant concentration, in the priming chamber 0.362 mg/m3. Nitrate/nitrite concentrations in the rat brain were shown to decrease after stopping the inhalation exposures. The dynamics of glutathione level decrease has been revealed, in the rat brain.
Key words: nitrogen oxide, glutathione, mercury
Механизм токсикофармакологического действия тяжелых металлов, в том числе ртути, поступающих в организм в избытке, заключается в инактивации белков, прежде всего ферментов, путем их необратимой денатурации в результате блокады металлом активных групп пептидной цепи, при этом происходит разрыв связей и разрушение нативной структуры белковой молекулы [6]. На фоне действия ртути и ее солей в концентрациях, вызывающих токсикофармакологический эффект, выявляются патологические сдвиги со стороны нервной и сердечно-сосудистой систем, изменяются функции желез внутренней секреции, снижается иммунологическая реактивность организма [5]. При поступлении в кровь ртуть некоторое время циркулирует в неизменном состоянии, затем образует комплексы с белками, которые депонируются в тканях, богатых липидами [3, 5]. Накопление этого металла в ткани головного мозга объясняет органические поражения при ртутной интоксикации, которые проявляются спустя несколько лет [3].
Рядом авторов установлено, что в патогенезе острых отравлений ртутью определенную роль играет активация процессов оксидативного стресса [7, 11]. Что касается патогенеза развития отдаленных последствий хронического воздействия ртути, в этом вопросе отсутствует однозначный ответ об участии процессов окислительного стресса в формировании патологии ЦНС.
В связи с этим целью нашей работы явилось изучение показателей метаболизма оксида азота
и глутатиона в крови и ткани головного мозга крыс в отдаленный период времени после хронического воздействия паров металлической ртути.
МЕТОДИКА
Экспериментальные исследования проведены на беспородных крысах-самцах массой 200 — 250 г в количестве 31 особи. Животные содержались в условиях вивария при естественном световом режиме дня, комнатной температуре, свободном доступе к воде и пище (в соответствии с приложениями 2-4 к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977).
Моделирование хронического воздействия парами металлической ртути выполняли на 15 животных в герметичной затравочной камере (токсикологический эксперимент выполнен к.м.н. Г.Д. Хо-муевым под руководством зав. лабораторией токсикологии АФ-НИИ МТ и ЭЧ д.м.н. Л.М. Соседо-вой). Контрольную группу составили 16 интактных крыс-самцов, обследованных в те же сроки, что и животные опытной группы.
Материал для биохимических исследований забирали по окончании экспозиции парами ртути (на 3-12 день) и через 9 недель после воздействия токсиканта. Животных умерщвляли декапитаци-ей. В эксперименте использовали цельную кровь, передний и средний отделы головного мозга крыс.
Определение суммарного количества стабильных метаболитов оксида азота (N0) — нитрита и нитрата (N0^ — осуществляли в сыворотке крови и гомогенате мозга с использованием реактива
Грисса, предварительно восстанавливая нитрат до нитрита металлическим кадмием в присутствии цинка [2]. В качестве стандарта использовали нитрит натрия. Содержание восстановленного глутатиона (ВГ) в эритроцитах и гомогенате ткани мозга определяли по методу, предложенному J. Sedlak, R.H. Lindsay [11].
Полученные данные обрабатывали при помощи пакета статистических программ «Statistica» с использованием однофакторного дисперсионного анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенных исследований выявлено, что хроническое воздействие парами металлической ртути не вызвало достоверных изменений (р = 0,48) содержания ВГ в эритроцитах крыс опытной группы по сравнению с контрольной (табл. 1). Дальнейшая динамика исследования изучаемого показателя в крови в отдаленные сроки после воздействия парами ртути не выявила статистически значимой межгрупповой разницы.
Характеризуя уровень глутатиона в гомогенате головного мозга крыс, подвергшихся хроническому воздействию металлической ртути, следует отметить отсутствие достоверной разницы в содержании ВГ в сравнении с контрольными значениями как после
окончания ингаляций (р = 0,48), так и спустя 2,5 месяца после токсического воздействия (р = 0,39).
Несмотря на отсутствие межгрупповых различий, обращает на себя внимание факт снижения уровня ВГ в гомогенате головного мозга крыс опытной группы с 1,71 ± 0,05 мкМ/г ткани в первый срок обследования до 1,51 ± 0,06 мкМ/г ткани, зарегистрированный в отдаленный период после хронического воздействия паров металлической ртути (р = 0,02) (табл. 2). Снижение содержания восстановленного глутатиона в мозге крыс контрольной группы за этот период времени не носило достоверного характера (р = 0,42).
Исследование в динамике содержания стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови животных опытной группы не выявило статистически значимых различий по сравнению с показателями контрольных животных в первый срок обследования (р = 0,16) и в отдаленный период после воздействия металлической ртути (р = 0,32) (табл. 2).
Обращает на себя внимание факт снижения суммарного количества метаболитов оксида азота в гомогенате головного мозга животных опытной группы (табл. 3). После окончания ингаляций общее содержание нитритов и нитратов в ткани переднего и среднего мозга составило 51,89 ± 3,46 мкМ/г ткани, что на 30 % ниже по сравнению с аналогичными по-
Таблица 1
Содержание глутатиона восстановленного в ткани мозга и эритроцитах крыс после хронического ингаляционного воздействия парами металлической ртути (М ± m)
Показатели Сроки исследований Контроль Опыт P
ВГ в эритроцитах (мкМ/мл крови) После окончания ингаляций W і G,G5 (n = У) 1,GG і G,G9 (n = У) G,4B
Через 9 недель после ингаляций 1,GB і G,GB (n = У) G^ і G,GB (n = B) G,34
ВГ в ткани мозга (мкМ/г ткани) После окончания ингаляций 1,64 і G,GB (n = B) 171 і G,G5 (n = У) G,4B
Через 9 недель после ингаляций 1,5У і G,G4 (n = B) 1,51 і G,G6 (n = B) G,39
Таблица 2
Динамика изменений содержания глутатиона восстановленного и оксида азота при хроническом воздействии парами металлической ртути на крыс (М ± m)
Показатели Сроки исследований P
После окончания ингаляций Через S недель после ингаляций
ВГ в эритроцитах (мкМ/мл) 1 ,GG і G,G9 (n = У) G^ і G,GB (n = B) G79
ВГ (мкМ/г ткани) 171 і G,G5 (n = У) 1,51 і G,G6 (n = B) G,G2
Ыох в сыворотке (мкМ/мл) 24,63 і 1,26 (n = 6) 2B,3B і 4,B3 (n = 6) G,53
Ыох в ткани мозга (мкМ/г ткани) 51 ,B9 і 3,46 (n = 6) 6G,63 і 3,53 (n = 6) G,11
Таблица 3
Содержание суммарного количества стабильных метаболитов оксида азота в ткани мозга и эритроцитах крыс после хронического ингаляционного воздействия парами металлической ртути (М ± m)
Показатели Сроки исследований Контроль Опыт P
Nox в ткани мозга (мкМ/г ткани) После окончания ингаляций 6У3 і 4,94 (n = У) 51,B9 і 3,46 (n = 6) G,G3
Через 9 недель после ингаляций У1,6 і 4,62 (n = 6) 6G,63 і 3,53 (n = У) G,GB
Nox в сыворотке (мкМ/мл) После окончания ингаляций 2B,B5 і 2,25 (n = B) 24,63 і 1,26 (n = 6) G,16
Через 9 недель после ингаляций 35,B2 і 5,3B (n = B) 2B,3B і 4,B3 (n = B) G,32
98
Экcпepиraeнтaльныe иccлeдoвaния в мєднцннє н ánoaonin
казателями контрольной группы (р = 0,03). Через 2,5 месяца наблюдения уровень НОх в ткани головного мозга крыс опытной группы оставался ниже контрольных значений на 18%, однако выявленная разница не являлась статистически значимой (р = 0,08).
Обсуждая полученные результаты, следует остановиться на следующих моментах. Одной из мишеней для молекул ртути на молекулярном уровне являются сульфгидрильные группировки различных белковых молекул и соединений пептидной природы. Именно эти группы белков особенно легко окисляются активными формами кислорода, образующимися, в том числе, в результате разобщения процессов дыхания и фосфорилирования в результате торможения транспорта электронов в митохондриях молекулами ртути. Этот вид модификации является, как правило, обратимым, и его обращение зависит от энергетического потенциала клетки и наличия в ней восстановленных форм глутатиона, цистеина и других 8И-содержащих соединений, относящихся к группе низкомолекулярных антиоксидантов [1]. Учитывая этот факт, можно предположить, что к моменту окончания ингаляторных воздействий парами ртути на животных произошло восстановление концентрации восстановленного глутатиона в различных органах, что подтверждается отсутствием изменений изучаемого показателя как в сыворотке крови, так и в гомогенате головного мозга. Снижение уровня ВГ в переднем и среднем отделах мозга в отдаленный период после воздействия ртутью может характеризовать начало декомпенсации функционирования антиоксидантой системы, обусловленной возрастными изменениями в ЦНС, усугубляющихся действием кумулированной в организме ртути. Известно, что восстановленный глутатион используется для восстановления пероксидов полиненасыщен-ных липидов в молекулы соответствующих спиртов при участии глутатион-зависимых антиоксидант-ных ферментов — глутатионпероксидазы и глута-тионтрансферазы — а также в реакции восстановления Н2О2 в молекулу воды.
В литературе показано, что модификация 8И-групп NMDA-рецепторов приводит к подавлению их функции [10], одной из которых является открывание каналов, проницаемых для входящего тока кальция. Следствием недостаточного поступления кальция внутрь клетки может быть снижение активности кальций-зависимой NO-синтазы [9], в результате чего может снижаться и уровень N0, регистрируемый по его метаболитам. Косвенным подтверждением возможности задействования подобного механизма с участием NMDA-рецепторов может служить факт снижения уровня стабильных метаболитов N0 в ткани мозга и отсутствие аналогичных изменений в сыворотке крови. Следует отметить, что оксид азота в головном мозге нарабатывается преимущественно нейрональной N0-синтазой, а N0, регистрируемый в
сыворотке крови, является в основном продуктом синтеза эндотелиальной синтазы. Исследователями отмечено, что в ЦНС роль оксида азота не ограничивается регуляцией мозгового кровотока. NO является нейрональным мессенджером, а также играет важную роль в процессах моделирования секреции основных гипофизарных гормонов: пролактина, окситоцина, вазопрессина и др. [1]. Следовательно, сниженный уровень оксида азота может приводить к повышению тонуса сосудов мозга, нарушению свертываемости крови и ряду других патологических процессов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Болдырев А.А. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности нейрона / А.А. Болдырев // Успехи физиологических наук. — 2003. — Т. 34. - № 3. - С. 21-34.
2. Голиков П.П. Метод определения нитрита/ нитрата (NOx^ сыворотке крови / П.П. Голиков, Н.Ю. Николаева // Биомедицинская химия. — 2004. - № 1. - С. 79-85.
3. О распределении ртути и серебра в организме / Г.Н. Красовский, О.И. Юрасова, О.Г. Чарыев и др. // Гигиена и санитария. - 1980. - № 1. -С. 69-71.
4. Проблемы, связанные с загрязнением ртутью объектов окружающей среды / Н.В. Ефимова, П.В. Коваль, В.С. Рукавишников и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2005. - № 1. -С. 127-133.
5. Профессиональные болезни // Под ред. Е.М. Тареева, А.А. Безродных - М.: Медицина, 1976. - 408 с.
6. Руководство по профессиональным заболеваниям // Под ред. Н.Ф. Измерова. - М.: Медицина, 1983. - 320 с.
7. Трахтенберг И.М. Современные представления о воздействии ртути на клеточные мембраны / И.М. Трахтенберг, Л.А. Иванова // Гигиена и санитария. - 1984. - № 5. - С. 59-63.
8. Aizenman E. Modulation of N-methyl-D-aspartate receptors by hydroxyl radicals in rat cortical neurons in vitro / E. Aizenman // Neuroscien. Lett. - 1995. - N 189. - P. 57-59.
9. Monitoring intracellular nitric oxid formation by dichlorofluorescin in neuronal cells / P.G. Gunarsekar, A.G. Kantahasamy, J.L. Borowitz et al. // J. Neurochem. - 1995. - Vol. 65. - P. 2016-2021.
10. Protective effects of tea melanine against 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced toxicity: antioxidant activity and aryl hydrocarbon receptor suppressive effect / Y.C. Hung, G.S. Huang, V.M. Sava et а! // Biol. Pharm. Bull. - 2006. -Vol. 29. - N. 11. - P. 2284-2291.
11. Sedlak J. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent / J. Sedlak, R.H. Lindsay // Analyt. Biochem. - 1968. - Vol. 25. - P. 192-205.
Поступила в редакцию 17.10.2006 г
