Изменения окислительных процессов в ткани головного мозга и крови крыс в раннем онтогенезе Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Биология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2009, № 6 (1), с. 124-131

УДК 57.017.645

ИЗМЕНЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И КРОВИ КРЫС В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ

© 2009 г. Ю.В. Никитина, И.В. Мухина

Нижегородская государственная медицинская академия [email protected]

Поступила в редакцию 22.04.2009

Выявлено повышение интенсивности свободнорадикальных процессов у крыс 1.5-2-х и 4-х месяцев. Показано увеличение карбонильных производных в предпубертатном периоде в плазме крови крыс. Установлена зависимость протекания анаэробных и аэробных процессов в головном мозге и в крови крыс от возраста. Показано, что во второй половине предпубертатного периода наблюдалась активация анаэробных процессов.

Ключевые слова: возрастная физиология, перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, углеводный обмен.

Введение

Возрастная физиология - наука о закономерностях и особенностях жизнедеятельности организма на ранних этапах онтогенеза.

Возраст оказывает существенное влияние на уровень предельных возможностей функциональных систем организма. Некоторые свойства организма на определенных этапах своего формирования особенно зависимы от внешних воздействий. В периоды интенсивного развития важно знать, как действуют на организм различные факторы риска.

Пубертатный период - начало полового созревания - характеризуется резким повышением активности центрального звена эндокринной системы (гиппоталамуса), что приводит к изменению взаимодействия подкорковых структур и коры больших полушарий, результатом чего является значительное снижение эффективности центральных регуляторных механизмов, в том числе определяющих саморегуляцию [1].

Процессы биологического окисления занимают центральное место в метаболизме клеток. Они служат источником главной массы энергии, необходимой для их жизнедеятельности, готовят строительный материал для создания и обновления клеточных структур, принимают непосредственное участие в самом построении этих структур, включаются в широкий круг реакций, связанных с метаболическими превращениями чужеродных соединений.

До последнего времени остаются недостаточно изученными, противоречивыми и неоднозначными данные литературы о динамике воз-

растных изменений окислительных процессов в различных тканях [2-4].

Цель нашего исследования - изучение окисления липидов, белков и углеводов в ткани головного мозга и крови крыс разного возраста.

Экспериментальная часть

Исследования проводились на крысятах разных возрастных групп подсосного (масса крысят 11-35 г), инфантильного (30-110 г), ювенильного (90-270 г) возрастов в сравнении с половозрелыми животными. Крысята рождались в виварии НИИ ПФМ НижГМА. Срок рождения строго фиксировался. Крысят первой возрастной группы содержали вместе с матерью, помет состоял из 10-13 особей. Крысят второй возрастной группы содержали отдельно от самки. Этих животных, как и половозрелых, содержали в стандартных условиях и на стандартной диете. Крыс не подвергали никаким воздействиям. При декапитации использовали наркоз - внутрибрюшинное введение нембутала (35 мг/кг веса). Забой животных проводили летом в утренние часы.

В эксперименте использовали 10 групп животных, возраст которых составил 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 8, 9 месяцев. Материалом для биохимических исследований были кровь, плазма крови, гомогенаты головного мозга интактных беспородных крыс.

В основу возрастной периодизации онтогенеза крыс была взята табл. 1 Т.А. Гуськовой [5] и И.П. Западнюка [6].

Исследовали интенсивность свободнорадикальных процессов методом индуцированной хемилюминесценции (I max, оАОА), перекис-ную резистентность эритроцитов (I тахэр, оАОАэр) (Кузьмина и др., 1983). Определяли уровень диеновых (ДК), триеновых конъюгатов (ТК), общее количество двойных связей (дв. св.) (D.L. Fletcher, C.J. Dillared, A.Y. Tappel, 1973), малонового диальдегида (МДА) (Smith et al., 1976; Орехович, 1977), активность антиокси-дантных ферментов: супероксид дисмутазы

(СОД) (М. Nischikimi, 1972) и каталазы по методу Н. Aebi (1970). Проводили определение окислительной модификации белков по методу Левина (1990) в модификации Е.Е. Дубининой (1995), количества лактата и пирувата (В .А. Асатиани, 1969; П.А. Кочетов, 1980).

Полученные данные были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных

Периоды

программ Statistica-6.0 (Windows XP) и Microsoft Excel. Для статистической оценки межгруппо-вых различий медиан применяли критерий Краскела - Уоллиса. При р < 0.05 делали вывод о том, что группы получены из разных генеральных совокупностей или генеральных совокупностей с разными медианами. В этом случае проводили парное сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна-Уитни.

Распределение значений в группах на диаграммах представляли в виде М±т, где М -среднее значение в группе, m - стандартное отклонение от среднего значения.

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о сложной многофазной динамике окислительных

Таблица 1

13НИ крыс

Периоды жизни крыс Возраст

Периоды молочного кормления: Новорожденный (ранний молочный) 1-5 суток Подсосный (средний молочный) 6-21 суток

Периоды полового созревания:

Неполовозрелый Инфантильный (поздний молочный) 22-50 суток Возраст предслучный (ювенильный)

Предпубертатный I 2-2.5 мес. Предпубертатный II Пубертатный 3-3.5 мес. 4 мес.

Период репродуктивный Половозрелый > 5 мес.

Период выраженных старческих изменений Предстарческий и старческий > 19 мес.

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 8

Возраст крыс (мес.) i 11 max • ОАОА

Рис. 1. Динамика максимальной интенсивности I max хемилюминесценции и общей антиоксидантной активности (ОАОА) в гомогенатах головного мозга крыс разного возраста. Значения критерия Манна - Уитни (р) при парном сравнении показаний, полученных в группах, по I max: * - с группой 3.5 мес., ** - с группой 4 мес., по оАОА: # -с группой 3.5 мес., ## - с группой 4 мес.

процессов в головном мозге и крови крыс разного возраста.

Выявлено повышение интенсивности свободнорадикальных процессов в головном мозге животных в возрасте 1.5-2 мес. и в 3.5-4 мес. периода полового созревания (рис. 1).

В ткани головного мозга крыс в возрасте 1.52 мес. и 3.5-4 мес. выявлено повышение показателя максимальной интенсивности хемилюми-несценции (I max).

Наименьшие значения общей антиоксидант-ной активности (рис. 1), активности каталазы (рис. 2) были получены в гомогенатах мозга крыс возрастом 1.5-2 и 3.5-4 мес.

Aнализ полученных значений молекулярных продуктов перекисного окисления липидов и активности супероксиддисмутазы (СОД) в гомогенатах головного мозга крыс выявил сходные тенденции в динамике, но статистически значимых отличий не обнаружено. Значения критерия Краскела - Уоллиса при множественном сравнении показателей исследуемых воз-

растных групп представлены в табл. 2 - для го-могенатов головного мозга, в табл. 3 - для крови животных.

При анализе результатов перекисного окисления липидов в крови крыс был выявлен сходный характер изменений с полученными данными в гомогенатах головного мозга. На фоне увеличения свободнорадикальных и молекулярных продуктов перекислого окисления липидов (ПОЛ) в возрасте 1.5-2 мес. и 4 мес. отмечено снижение общей антиоксидантной активности, активности СОД и каталазы (рис. 3, табл. 3).

Кровь является основной внутренней средой организма, в которую поступают как вещества из внешней среды, так и продукты обмена клеток и тканей. Изучая количественные показатели крови, можно получить ценные данные об особенностях, в том числе и возрастных, обменных процессов в организме [7].

Таким образом, у крыс в конце периода молочного кормления и в конце периода полового

Таблща 2

Значения критерия Краскела - Уоллиса (р), полученные при статистическом анализе результатов показателей свободнорадикального окисления и углеводного обмена гомогенатов мозга крыс разных возрастных групп

Исследуемый показатель Значения критерия Краскела -Уоллиса Исследуемый показатель Значения критерия Краскела - Уоллиса

I max 0.028 OAOA 0.028

ДК 0.132 СОД 0.354

ТК 0.165 каталаза 0.043

Дв. св. 0.590 лактат 0.243

МДД 0.243 пируват 0.075

0,8

0,7

0,6

0,5

с,4

0,3

0,2

0,1

0,5

1,5

2 2,5 3

Возраст крыс (мес.)

3,5

0

Рис. 2. Изменение активности каталазы в гомогенатах головного мозга крыс разного возраста. Значения критерия Манна - Уитни при парном сравнении значений активности каталазы крыс с группой 3.5 месяца

созревания выявлено напряжение антиокси-дантной системы на фоне увеличения интенсивности свободнорадикальных процессов.

В настоящее время разработаны методы оценки спонтанного окисления белка, которое характеризует общее физиологическое состояние организма, и металл-катализиро-ванного, которое характеризует степень резервно-адаптационных возможностей организма [8]. Измерения значений карбонильных производных окислительной модификации белков плазмы крови проводили на спектрофотометре (СФ) при длине волны X = 270 нм

- альдегид-динитрофенилгидразоны (АДНФГ)

и при X = 363 нм - кетон-динитрофенил-гидразоны (КДНФГ). Измерения проводили при спонтанном окислении белка и индуцированном по реакции Фентона (АДНФГинд., КДНФГинд). Определение общего количества белка (ОБ) в пробе проводили биуретовым методом [9].

Наши эксперименты показали сходную динамику изменений значений АДНФГ и КДНФГ, полученных при спонтанном и металл-катали-зируемом окислении белков плазмы крови крыс раннего возраста (рис. 4, 5).

Период молочного кормления животных (0.5-1 мес.), предпубертатный период I

Таблица 3

Значения критерия Краскела - Уоллиса (р), полученные при статистическом анализе результатов показателей свободнорадикального окисления и углеводного обмена крови крыс разных возрастных групп

Исследуемый показатель Значения критерия Краскела -Уоллиса Исследуемый показатель Значения критерия Краскела - Уоллиса

I max 0.001 ОAОA 0.019

ОЛ 0.005 СОД 0.000

ДК 0.002 каталаза 0.005

ТК 0.002 ОБ 0.61

Дв. св. 0,002 AДНФГ 0.36

MДA 0.044 КДНФГ 0.42

I max3D 0.018 AДНФГИЯ„. 0,22

ОAОA,I, 0.000 КДНФГйт 0,30

Пируват 0.0004 AДНФГ/ AДНФГЙЯ„ 0.410

Лактат 0.019 КДНФГ/ КДНФГ „„„ 0.148

Лактат/пируват 0.044

Возраст крыс (мес.) і і I max ♦ ОАОА

Рис. 3. Динамика максимальной интенсивности хемилюминесценции и общей антиоксидантной активности в плазме крови крыс разного возраста. Значения критерия Манна - Уитни при парном сравнении показаний, полученных в группах, по I max: * - с группой 1.5 мес., ** - с группой 2 мес., & - с группой 4 мес.; по ОАОА: # - с группой 1.5 мес., ## - с группой 2 мес., $ - с группой 4 мес.

1600

14GG

1200

1GGG

и

§ 800

е 600 я

4GG

2GG

0,5

2,5

Возраст крыс (мес.)

3,5

4

8

■АДНФГ п КДНФГ

Рис. 4. Количество альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов в плазме крови крыс разных возрастных групп (р - значение критерия Манна - Уитни при парном сравнении групп с группой 3.5 мес.)

G

1

18GG

1600

14GG

12GG

1GGG

6 8GG

5

и

©

К

5

6GG

4GG

2GG

G,5

2,5 3,5

Возраст крыс (мес.)

48 ° ЛДНФГинд. ° КДНФГинд.

Рис. 5. Количество альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов в плазме крови при индуцированном окислении белка (р - значения критерия Манна - Уитни при парном сравнении групп с группой 3.5 мес.)

G

1

(2.5 мес.) и репродуктивный период (В мес.) можно охарактеризовать более низкими значениями количества карбонильных производных спонтанного и индуцированного окисления белков по сравнению со значениями, полученными для групп 3.5 мес. (предпубертатный период II) и 4 мес. (пубертатный период полового созревания). Таким образом, можно говорить о напряжении процессов окислительной деструкции белков в плазме крови у крыс в конце периода полового созревания.

Интересные данные можно получить, если рассчитать процентное соотношение количества карнильных производных белков при спонтанном и металл-катализируемом окислении. Полученную величину АДНФГинд. (или КДНФГинд.) примем за 100%, т.е. за максимально возможное значение для данной возрастной группы. Рассчитаем процентное соотношение для АДНФГ (или КДНФГ). График зависимости полученных значений от возраста представлен на рис. 6.

Возраст крыс (мес.) □КДНФГ □ КДНФГивд.=1°0%

Рис. 6. Отношение значений кетон-динитрофенилгидразонов, полученных при спонтанном окислении, к значениям, полученным при индуцированном окислении белка

Как видно на рис. 6, происходит постепенное увеличение этого соотношения от 0.5 мес. (период молочного кормления) к 4 мес. (пубертатный период полового созревания). Процентное соотношение КДНФГ/КДНФГинд. в группе 4 мес. достигло своей максимальной величины 77.47%. Таким образом, полученная зависимость отражает постепенное увеличение содержания карбонильных производных в крови, а значит напряжение резервно-адаптационных возможностей по мере приближения организма к репродуктивному периоду.

Выявленное нами повышение интенсивности окислительной модификации белков плазмы крови крыс пубертатного периода отражает общую направленность свободно-радикальных процессов во всем организме, в том числе и в мозговой ткани.

Направленность протекания анаэробных и аэробных процессов в головном мозге и в крови крыс, определенных по содержанию лактата и пирувата, является сходной (рис. 7, 8). Показано увеличение доли анаэробных процессов утилизации глюкозы в головном мозге и крови во второй половине предпубертатного периода. В головном мозге увеличение содержания пиру-вата и лактата коррелирует с периодом формирования гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)

- 2.5 мес.

В период молочного кормления скорость поглощения глюкозы, кетоновых тел и свободных жирных кислот очень велика. По мере развития головного мозга диаметр отверстий эндотелия уменьшается и поэтому уже с возраста 2 мес. в

головной мозг способны проникать только молекулы глюкозы. В результате в головном мозге оказывается большое количество «незаменимого субстрата», вследствие чего большинство энергетических процессов идет по пути окисления глюкозы, о чем свидетельствует увеличение пирувата в головном мозге в возрасте 2.5 мес.

Увеличение продукции свободных радикалов в период полового созревания может быть обусловлено повышением энергозатрат и, в связи с этим, усилением гликолитических процессов. В этом случае, несмотря на достаточный ресурс питательных веществ, наблюдается все большее напряжение механизмов поддержания клеточного гомеостаза из-за образования молочной кислоты. Накопление лактата приводит к снижению ^Н ткани, развитию метаболического ацидоза, что, в свою очередь, активирует митохондрии. Возможно, что в результате повышения энергопродукции, требующего дополнительного потребления кислорода, происходит развитие кислородной задолженности в тканях и функциональной гипоксии. Для того чтобы компенсировать нехватку энергии при постоянно возрастающих потребностях организма в условиях гипоксии, увеличивается доля анаэробных процессов. Биологический смысл этого явления состоит в том, что в процессе клеточной дифференцировки образуются новые структуры, новые белки и другие крупные молекулы, которые раньше клетка производить не умела. Как и любое новое дело, это требует особых энергетических затрат, тогда как ростовые процессы - это налаженное «се-

Рис. 7. Возрастная зависимость отношения лактата к пирувату в гомогенатах головного мозга крыс: р* - значение критерия Манна - Уитни при парном сравнении с группой возрастом 1 мес., р** - с группой 1.5 мес.

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Возраст крыс (мес.)

Рис. 8. Возрастная зависимость отношения лактата к пирувату в крови (р - значения критерия Манна - Уитни при парном сравнении групп с группой возрастом 1.5 мес.)

рийное производство» белковых и иных макромолекул в клетке.

Заключение

Таким образом, в период полового созревания выявлено увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов на фоне снижения антиоксидантной активности, увели-

чение кар-бонильных производных белков в крови, накопление лактата в ткани головного мозга и крови крыс по сравнению с периодом молочного кормления.

Список литературы

1. Безруких М.М., Сонькин В.Д., Фарбер Д.А. Возрастная физиология (физиология развития ребен-

ка): Учебн. пособие. М.: Издательский центр «Академия», 2008. 416 с.

2. Cini M., Moretti A. Studies on lipid peroxidation and protein oxidation in the aging brain // Neurobiol Aging. 1995. V. 16. N. 1. P. 53-57.

3. Анисимов В.Н., Арутюнян А.В., Опарина Т.И. Возрастные изменения активности свободнорадикальных процессов в тканях и сыворотке крови крыс // Росс. физиол. журн. 1999. Вып. 85. № 4. С. 502507.

4. Mecocci P., Fano G., Fulle S. Age-dependent increases in oxidative damage to DNA, lipids, and proteins in human skeletal muscle // Free Radical Biol. Med. 1999. V. 26. Р. 303-308.

5. Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств. М.: Изд-во «Русский врач». 2003. 154 с.

6. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Киев: Наукова думка, 1974. С. 23-24.

7. Лопатина Н.И., Соловьев А.Л. Возрастная биохимия. Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1978. 45 с.

8. Губский Ю.И. и др. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях. Проблемная статья [Электронный ресурс]. Режим доступа: http:// www.medved.kiev.ua/arhiv_mg/st_2005/05_3_2.htm.

9. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительные модификации белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии. 1995. 41. № 1. С. 24-26.

AGE-RELATED CHANGES OF OXIDIZING PROCESSES IN CEREBRAL TISSUE AND BLOOD OF RATS

Yu.V. Nikitina, I.V. Mukhina

An increased intensity of free-radical processes in 1.5-2 and 4 month-old rats has been revealed. An increase in carbonyl derivatives in blood plasma of rats in the prepubertal period has been also observed. Age dependence of anaerobic and aerobic processes in brain and blood of rats has been established. It has been shown that anaerobic processes are activated in the second half of the rat prepubertal period.

Keywords: developmental physiology, lipid peroxidation, oxidative modification of proteins, carbohydrate metabolism.